Спосіб одержання високоочищеної субстанції свинячого інсуліну

Спосіб одержання високоочищеної субстанції свинячого інсуліну, що включає водно-спиртову екстракцію підшлункової залози свині, концентра 3 57687 4 фокатіоніті та до великих втрат інсуліну (до 20%) переважно 0,2-0,3М. Питоме навантаження на внаслідок блокування поверхні сульфокатіонітного сорбент складає не більше 30г/л. Елюцію субстансорбенту ліпідами, фосфоліпідами та ліпідції інсуліну проводять або в ізократичному режимі, протеіновими комплексами. Використання при або у градієнті концентрації органічного модифікаочистці від проінсуліну та інших баластних білків тора протягом 6-10 об'ємів колонки. на силікагелі С16 вказаної рухомої фази, яка є Вирішення поставленого завдання ілюструєтьнизько селективною щодо них, також призводить ся прикладами конкретного виконання. до значних втрат інсуліну (15-20%) та до низьких Приклад 1 питомих навантажень на колонку (38,2г на 1л сорНа першому етапі 38,1кг підшлункових залоз бенту). Низькі питомі навантаження на колонку свиней подрібнюють, екстрагують 190,5л 70% етахарактерні для способу-прототипу і при очистці від нолу за рН=3,0 (використовують ортофосфорну інсулінспоріднених домішок (13,8г). кислоту) за кімнатної температури протягом 1,5 Завдання винаходу, який заявляється, є погодини. Баластні білки в екстракті осаджують за ліпшення якості свинячої субстанції інсуліну, збірН=4,5 та відділяють сепаруванням, освітлений льшення виходу по інсуліну та збільшення ефекекстракт упарюють на вакуумному роторному плівтивності виробництва. ковому випарнику за температури кипіння 25°С до Поставлене завдання вирішується тим, що в об’єму 22,86л. Упарений екстракт фільтрують від способі одержання високоочищеної субстанції ліпідів через фільтрувальний картон. В освітлений свинячого інсуліну, що включає водно-спиртову екстракт для висалювання інсуліну за рН=2,5 доекстракцію підшлункової залози свині, концентрадають 3,352кг хлористого натрію. Одержаний висіл цію та виділення субстанції інсуліну з екстракту, її відокремлюють від маточного розчину, розчиняють хроматографічну очистку від проінсуліну, інших у 0,762 л води, очищеної за рН=8,6, та додають баластних білків та від інсулінспоріднених домішок для кристалізації 110г хлористого натрію. Отримаі кристалізацію, згідно з винаходом, хроматографіні кристали субстанції інсуліну розчиняють в 380 чну очистку субстанції свинячого інсуліну провомл води, очищеної за рН=8,6, та додають для педять на обернено-фазових силікагелях С8 або рекристалізації 33,5г хлористого натрію. Одержані С18, як елюент на стадії очистки від проінсуліну та кристалі відокремлюють від маточного розчину інших баластних білків використовують водноцентрифугуванням та одержують 9,525г по технічорганічний розчин, який містить 12-21%, переважній масі (4,762г в перерахунку на суху речовину) но 18-20%, ізопропанолу або пропанолу та не бісубстанції інсуліну-сирцю з вмістом інсуліну 92%. льше 0,25М, переважно 0,01-0,06М, ацетату наНа другому етапі 9,525г по технічній масі трію, ацетату амонію, сульфату амонію або (4,762г в перерахунку на суху речовину) субстанції сульфату натрію, а стадію очистки від інсулінспоінсуліну-сирцю розчиняють в 41,9мл буферного ріднених домішок проводять в ізократичному рерозчину А, який містить 0,05М натрію ацетату та жимі або у градієнті органічного модифікатора. 19% ізопропанолу, значення рН доводять до 2,5 Для вирішення поставленого завдання автори розчином соляної кислоти з масовою долею 10%. відмовляються від використання сульфокатіоніту і Одержаний розчин субстанції інсуліну фільтрують на першому етапі для концентрації і виділення через мембранний фільтр з утримуючою здатністю субстанції інсуліну спиртові екстракти упарюють 0,2мкм, одержують 47,62мл розчину субстанції до вмісту етанолу менше 1,0%об., відокремлюють інсуліну-сирцю. Для очистки від проінсуліну, білків від ліпідів фільтрацією та висалюють субстанцію панкреатичного походження, полімерних білків та інсуліну за рН 2,0-3,3 та концентрації хлориду напігментів одержаний розчин пропускають зі швидтрію, хлориду амонію, сульфату натрію або сулькістю потоку 0,7мл/хв. через хроматографічну кофату амонію від 2,0 до 3,0моль/л. На другому еталонку діаметром 1 см, висотою 20см, яка заповнепі очистку від проінсуліну, білків і поліпептидів на 15,7мл силікагелю С18 (розмір пор 15нм, розмір панкреатичного походження, полімерних білків та часток 15мкм). Після введення розчину субстанції пігментів проводять на обернено-фазових силікаінсуліну колонку промивають 47,6 мл буферного гелях С8 або С18 з розміром часток не більше розчину А. Отримують 103мл розчину субстанції 50мкм, переважно 15-20мкм, та з розміром пор не інсуліну, який містить 4,526г в перерахунку на суху менше 9нм, переважно 12-15нм, а в якості рухомої речовину з вмістом основної речовини 95% і вмісфази використовують водно-органічний буферний том проінсуліну 3,8р.р.м. розчин зі значенням рН не більше 3,5, який містить На третьому етапі до 103мл розчину субстан12-21%, переважно 18-20%, ізопропанолу або ції інсуліну, який одержали на другому етапі, допропанолу та не більше 0,25М, переважно 0,01дають 38мл очищеної води, і для очистки інсуліну 0,06М, ацетату натрію, ацетату амонію, сульфату від інсулінспоріднених домішок одержаний розчин амонію або сульфату натрію. Питоме навантаженвводять зі швидкістю потоку 6мл/хв. через хроманя на сорбент складає не більше 300г/л. На третографічну колонку діаметром 2см, висотою 50см, тьому етапі очистку від інсулінспоріднених доміяка заповнена 157мл силікагелю С18 (розмір пор шок проводять на обернено-фазових силікагелях 15нм, розмір часток 15мкм). Після введення субсС8 або С18 з розміром часток не більше 50мкм, танції інсуліну колонку промивають 149мл буферпереважно 10-15мкм, та з розміром пор не менше ного розчину В, який містить 0,25М кислоти оцто9нм, переважно 12-15нм, а в якості рухомої фази вої і 10% ізопропанолу. Елюцію субстанції інсуліну використовують водно-органічний розчин, який ведуть протягом 2,6 години зі швидкістю потоку містить 5-40% органічного модифікатора (пропа8мл/хв. у лінійному градієнті ізопропанолу від 12 нолу, ізопропанолу, етанолу або ацетонітрилу) і до 18%, для чого змішують буферний розчин В з кислоту оцтову з концентрацією не більше 0,5М, буферним розчином С, який містить 0,25М кислоти 5 57687 6 оцтової і 50% ізопропанолу. Регенерацію сорбенту Приклад 6 на другому та третьому етапі проводять промиПроцес виділення та очистки ведуть аналогічванням буферним розчином В. Елюат, який місно прикладу 1, але на другому етапі значення рН тить інсулін, розбивають на фракції об'ємом 15мл. підвищують до 4,0. Внаслідок близькості до ізоеФракції аналізують методом високоефективної лектричної точки інсуліну (рI=5,3) не вдається одерідинної хроматографії (методом ВЕРХ) на вміст ржати його стабільний розчин. Процес припинядомішок. За результатами аналізу формують гоють. ловну фракцію, яка містить 3,982г субстанції інсуПриклад 7 ліну (380мл елюату з концентрацією інсуліну Процес виділення та очистки ведуть аналогіч10,48мг/мл) наступного складу: 98,9 % основної но прикладу 1, але на другому етапі використовуречовини, 0,3% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,8% інсують буферний розчин А з вмістом ізопропанолу лінспоріднених домішок. В розчин головної фрак10,0% об. Одержують 3,65г субстанції інсуліну по ції, перемішуючи, додають 381мл розчину кислоти технічній масі (3,467г в перерахунку на суху речолимонної з масовою долею 2,0%, 4,19мл розчину вину) наступного складу: 97,7% основної речовицинку хлористого з масовою долею 10%. Потім, ни, 0,5% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,8% інсулінспоперемішуючи, в розчин субстанції інсуліну додаріднених домішок, 15,1р.р.м. проінсуліну. ють розчин гідроокису натрію з масовою долею Приклад 8 10,0% до значення рН=6,6. Розчин перемішують Процес виділення та очистки ведуть аналогічпротягом 1,5 години. Потім розчином кислоти з но прикладу 1, але на другому етапі використовумасовою долею 5,0% доводять значення рН до 5,9 ють буферний розчин А з вмістом ізопропанолу і продовжують перемішування ще протягом 4,0 22,0% об. Одержують 4,275г субстанції інсуліну по годин, після чого одержані кристали субстанції технічній масі (4,061г в перерахунку на суху речоінсуліну відокремлюють центрифугуванням. Крисвину) наступного складу: 98,1% основної речовитали промивають очищеною водою і сушать ліони, 0,6% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,3% інсулінспофільне. Одержують 4,149г субстанції інсуліну по ріднених домішок, 52,2р.р.м. проінсуліну. технічній масі (3,943г в перерахунку на суху речоПриклад 9 вину) наступного складу: 98,8% основної речовиПроцес виділення та очистки ведуть аналогічни, 0,4% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,8% інсулінспоно прикладу 1, але на другому етапі використовуріднених домішок, 0,6р.р.м. проінсуліну. ють буферний розчин А з вмістом ацетату натрію Приклад 2 0,5М . Одержують 3,734г субстанції інсуліну по Процес виділення та очистки ведуть аналогічтехнічній масі (3,547г в перерахунку на суху речоно прикладу 1, але на другому та третьому етапах вину) наступного складу: 98,2% основної речовизамість ізопропанолу використовують пропанол. ни, 0,8% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,0% інсулінспоОдержують 4,123г субстанції інсуліну по технічній ріднених домішок, 12р.р.м. проінсуліну. масі (3,917г в перерахунку на суху речовину) наПриклад 10 ступного складу: 98,7% основної речовини, 0,5% Процес виділення та очистки ведуть аналогічдезамідо(А-21)інсуліну, 0,8% інсулінспоріднених но прикладу 1, але на другому етапі використовудомішок, 0,6р.р.м. проінсуліну. ють буферний розчин А з вмістом сульфату амоПриклад 3 нію 0,01М . Одержують 4,115г субстанції інсуліну Процес виділення та очистки ведуть аналогічпо технічній масі (3,924г в перерахунку на суху но прикладу 1, але на третьому етапі замість ізопречовину) наступного складу: 98,7% основної реропанолу використовують етанол. Одержують 4,0г човини, 0,5% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,8% інсулінсубстанції інсуліну по технічній масі (3,802г в песпоріднених домішок, 0,3р.р.м. проінсуліну. рерахунку на суху речовину) наступного складу: Приклад 11 98,7% основної речовини, 0,4% дезамідо(АПроцес виділення та очистки ведуть аналогіч21)інсуліну, 0,9% інсулінспоріднених домішок, но прикладу 1, але на другому етапі використову0,9р.р.м. проінсуліну. ють буферний розчин А з вмістом сульфату натрію Приклад 4 0,01М. Одержують 4,134г субстанції інсуліну по Процес виділення та очистки ведуть аналогічтехнічній масі (3,928г в перерахунку на суху речоно прикладу 1, але на третьому етапі замість лівину) наступного складу: 98,8% основної речовинійного градієнту ізопропанолу використовують ни, 0,6 % дезамідо(А-21)інсуліну, 0,6% інсулінспоізократичний режим елюції за концентрацій ізопріднених домішок, 0,4р.р.м. проінсуліну. ропанолу 15,5% об. Одержують 4,157г субстанції Приклад 12 інсуліну по технічній масі (3,947г в перерахунку на Процес виділення та очистки ведуть аналогічсуху речовину) наступного складу: 98,7% основної но прикладу 1, але на другому етапі використовуречовини, 0,6% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,7% інсують буферний розчин А з вмістом ацетату амонію лінспоріднених домішок, 0,5р.р.м. проінсуліну. 0,05М . Одержують 4,145г субстанції інсуліну по Приклад 5 технічній масі (3,94г в перерахунку на суху речоПроцес виділення та очистки ведуть аналогічвину) наступного складу: 98,8% основної речовино прикладу 1, але на третьому етапі замість ізопни, 0,5% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,7% інсулінспоропанолу використовують ацетонітрил. Одержуріднених домішок, 0,7р.р.м. проінсуліну. ють 4,115г субстанції інсуліну по технічній масі Приклад 13 (3,909г в перерахунку на суху речовину) наступноПроцес виділення та очистки ведуть аналогічго складу: 98,5% основної речовини, 0,8% дезаміно прикладу 1, але на третьому етапі використодо(А-21)інсуліну, 0,7 інсулінспоріднених домішок, вують буферні розчини В та С з вмістом кислоти 0,6р.р.м. проінсуліну. оцтової 1,0М. Спостерігають різкий ріст тиску на 7 57687 8 хроматографічній колонці внаслідок полімеризації поріднених домішок, проінсуліну 4,6р.р.м. Питоме інсуліну. Процес припиняють. навантаження на сорбент складає 34г/л. Приклад 14 Приклад 15 Процес виділення та очистки ведуть аналогічПроцес виділення та очистки ведуть аналогічно прикладу 1, але беруть 50кг підшлункових зано прикладу 1, але беруть на другому і третьому лоз свиней. Одержують на першому етапі 12,5г по етапах замість силікагеля С18 силікагель С8. Одетехнічній масі (6,25г в перерахунку на суху речоржують 4,153г субстанції інсуліну по технічній масі вину) субстанції інсуліну-сирцю з вмістом основної (3,945г в перерахунку на суху речовину) субстанції речовини 91,9%. На другому етапі одержують розінсуліну наступного складу: 98,7% основної речочин, який містить 6,0г в перерахунку на суху речовини, 0,6% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,7% інсулінсвину субстанції інсуліну з вмістом основної речопоріднених домішок, проінсуліну 0,7р.р.м. вини 94,5%, проінсуліну 28,1р.р.м. Питоме Таким чином, при використанні рішення, що навантаження на сорбент складає 380г/л. На трезаявляється, вдається одержати субстанцію інсутьому етапі одержують 5,563г по технічній масі ліну з чистотою краще за 98,7%, з вмістом проін(5,284г в перерахунку на суху речовину) субстанції суліну менше 1,0р.р.м., вихід по інсуліну збільшуінсуліну наступного складу: 98,2% основної речоється на 27-44%, а питомі навантаження на вини, 0,6% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,2% інсулінссорбент збільшуються на другому етапі у 7-8 разів, а на третьому - у 2 рази. Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601