Спосіб виявлення низькомолекулярних інгібіторів біосинтезу нуклеїнових кислот

Спосіб виявлення низькомолекулярних інгібіторів біосинтезу нуклеїнових кислот із застосуванням комбінації модельних ДНК-вмісних ферментативних комплексів, який відрізняється тим, що як тестові системи застосовують реакцію транскрипції з використанням ДНК-залежної РНК-полімерази фагу Т7, полімеразну ланцюгову реакцію з використанням Taq-полімерази та реакцію релаксації суперспіралізованої ДНК топоізомеразою І, при цьому зазначені ферменти безпечні і не потребують радіоактивної чи будь-якої іншої мітки для детектування продукту реакції. (19) (21) u201004064 (22) 07.04.2010 (24) 27.09.2010 (46) 27.09.2010, Бюл.№ 18, 2010 р. (72) ПАЛЬЧИКОВСЬКА ЛАРИСА ГНАТІВНА, АЛЕКСЄЄВА ІННА ВОЛОДИМИРІВНА, ШВЕД АНАТОЛІЙ ДАВИДОВИЧ, РИБАЛКО СВІТЛАНА ЛЕОНТІЇВНА (73) ПАЛЬЧИКОВСЬКА ЛАРИСА ГНАТІВНА, АЛЕКСЄЄВА ІННА ВОЛОДИМИРІВНА, ШВЕД АНАТОЛІЙ ДАВИДОВИЧ, РИБАЛКО СВІТЛАНА ЛЕОНТІЇВНА 3 53193 речовини, її можливу клітинну мішень, механізм дії та більш цілеспрямовано проводити дизайн і синтез ефективних молекулярних структур з бажаними властивостями. Завчасна вибраковка неактивних речовин сприятиме не тільки суттєвому прискоренню, але й здешевленню процедури просування нових хіміопрепаратів на шляху від синтезу до практичного використання. Отже, запропонований спосіб виявлення низькомолекулярних інгібіторів біосинтезу нуклеїнових кислот для первинного скринінгу хімічних сполук як синтетичного, так і природного походження можна вважати цілком виправданим. Результатом такого тестування є, по-перше, виявлення біологічно активних речовин - інгібіторів синтезу РНК та ДНК або релаксації ДНК і тим самим визначення спектру їхньої ферментативної активності, по-друге, з'ясування можливих характеристичних рис механізму дії активних сполук, а саме їхнього відношення до ДНК та ферменту [5]. В основу корисної моделі покладено застосування комбінації модельних ДНК-вмісних ферментативних систем, обслуговуючих реакції транскрипції, ампліфікації та релаксації, для виявлення серед будь-яких класів органічних сполук інгібіторів біосинтезу нуклеїнових кислот, потенційних антимікробних, противірусних та/або протипухлинних хіміопрепаратів. Перелічені системи є високопродуктивними, простими у виконанні, а візуалізація відповідних продуктів реакції не потребує використання радіоактивного мічення. Технічний ефект, отриманий у результаті реалізації корисної моделі, полягає у виявленні низькомолекулярних інгібіторів ферментів синтезу нуклеїнових кислот (Т7 РНК-полімерази, Taqполімерази (ПЛР), топоізомерази І), оцінці спектру їхньої ферментативної активності та визначенні характеристичних рис механізму молекулярної взаємодії активних сполук із окремими складовими 4 задіяних тест-систем. Застосування пропонованих тестових систем дозволяє встановлювати взаємозв'язок структура - активність в ряду досліджуваних сполук, що сприяє значному скороченню обсягів хімічного синтезу сполук з бажаними властивостями. Технічний ефект досягається використанням комбінації ДНК-вмісних комерційно доступних модельних ферментативних систем: транскрипційного комплексу бактеріофагу Т7, реплікативного комплексу полімеразної ланцюгової реакції та релаксаційного комплексу топоізомерази І. Суть пропозиції проілюстрована у таблицях 13. Представники трьох класів сполук - феназин1-карбоксамідів (табл.1), триазинобензотіазинів (табл.2) та акридон-4-карбоксамідів (табл.3) досліджували у модельних ферментативних системах. Приклад 1 Феназин-1-карбоксаміди (ФКК аміди) тестувалися у двох модельних ферментативних системах in vitro. Результати дослідження достатньо однозначно показують здатність ФКК амідів пригнічувати синтез РНК-транскриптів і менш ефективно - релаксацію ДНК топоізомеразою І Е.соlі. Відомо, що транскрипція - є однією з найважливіших клітинних мішеней для антимікробної терапії. Дослідження антимікобактеріальної дії низки ФКК амідів показало їхню високу активність по відношенню до Micobacterium tuberculosis штаму Н37 RV [6]. Ідентичність відтворення каталітичного механізму процесів транскрипції та реплікації підтверджує логічність дослідження їхньої антивірусної дії. Серед ФКК амідів ефективно пригнічували репродукцію вірусу герпесу другого типу (ВПГ-2) у культурі клітин дві речовини (РСА-1 та РСА-24). Результати наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Спектр біологічної активності низки заміщених 1-карбоксамідів феназину O NHR N N № сполуки РСА-18 РСА-1 R ортоCF3Ph метаCF3Ph Тестові системи Реакція транскриРеакція релаксації пції: пригнічення ДНК топоізомеразою І Micobacterium синтезу РНК у від- Пригнічення релаксаtuberculosis, штам сотках від контро- ції ДНК у відсотках від Н37 RV, антимікобалю при концентра- контролю при конценктеріальна активції речовин трації речовин ність (МІС, мкг/мл), 25мкг/мл 25мкг/мл ВПГ-2/культура клітин RK-13, антигерпетична активність, (ЕС50, мкг/мл), 100 20 0,39 Нд 90 0 0,78 3,0 5 53193 6 Продовження таблиці 1 № сполуки R Тестові системи Реакція транскриРеакція релаксації пції: пригнічення ДНК топоізомеразою І Micobacterium синтезу РНК у від- Пригнічення релаксаtuberculosis, штам сотках від контро- ції ДНК у відсотках від Н37 RV, антимікобалю при концентра- контролю при конценктеріальна активції речовин трації речовин ність (МІС, мкг/мл), 25мкг/мл 25мкг/мл параCF3Ph ортоРСА-21 CH3Ph метаРСА-5 CH3Ph параРСА-6 CH3Ph РСА-24 ВПГ-2/культура клітин RK-13, антигерпетична активність, (ЕС50, мкг/мл), 80 30 0,39 1,5 90 50 0,39 Нд 60 0 >100 Нд 100 60 0,78 Нд Приклад 2. Результати тестування похідних триазинобензотіазинів (ТТО) достовірно показують здатність ТТО ефективно пригнічувати синтез РНК у реакції транскрипції та ампліфікацію фрагментів ДНК в умовах полімеразної ланцюговій реакції. Дослідження цих похідних ТТО в культурі клітин, інфікованих вірусом герпесу другого типу (ВПГ-2), показало, що всі досліджені сполуки ефективно пригнічують репродукцію ДНК-геномного вірусу (ЕС50 у межах 0,6-4,25мкг/мл). Результати наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Спектр біологічної активності низки похідних конденсованого 1,2,4-триазину (ТТО) H N O R' N N R N S Тестові системи № сполуки R R' 1 2 3 4 5 6 7-Сl 7-CF3 8-But Н Н 7-CF3 Н Н Н Н Rib Rib Реакція транскрипції: пригнічення синтезу РНК (IC99), концентрація сполук, мкМ 99,0 87,4 22,5 100,0 85,7 71,7 ВПГ-2/культура Полімеразна ланцюгова клітин RK-13, антиреакція: пригнічення сингерпетична активтезу ДНК (ІС99), концентність сполук (ЕС50, рація сполук, мкМ мкМ) 7,9 12,5 7,0 7,0 7,5 15,9 9,1 2,7 5,7 3,14 4,8 3,9 Примітка. But - н-C4H8; Rib - залишок рибофуранози Приклад 3. Акридон-4-карбоксаміди (АКК аміди), показують здатність ефективно пригнічувати синтез РНК-транскриптів і менш ефективно - релаксацію ДНК топоізомеразою І у межах близьких концентрацій. Однак, ці ж сполуки вибірково, але досить ефективно пригнічують аналогічний за принципом дії геліказний комплекс РНК-геномного вірусу гепатиту С (ВГС) [7]. Загалом представники АКК амідів ефективно пригнічують репродукцію як РНК- , так ДНК-геномних вірусів, а саме вірусу гепатиту С, вірусу грипу A/FM/1 (H1N1) та вірусу простого герпесу другого типу (ВПГ-2, штам ВН) у культурі клітин. Результати досліджень наведено в таблиці 3. 7 53193 8 Таблиця 3 Спектр біологічної активності низки заміщених ариламідів акридон-4-карбонової кислоти O NHR H N O Тестові ДНК-вмісні ферментативні комплекси № Сполука 1 2 3 4 5 6 AKR-3 AKR-1 AKR-2 AKR-5 AKR-11 AKR-6 T7 РНКП, ІС99 сполук, мкМ Геліказа ВГС, ІС50 сполук, мкМ Репликон ВГС, ЕС50 сполук, мкМ 20 40 80 40 40 80 9,0 6,0 19,8 4,0 >100 100 9,0 6,5 11,0 10,0 >100 4,3 Результати випробувань свідчать, що більшість речовин, здатних пригнічувати функціонування модельних ферментативних систем транскрипційного комплексу бактеріофагу Т7, реплікативного комплексу полімеразної ланцюгової реакції та релаксаційного комплексу топоізомерази 1, були активними і в тестах на бактеріальних, і вірусних моделях. З використанням такого підходу серед феназин-1-карбоксамідів було виявлено сполуки з потужною протитуберкульозною дією, серед триазинобензотіазинів - інгібітори репродукції вірусів герпесу. Акридон-4-карбоксаміди продемонстрували противірусну дію як по відношенню до РНК-, так і ДНК-геномних вірусів, а саме - вірусів гепатиту С та грипу А і вірусу герпесу простого (ВПГ-2) відповідно. Список літератури 1. Puvvada М.S., Forrow S.A., Hartley J.A. at all. Inhibition of Bacteriofage T7 RNA Polymerase in Vitro Transcription by DNA-Binding Pyrrolo[2,1c][1,4]benzodiazepines //Biochemistry. - 1997. - 36. P. 2478-2484. 2. Wilmanska D., Czyz M., Studzian K., Piestrzeniewciz M.K., Gniazdowski M. Effects of Anticancer Drugs on Transcription in vitro // Z. Naturforsch. - 2001. - 56. - P. 886-891. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Система вірус/клітина ВПГ-2, штам Вірус грипу A ВН/RK-13; (H1N1)/MDCK, ЕС50 сполук, ЕС50 сполук, мкМ мкМ 16,0 3,1 14,8 3,0 7,5 3,0 3,9 3,1 3,2 2,6 58,8 3,0 3. Kunimoto Hota, Chun-Bao Zhu, Poolsak Phomsuwansiri, Jun Ishikawa, Satoshi Mizuno, Masahiro Hatsu and Satoshi Imai. PCR Inhibition Assay for DNA-targeted Antibiotics // The Journal of Antibiotics. - 1995. - Vol.48, N 11. - P. 1267-1272. 4. Патент України № 45820 А, опубл. 15.04.2002, Бюл. № 4, 2002 p. 5. Jörg Т. Hartmann,. H.-P. Lipp. Camptothecin and Podophyllotoxin Derivatives: Inhibitors of Topoisomerase I and II - Mechanisms of Action, Pharmacokinetics and Toxicity Profile // Drag Safety. 2006. - V.29, N3 - P. 209-230. 6. De Logu A., Palchykovska L.H., Kostina V.H., Sanna A., Meleddu R., Chisu L., Alexeeva I.V., Shved A.D. Novel N-aryl and N-heteryl phenazine-1carboxamides as potential agents for the treatment of infections sustained by drug-resistant and multidrugresistant Mycobacterium tuberculosis II Internal J. of Antimicrobial Agents. - 2009. - 33, N3. - P. 223 - 229. 7. Stankiewicz-Drogon A., Palchykovska L.G., Kostina V.G., Alexeeva I.V., Shved A.D., Boguszewska-Chachulska A.M. New acridone-4carboxylic acid derivatives as potential inhibitors of Hepatitis С virus infection // Bioorganic and Medicinal Chemistry. - 2008. - 16. - P. 8846 - 8852. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601