Спосіб визначення концентрації оксіетильованих поліолів в суспензії еритроцитів після кріоконсервування

Спосіб визначення концентрації оксіетильованих поліолів в суспензії еритроцитів після кріоконсервування, що включає видалення білків та цукрів із суспензії та її дослідження із застосуванням оптичного методу, який відрізняється тим, що суспензію еритроцитів розділяють на еритромасу та надосад, а після видалення з них білків і цукрів методом рефрактометрії визначають показники заломлення еритромаси і надосаду, на основі яких розраховують концентрацію оксіетильованих поліолів в суспензії. (19) (21) u201003723 (22) 31.03.2010 (24) 10.09.2010 (46) 10.09.2010, Бюл.№ 17, 2010 р. (72) НІКОЛЕНКО ОЛЕКСАНДРА ВІКТОРІВНА, ЧЕКАНОВА ВАЛЕНТИНА ВОЛОДИМИРІВНА, КОМПАНІЄЦЬ АНТОНІНА МИХАЙЛІВНА, КАЛАШНИКОВА СВІТЛАНА ВІКТОРІВНА, ФІЛАТОВ ДМИТРО ЮРІЙОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 Будують калібрований графік по стандартним розчинам поліетиленоксиду (ПЕО) різної концентрації і на основі отриманих значень оптичної густини екстракту по каліброваному графіку визначають концентрацію ПЕО в суспензії еритроцитів. Недоліки способу: - неможливість визначення високих концентрацій кріопротекторів; - низька відтворюваність результатів через відсутність прямолінійної залежності оптичної густини від концентрації; - тривалість процесу визначення концентрації (8 годин), яка пов'язана з необхідністю перекристалізації пікринової кислоти, а також складністю розчинення комплексоутворюючого пікратнатрієвого реагенту. В основу корисної моделі поставлена задача створення такого способу визначення концентрації оксіетильованих поліолів в суспензії еритроцитів після кріоконсервування, в якому би, за рахунок використання іншого оптичного показника, забезпечувалась можливість розширити інтервал концентрацій, що визначаються, підвищити відтворюваність одержуваних результатів і скоротити тривалість процесу. Ця задача вирішується тим, що у способі визначення концентрації оксіетильованих поліолів в суспензії еритроцитів після кріоконсервування, що включає видалення білків та цукрів із суспензії і ії дослідження із застосуванням оптичного методу, згідно з корисною моделлю, суспензію еритроцитів розділяють на еритромасу та надосад, а після видалення з них білків і цукрів методом рефрактометрії визначають показники заломлення еритромаси і надосаду, на основі яких розраховують концентрацію оксіетильованих поліолів в суспензії. Визначення показників заломлення у надосаді і еритромасі дає можливість розширити інтервали концентрацій до 80 % і підвищити відтворюваність отриманих результатів до 95 %. При цьому виключається необхідність використання комплексоутворюючого пікрат-натрієвого реагенту, що дозволяє скоротити тривалість процесу до 5 годин. Спосіб здійснюють таким чином. Суспензію еритроцитів, яка містить розчин оксіетильованого поліолу, після кріоконсервування розділяють шляхом центрифугування на еритромасу та надосад і визволяють від білків, послідовно додаючи до еритромаси та надосаду 10 % розчину хлориду барію, 2,5 % розчину гідрат оксиду барію та 5 % розчину сірчанокислого цинку. Після центрифугування з одержаного центрифугату видаляють цукри. Для цього додають 25 % розчину гідрату кальцію та 20 % меді сірчаної і знов центрифугують. В отриманому супернатанті за значеннями показників заломлення методом рефрактометрії [4] визначають концентрацію оксіетильованих поліолів. Супернатанти, одержані зі зразків еритромаси та надосаду, по черзі наносять на призму рефрактометра і визначають показник заломлення. За результатами вимірювання показників заломлення спеціально приготовлених розчинів оксіетильованих поліолів (еталонів) різної концентрації будують калібровані графіки (Фіг.1-3). Після визначення показників заломлення еталонних розчинів, за 52876 4 графіком розраховують фактор, який дорівнює величині приросту показника заломлення при збільшені концентрації на 1 %. Далі визначають вміст оксіетильованих поліолів із застосуванням формули: nd no x F де nd - показник заломлення розчину поліола, no - показник заломлення води при 20 °С, F - фактор, який дорівнює величині приросту показника заломлення при збільшені концентрації на 1 %. Приклад 1. Визначали концентрацію оксіетильованого гліцерину n=30 в суспензії еритроцитів після кріоконсервування. Суспензію еритроцитів з 15 % кінцевою концентрацією оксіетильованого гліцерину n=30 після кріоконсервування, шляхом центрифугування, розділяли на еритромасу та надосад і визволяли від білків, послідовно додаючи до еритромаси та надосаду 1 мл 10 % розчину хлориду барію, 2мл 2,5 % розчину гідрат оксиду барію та 2мл 5 % розчину сірчанокислого цинку. Після центрифугування з одержаних центрифугатів видаляли цукри. Для цього додавали 2 мл 20 % гідрату кальцію та 2 мл 20 % меді сірчаної і знов центрифугували. В отриманих з еритромаси і надосаду супернатантах визначали концентрацію оксіетильованого гліцерину n=30 за значеннями показників заломлення методом рефрактометрії. Супернатанти по черзі наносили на призму рефрактометра і визначали показник заломлення. За результатами вимірювання показників заломлення спеціально приготовлених розчинів оксіетильованого гліцерину n=30 (еталонів) різної концентрації був побудований калібрований графік (Фіг.1). Після визначення показників заломлення еталоних розчинів, за графіком розраховували фактор, який дорівнює величині приросту показника заломлення при збільшенні концентрації на 1 %. Вміст оксіетильованого гліцерину n=30 розраховували по формулі: y 13327 , x , 0,0014 де x - концентрація розчину ОЕГ n=30, y - значення показника заломлення супернатанту при 20 °С, 0,0014 - фактор розраховується по каліброваному графіку (Фіг.1). Значення показників заломлення супернатанту для еритромаси nd - 1,3360, nd надосаду -1,3436. Відповідно, концентрація ОЕГ=30 становила в еритромасі 2,36 %, надосаді - 8,50 %. 13360 13327 , , 2,36 % , В еритромасі x 0,0014 13436 13327 , , 7,79 % . надосаді x 0,0014 Таким чином встановлено, що загальна концентрація ОЕГ n=30 становить 10,15 % для суспензії еритроцитів, що містить 15 % ОЕГ n=30. Приклад 2. В суспензії еритроцитів з 10 % кінцевою концентрацією оксіетильованого гліцерину 5 n=25 після кріоконсервування подібно Прикладу 1 визначали концентрацію ОЕГ=25 за значеннями показників заломлення. Визначені показники заломлення супернатантів для еритромаси nd 1,3370, надосаду nd - 1,3390. Концентрацію розраховували по формулі: 1,3325 x y , де 0,0012 х- концентрація розчину ОЕГ n=25, у - значення показника заломлення супернатанту при 20 °С, 0,0012 - фактор розраховується по каліброваному графіку (Фіг.2). 13370 13325 , , 3,755 % , В еритромасі x 0,0012 13390 13325 , , 5,41% . в надосаді x 0,0012 Таким чином, встановлено, що загальна концентрація ОЕГ=25 становить 9,16 % для суспензії еритроцитів, що містить 10 % ОЕГ=25. Приклад 3. В суспензії еритроцитів з 10 % кінцевою концентрацією оксіетильованого метилцелозольва n=33-35 після кріоконсервування подібно Прикладу 1 визначали концентрацію ОЕМц n=3335 за значеннями показників заломлення. Визначені показники заломлення супернатантів для еритромаси nd - 1,3369, надосаду nd - 1,3378. Концентрацію ОЕМц розраховували по формулі: 52876 6 y 13327 , , де 0,0014 х - концентрація розчину ОЕМц, у-значення показника заломлення супернатанта при 20 °С, 0,0014 - фактор розраховується по каліброваному графіку (Фіг.3). 13369 13317 , , 3,71 % , В еритромасі x 0,0014 13378 13317 , , 4,36 % . надосаді x 0,0014 Таким чином встановлено, що загальна концентрація ОЕМц становить 8,07 % для суспензії еритроцитів, що містить 10 % ОЕМц. Джерела інформації. 1. А.с. 1642342, MКИ G01N24/08,1991. Способ определения перераспределения веществ между внутри- и внеклеточной средой в клеточных суспензиях. 2. Mayrand R.R., Levitt D-G. Urea and ethyleneglycol facilitated transport systems in the human red cell membrane// Y.Gen.Physiol.- 1983.Vol.81.-P.221-237. 3. М.М. Гучок, Л.А. Ханина, М.И. Шраго, Л.З. Элькина. Определение содержания полиэтиленоксида в биологических материалах //Лабораторное дело. -1987.№ 4.-С.202-203. x 7 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 52876 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601