Спосіб одержання препарату інсуліну пролонгованої дії

Спосіб одержання препарату інсуліну пролонгованої дії, при якому проводять водноспиртову екстракцію підшлункової залози свині, концентрацію та виділення субстанції інсуліну з екстракту, її хроматографічну очистку від проінсуліну, інших баластних білків та від інсулінспоріднених домішок, кристалізацію, приготування розчину одержаної субстанції інсуліну в кислоті, приготування водних розчинів інших C2 1 3 57690 4 хроматографічне відокремлюють від інсуліну силікагелях С8 або С18, як елюент на стадії очистпроінсулін та інші баластні білки на сорбенті С16, ки від про інсуліну та інших баластних білків виковикористовуючи при цьому як елюент водні розчиристовують водно-органічний розчин із значенням ни з вмістом ізопропілового спирту 10-50% і рН не більше 3,5, який містить 12-21%, переважно оцтової кислоти 0,1-5,0%, очистку від 18-20%, ізопропанолу або пропанолу та не більше дезамідованих форм інсуліну та інших інсулінів 0,25М, переважно 0,01-0,06М, ацетату натрію, проводять у градієнті водно-органічного елюенту з ацетату амонію, сульфату амонію або сульфату вмістом оцтової кислоти 0,2-0,8% та в кінці кожнонатрію, стадію очистки від інсулінспоріднених го етапу проводять кристалізацію субстанції домішок проводять в ізократичному режимі або у інсуліну, потім одержану високоочищену градієнті органічного модифікатора, потім субстанцію свинячого інсуліну розчиняють субстанцію інсуліну розчиняють у соляній кислоті з порціями в оцтовій кислоті і змішують поступово з додатком цинку хлориду або окису цинку, готують розчинами натрію оцтовокислого, натрію хлориду, водний розчин натрію ацетату та натрію хлориду, цинку хлориду або окису цинку та з розчинами змішують обидва розчини та додають затравку консервантів (наприклад, ніпагіну). Препарати для кристалізації, а одержану реакційну суміш інсуліну пролонгованої дії, які одержують за спостабілізують водним розчином цинку хлориду або собом-прототипом, мають наступний склад, г/л: окису цинку, лимонної кислоти та консерванту. субстанція свинячого інсуліну -1,45-1,8; натрію Вирішення поставленого завдання хлорид - 6,5-7,5, натрій оцтовокислий - 1,25-1,45, ілюструється прикладами конкретного виконання. цинку хлорид або окис цинку - 0,05-0,10, консерПриклад 1 вант, наприклад, ніпагін - 0,09-1,4; вода високоНа першому етапі 38,1кг підшлункових залоз очищена - до 1л. свиней подрібнюють, екстрагують 190,5л 70% етаНедоліками цього способу являються викоринолу за рН=3,0 (використовують ортофосфорну стання для концентрації та виділення субстанції кислоту) за кімнатної температури протягом 1,5 інсуліну іонообмінної хроматографії на колонці з години. Баластні білки в екстракті осаджують за сульфокатіонітом на першому етапі та такої рН=4,5 та відділяють сепаруванням, освітлений рухомої фази, як ізопропіловий спирт у кількості екстракт упарюють на вакуумному роторному 10-50% та оцтова кислота у кількості 0,1-5,0%, на плівковому випарнику за температури кипіння другому етапі одержання субстанції інсуліну. Це 25°С до об’єму 22,86л. Упарений екстракт призводить до етеріфікації та дезамідації інсуліну фільтрують від ліпідів через фільтрувальний карпри сорбції спиртових екстрактів на тон. В освітлений екстракт для висалювання сульфокатіоніті та до великих втрат інсуліну (до інсуліну за рН=2,5 додають 3,352кг хлористого 20%) внаслідок блокування поверхні натрію. Одержаний висіл відокремлюють від масульфокатіонітного сорбенту ліпідами, точного розчину, розчиняють у 0,762л води, фосфоліпідами та ліпід-протеіновими комплексаочищеної за рН=8,6, та додають для кристалізації ми. Використання при очистці від проінсуліну та 110г хлористого натрію. Отримані кристали інших баластних білків на силікагелі С16 вказаної субстанції інсуліну розчиняють в 380мл води, рухомої фази, яка є низько селективною щодо них, очищеної за рН=8,6, та додають для також призводить до втрат інсуліну (15-20%) та до перекристалізації 33,5г хлористого натрію. низьких питомих навантажень на колонку (38,2г на Одержані кристалі відокремлюють від маточного 1л сорбенту). Низькі питомі навантаження на корозчину центрифугуванням, одержують 9,525г по лонку характерні для способу-прототипу і при технічній масі (4,762г в перерахунку на суху речоочистці від інсулінспоріднених домішок (13,8г). Це вину) субстанції інсуліну-сирцю з вмістом інсуліну призводить до недостатньої ефективності вироб92%. ництва. Окрім того, одержані кристали На другому етапі 9,525г по технічній масі ромбоедричної форми не відзначаються (4,762г в перерахунку на суху речовину) субстанції стабільністю і розвалюються при зберіганні препаінсуліну-сирцю розчиняють в 41,9мл буферного рату. розчину А, який містить 0,05М натрію ацетату та Завдання винаходу, який заявляється, є 19% ізопропанолу, значення рН доводять до 2,5 поліпшення якості монокомпонентних препаратів розчином соляної кислоти з масовою долею 10%. інсуліну пролонгованої дії на основі одержуваної Одержаний розчин субстанції інсуліну фільтрують свинячої субстанції, збільшення їх стабільності та через мембранний фільтр з утримуючою здатністю збільшення ефективності виробництва. 0,2 мкм, одержують 47,62мл розчину субстанції Поставлене завдання вирішується тим, що в інсуліну-сирцю. Для очистки від проінсуліну, білків способі одержання препарату інсуліну панкреатичного походження, полімерних білків та пролонгованої дії, що включає водно-спиртову пігментів одержаний розчин пропускають зі екстракцію підшлункової залози свині, швидкістю потоку 0,7мл/хв. через хроматографічну концентрацію та виділення субстанції інсуліну з колонку діаметром 1см, висотою 20см, яка заповекстракту, її хроматографічну очистку від нена 15,7мл силікагелю С18 (розмір пор 15нм, проінсуліну, інших баластних білків та від розмір часток 15мкм). Після введення розчину інсулінспоріднених домішок, кристалізацію, пригосубстанції інсуліну колонку промивають 47,6мл тування розчину одержаної субстанції інсуліну в буферного розчину А. Отримують 103мл розчину кислоті, приготування водних розчинів інших субстанції інсуліну, який містить 4,526г в переракомпонентів та їх змішування, згідно з винаходом, хунку на суху речовину з вмістом основної речовихроматографічну очистку субстанції свинячого ни 95% і вмістом проінсуліну 3,8р.р.м. інсуліну проводять на обернено-фазових 5 57690 6 На третьому етапі до 103мл розчину 70% препарату готують, як в прикладі 1 в субстанції інсуліну, який одержали на другому об'ємі 1870мл . Потім 1,24г субстанції інсуліну розетапі, додають 38мл очищеної води, і для очистки чиняють в 200мл води за рН 3,0-3,2. 1,0г натрію інсуліну від інсулінспоріднених домішок одержаний ацетату, 0,02г цинку ацетату, 0,97г ніпагіну розчирозчин вводять зі швидкістю потоку 6мл/хв. через няють в 600мл води. Змішують другий і третій розхроматографічну колонку діаметром 2см, висотою чини та перемішують їх протягом 2 годин. Одер50см, яка заповнена 157мл силікагелю С18 (розмір жують суспензійний розчин, котрий змішують з пор 15нм, розмір часток 15мкм). Після введення 1870мл кристалічної суспензії. Одержують препасубстанції інсуліну колонку промивають 149мл рат інсуліну пролонгованої дії з наступними харакбуферного розчину В, який містить 0,25М кислоти теристиками: активність препарату 39,8МО/мл, оцтової і 10% ізопропанолу. Елюцію субстанції вміст (А21) дезамідоінсуліну 0,42%, інсуліну ведуть протягом 2,6 години зі швидкістю інсулінспоріднених домішок 0,73%, кристалічна потоку 8мл/хв. у лінійному градієнті ізопропанолу частина препарату складає 65%. Препарат являє від 12 до 18%, для чого змішують буферний розсобою суміш ромбоедричних кристалів розміром чин В з буферним розчином С, який містить 0,25М 15-20мкм та аморфних часток розміром до 2мкм. кислоти оцтової і 50% ізопропанолу. Регенерацію Як показали досліди авторів, при зберіганні препасорбенту на другому на третьому етапі проводять рату за температури 2-8°С протягом 2-х років крипромиванням буферним розчином В. Елюат, який стали зберегли свою форму і розмір, а аморфні містить інсулін, розбивають на фракції об'ємом частки не утворили конгломератів. 15мл. Фракції аналізують методом Приклад 3 високоефективної рідинної хроматографії (метоПроцес виділення та очистки субстанції дом ВЕРХ) на вміст домішок. За результатами інсуліну, а також одержання препарату інсуліну аналізу формують головну фракцію, яка містить пролонгованої дії на її основі ведуть аналогічно 3,982г субстанції інсуліну (380мл елюату з прикладу 1, але на третьому етапі замість концентрацією інсуліну 10,48мг/мл) наступного лінійного градієнту ізопропанолу використовують складу: 98,9% основної речовини, 0,3% ізократичний режим елюції за концентрації дезамідо(А-21)інсуліну, 0,8% інсулінспоріднених ізопропанолу 15,5% об. Одержують 4,157 г домішок. В розчин головної фракції, перемішуючи, субстанції інсуліну по технічній масі (3,947г в педодають 381мл розчину кислоти лимонної з масорерахунку на суху речовину) наступного складу: вою долею 2,0%, 4,19мл розчину цинку хлориду з 98,7% основної речовини, 0,6% дезамідо(Амасовою долею 10%. Потім, перемішуючи, в роз21)інсуліну, 0,7% інсулінспоріднених домішок, чин субстанції інсуліну додають розчин гідроокису 0,5р.р.м. проінсуліну. Аналіз одержаного препаранатрію з масовою долею 10,0% до значення ту інсуліну за допомогою аналітичної рН=6,6. Розчин перемішують протягом 1,5 години. високоефективної рідинної хроматографії за гоПотім розчином кислоти соляної з масовою долею ловними показниками засвідчує високу якість пре5,0 % доводять значення рН до 5,9 і продовжують парату: активність -39,6,МО/мл; вміст перемішування ще протягом 4,0 годин, після чого (А21)дезамідоінсуліну 0,35%; вміст одержані кристали субстанції інсуліну інсулінспоріднених домішок 0,79, вміст відокремлюють від маточного розчину центрифукристалічної частини інсуліну - 91,5%, розмір гуванням. Кристали промивають очищеною водою переважної кількості ромбоедричних кристалів 15і сушать ліофільне. Одержують 4,149г субстанції 2мкм. інсуліну по технічній масі (3,943г в перерахунку на Приклад 4 суху речовину) наступного складу: 98,8% основної Процес виділення та очистки субстанції речовини, 0,4% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,8% інсуліну ведуть аналогічно прикладу 1, але на друінсулінспоріднених домішок, 0,6р.р.м. проінсуліну. гому етапі значення рН підвищують до 4,0. 4,149г субстанції свинячого інсуліну, 53 мг цинку Внаслідок близькості до ізоелектричної точки хлориду розчиняють в 200 мл води за рН 3,0-3,2. В інсуліну (рI=5,3) не вдається одержати стабільний 68мл води розчиняють 3,6г натрію ацетату, 18,5г розчин його субстанції. Процес припиняють. натрію хлориду і рН розчину доводять до 10-12. Приклад 5 Змішують обидва розчини і додають 5 мл затравПроцес виділення та очистки субстанції ки, перемішуючи, проводять кристалізацію протяінсуліну ведуть аналогічно прикладу 1, але на другом 12 годин. В 2,4л води розчиняють 0,388г цинку гому етапі використовують буферний розчин А з хлориду, 0,4г кислоти лимонної, 3,25г ніпагіну вмістом ізопропанолу 10,0% об. Одержують 3,65г (стабілізаційна суміш). Кристалізаційну суміш субстанції інсуліну по технічній масі (3,467г в пезмішують за перемішування зі стабілізаційною рерахунку на суху речовину) наступного складу: сумішшю та одержують препарат інсуліну 97,7% основної речовини, 0,5% дезамідо(Апролонгованої дії з наступними характеристиками: 21)інсуліну, 1,8% інсулінспоріднених домішок, вміст інсуліну 39,4МО/мл, (А21) дезамидоінсуліну 15,1р.р.м. проінсуліну. Якість одержаної субстанції 0,42%, інсулінспоріднених домішок 0,78%, вміст інсуліну не дозволяє використовувати її для пригокристалічної частини інсуліну 93,5%, розмір тування препарату інсуліну. переважної кількості ромбоедричних кристалів 23Приклад 6 25мкм. Як показали досліди авторів, при зберіганні Процес виділення та очистки субстанції за температури 2-8°С протягом 2-х років форма і інсуліну ведуть аналогічно прикладу 1, але на друрозмір кристалів залишилися практично гому етапі використовують буферний розчин А з незмінними. вмістом ізопропанолу 22,0% об. Одержують 4,275г Приклад 2 субстанції інсуліну по технічній масі (4,061г в пе 7 57690 8 рерахунку на суху речовину) наступного складу: 21)інсуліну, 0,8% інсулінспоріднених домішок, 98,1% основної речовини, 0,6% дезамідо(А0,3р.р.м. проінсуліну. Аналіз одержаного препара21)інсуліну, 1, % інсулінспоріднених домішок, ту інсуліну за допомогою аналітичної 52,2р.р.м. проінсуліну. Якість одержаної субстанції високоефективної рідинної хроматографії за гоінсуліну не дозволяє використовувати її для приголовними показниками засвідчує високу якість претування препарату інсуліну. парату: активність 39,3МО/мл; вміст Приклад 7 (А21)дезамідоінсуліну 0,4%; вміст Процес виділення та очистки ведуть інсулінспоріднених домішок - 0,7%, вміст аналогічно прикладу 1, але на другому етапі викокристалічної частини інсуліну 94%, розмір ристовують буферний розчин А з вмістом ацетату переважної кількості ромбоедричних кристалів 15натрію 0,5М. Одержують 3,734г субстанції інсуліну 25мкм. по технічній масі (3,547г в перерахунку на суху Приклад 9 речовину) наступного складу: 98,2% основної реПроцес виділення та очистки субстанції човини, 0,8% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,0% інсуліну ведуть аналогічно прикладу 1, але на інсулінспоріднених домішок, 12р.р.м. проінсуліну. третьому етапі використовують буферні розчини В Якість одержаної субстанції інсуліну не дозволяє та С з вмістом кислоти оцтової 1,0М. використовувати її для приготування препарату Спостерігають різкий ріст тиску на інсуліну. хроматографічній колонці внаслідок полімеризації Приклад 8. інсуліну. Процес припиняють. Процес виділення та очистки, а також одерАналіз виконаних прикладів підтверджує жання препарату інсуліну пролонгованої дії на її поліпшення якості препаратів інсуліну, одержуваоснові ведуть аналогічно прикладу 1, але на друних способом, що заявляється, за рахунок знигому етапі використовують буферний розчин А з ження вмісту проінсуліну, збільшення їх вмістом сульфату амонію 0,01М . Одержують стабільності при зберіганні та збільшення 4,115г субстанції інсуліну по технічній масі (3,924г ефективності виробництва майже на 30% за рахув перерахунку на суху речовину) наступного скланок збільшення виходу по інсуліну на 27- 44%. ду: 98,7% основної речовини, 0,5% дезамідо(А Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601