Спосіб одержання препарату інсуліну короткої дії

Спосіб одержання препарату інсуліну короткої дії, при якому проводять водно-спиртову екстракцію підшлункової залози свині, концентрацію та виділення субстанції інсуліну з екстракту, її хроматографічну очистку від проінсуліну, інших баластних білків та від інсулінспоріднених домішок, кристалізацію, приготування розчину одержаної субстанції інсуліну в кислоті, приготування водних C2 1 3 57689 4 фером з рН 6,5-9,0, потім хроматографічне відо0,25М, переважно 0,01 - 0,06М, ацетату натрію, кремлюють від інсуліну проінсулін та інші баластні ацетату амонію, сульфату амонію або сульфату білки на сорбенті С16, використовуючи при цьому натрію, стадію очистки від інсулінспоріднених дояк елюент водні розчини з вмістом ізопропілового мішок проводять в ізократичному режимі або у спирту 10-50% і оцтової кислоти 0,1-5,0%, очистку градієнті органічного модифікатора, а одержану від дезамідованих форм інсуліну та інших інсулінів субстанцію інсуліну суспендують у воді, доводять проводять у градієнті водно-органічного елюенту з рН суспензії кислотою до 3,1-3,2, одержують розвмістом оцтової кислоти 0,2-0,8% та в кінці кожночин інсуліну, готують водний розчин буферного та го етапу проводять кристалізацію субстанції інсуізотонічних агентів і консервантів та, перемішуючи, ліну, потім одержану високоочищену субстанцію доводять рН розчину лугом до 7,6-7,8 і додають свинячого інсуліну розчиняють порціями в 0,005перший розчин до другого. 0,05М оцтовій кислоті і змішують поступово з розДля вирішення поставленого завдання автори чинами гліцерину, консерванту (наприклад, ніпагівідмовляються від використання сульфокатіоніту і ну) та з розчином натрію гідроксиду. Препарат на першому етапі для концентрації і виділення інсуліну короткої дії, який одержують за способомсубстанції інсуліну спиртові екстракти упарюють прототипом, має наступний склад, г/л: субстанція до вмісту етанолу менше 1,0% об., відокремлюють свинячого інсуліну 1,44-1,65; кислота оцтова 0,8від ліпідів фільтрацією та висалюють субстанцію 1,2; натрію гідроксид 0,35-1,1; гліцерин 10-20; ніпаінсуліну за рН 2,0-3,3 та концентрації хлориду нагін або інший консервант 0,085-1,4; вода високоотрію, хлориду амонію, сульфату натрію або сульчищена - до 1л. фату амонію від 2,0 до 3,0моль/л. На другому етаНедоліками цього способу являються викориспі очистку від проінсуліну, білків і поліпептидів тання для концентрації та виділення субстанції панкреатичного походження, полімерних білків та інсуліну іонообмінної хроматографії на колонці з пігментів проводять на обернено-фазових силікасульфокатіонітом на першому етапі та такої рухогелях С8 або С18 з розміром часток не більше мої фази, як ізопропіловий спирт у кількості 1050мкм, переважно 15-20мкм, та з розміром пор не 50% та оцтова кислота у кількості 0,1-5,0%, на менше 9нм, переважно 12-15нм, а в якості рухомої другому етапі одержання субстанції інсуліну. Це фази використовують водно-органічний буферний призводить до етерифікації та дезамідації інсуліну розчин зі значенням рН не більше 3,5, який містить при сорбції спиртових екстрактів на сульфокатіоні12-21%, переважно 18-20%, ізопропанолу або ті та до великих втрат інсуліну (до 20%) внаслідок пропанолу та не більше 0,25М, переважно 0,01блокування поверхні сульфокатіонітного сорбенту 0,06М, ацетату натрію, ацетату амонію, сульфату ліпідами, фосфоліпідами та ліпід-протеіновими амонію або сульфату натрію. Питоме навантаженкомплексами. Використання при очистці від проіння на сорбент складає не більше 300г/л. На тресуліну та інших баластних білків на силікагелі С 16 тьому етапі очистку від інсулінспоріднених домівказаної рухомої фази, яка є низькоселективною шок проводять на обернено-фазових силікагелях щодо них, також призводить до втрат інсуліну (15С8 або С18 з розміром часток не більше 50мкм, 20%) та до низьких питомих навантажень на колопереважно 10-15мкм, та з розміром пор не менше нку (38,2г на 1л сорбенту). Низькі питомі наванта9нм, переважно 12-15нм, а в якості рухомої фази ження на колонку характерні для способувикористовують водно-органічний розчин, який прототипу і при очистці від інсулінспоріднених домістить 5-40% органічного модифікатора (пропамішок (13,8г). Це призводить до недостатньої ефенолу, ізопропанолу, етанолу або ацетонітрилу) і ктивності виробництва. Окрім того, такий спосіб кислоту оцтову з концентрацією не більше 0,5М, одержання препарату інсуліну короткої дії відзнапереважно 0,2-0,3М. Питоме навантаження на чається досить складною технологією. сорбент складає не більше 30г/л. Елюцію субстанЗавданням винаходу, який заявляється, є поції інсуліну проводять або в ізократичному режимі, ліпшення якості монокомпонентних препаратів або у градієнті концентрації органічного модифікаінсуліну на основі одержуваної свинячої субстантора протягом 6-10 об'ємів колонки, а одержану ції, спрощення технології та збільшення ефективсубстанцію інсуліну суспендують у воді, доводять ності виробництва. рН суспензії кислотою до 3,1-3,2, одержують розПоставлене завдання вирішується тим, що в чин інсуліну, готують водний розчин буферного та способі одержання препарату інсуліну короткої дії, ізотонічних агентів і консервантів та, перемішуючи, що включає водно-спиртову екстракцію підшлундоводять рН розчину лугом до 7,6-7,8, і додають кової залози свині, концентрацію та виділення суперший розчин до другого. бстанції інсуліну з екстракту, її хроматографічну Вирішення поставленого завдання ілюструєтьочистку від проінсуліну, інших баластних білків та ся прикладами конкретного виконання. від інсулінспоріднених домішок, кристалізацію, Приклад 1 приготування розчину одержаної субстанції інсуліНа першому етапі 38,1кг підшлункових залоз ну в кислоті, приготування водних розчинів інших свиней подрібнюють, екстрагують 190,5л 70% етакомпонентів та їх змішування, згідно з винаходом, нолу за рН=3,0 (використовують ортофосфорну хроматографічну очистку субстанції свинячого кислоту) за кімнатної температури протягом 1,5 інсуліну проводять на обернено-фазових силікагегодини. Баластні білки в екстракті осаджують за лях С8 або С18, як елюент на стадії очистки від рН=4,5 та відділяють сепаруванням, освітлений проінсуліну та інших баластних білків використоекстракт упарюють на вакуумному роторному пліввують водно-органічний розчин із значенням рН не ковому випарнику за температури кипіння 25°С до більше 3,5, який містить 12-21%, переважно 18об’єму 22,86л. Упарений екстракт фільтрують від 20%, ізопропанолу або пропанолу та не більше ліпідів через фільтрувальний картон. В освітлений 5 57689 6 екстракт для висалювання інсуліну за рН=2,5 допротягом 1,5 години. Потім розчином кислоти содають 3,352кг хлористого натрію. Одержаний висіл ляної з масовою долею 5,0 % доводять значення відокремлюють від маточного розчину, розчиняють рН до 5,9 і продовжують перемішування ще протяу 0,762л води, очищеної за рН=8,6, та додають гом 4,0 годин, після чого одержані кристали субсдля кристалізації 110г хлористого натрію. Отриматанції інсуліну відокремлюють від маточного розні кристали субстанції інсуліну розчиняють в 380 чину центрифугуванням. Кристали промивають мл води, очищеної за рН=8,6, та додають для пеочищеною водою і сушать ліофільне. Одержують рекристалізації 33,5г хлористого натрію. Одержані 4,149г субстанції інсуліну по технічній масі (3,943г кристали відокремлюють від маточного розчину в перерахунку на суху речовину) наступного склацентрифугуванням, одержують 9,525г по технічній ду: 98,8% основної речовини, 0,4% дезамідо(Амасі (4,762г в перерахунку на суху речовину) субс21)інсуліну, 0,8% інсулінспоріднених домішок, танції інсуліну-сирцю з вмістом інсуліну 92%. 0,6р.р.м. проінсуліну. 4,149г субстанції свинячого На другому етапі 9,525г по технічній масі інсуліну, суспендують в 530 мл води та, перемі(4,762г в перерахунку на суху речовину) субстанції шуючи, доводять рН 1М НСl до 3,1-3,2, одержуючи інсуліну-сирцю розчиняють в 41,9мл буферного таким чином розчин інсуліну. 4,73г гліцерину, 5,62г розчину А, який містить 0,05М натрію ацетату та натрію дигідрогенфосфату дигідрату, 0,535г на19% ізопропанолу, значення рН доводять до 2,5 трію хлориду, 7,23г м-крезолу розчиняють в 1,875л розчином соляної кислоти з масовою долею 10%. води, перемішуючи та додаючи 1М NaOH до знаОдержаний розчин субстанції інсуліну фільтрують чення рН=7,8. Перемішуючи, додають один розчин через мембранний фільтр з утримуючою здатністю до другого, доводять об'єм розчину водою до 0,2мкм, одержують 47,62мл розчину субстанції 2,68л, проводять стерилізуючу фільтрацію і розінсуліну-сирцю. Для очистки від проінсуліну, білків лив в асептичних умовах у флакони або інші корипанкреатичного походження, полімерних білків та стувачі і укупорюють. Аналіз одержаного препарапігментів одержаний розчин пропускають зі швидту інсуліну за допомогою аналітичної кістю потоку 0,7мл/хв. через хроматографічну ковисокоефективної рідинної хроматографії за гололонку діаметром 1 см, висотою 20см, яка заповневними показниками засвідчує високу якість препана 15,7мл силікагелю С18 (розмір пор 15нм, розмір рату: активність 39,8 МО/мл; вміст часток 15мкм). Після введення розчину субстанції (А21)дезамідоінсуліну - 0,38%; вміст інсулінспорідінсуліну колонку промивають 47,6мл буферного нених домішок - 0,83%; вміст високомолекулярних розчину А. Отримують 103мл розчину субстанції білків - 0,15%; осмоляльність - 250mOSмоль/кг. інсуліну, який містить 4,526г в перерахунку на суху При цьому рН препарату, який був одержаний за речовину з вмістом основної речовини 95% і вмісспособом, що заявляється, становить 7,35. том проінсуліну 3,8р.р.м. Приклад 2 На третьому етапі до 103мл розчину субстанПроцес виділення та очистки субстанції інсуліції інсуліну, який одержали на другому етапі, дону, а також одержання препарату інсуліну короткої дають 38мл очищеної води, і для очистки інсуліну дії на її основі ведуть аналогічно прикладу 1, але від інсулінспоріднених домішок одержаний розчин на другому та третьому етапах замість ізопропавводять зі швидкістю потоку 6мл/хв. через хроманолу використовують пропанол. Одержують 4,123г тографічну колонку діаметром 2см, висотою 50см, субстанції інсуліну по технічній масі (3,917г в пеяка заповнена 157мл силікагелю С18 (розмір пор рерахунку на суху речовину) наступного складу: 15нм, розмір часток 15мкм). Після введення субс98,7% основної речовини, 0,5% дезамідо(Атанції інсуліну колонку промивають 149мл буфер21)інсуліну, 0,8% інсулінспоріднених домішок, ного розчину В, який містить 0,25М кислоти оцто0,6р.р.м. проінсуліну. Аналіз одержаного препаравої і 10% ізопропанолу. Елюцію субстанції інсуліну ту інсуліну за допомогою аналітичної високоефекведуть протягом 2,6 години зі швидкістю потоку 8 тивної рідинної хроматографії за головними показмл/хв. у лінійному градієнті ізопропанолу від 12 до никами засвідчує також високу якість препарату: 18%, для чого змішують буферний розчин В з буактивність 39,5МО/мл; вміст ферним розчином С, який містить 0,25М кислоти (А21)дезамідоінсуліну - 0,45%; вміст інсулінспорідоцтової і 50% ізопропанолу. Регенерацію сорбенту нених домішок - 0,75%; вміст високомолекулярних на другому на третьому етапі проводять промибілків - 0,2%; осмоляльність - 245mOSмоль/кг. ванням буферним розчином В. Елюат, який місПриклад 3. тить інсулін, розбивають на фракції об'ємом 15мл. Процес виділення та очистки субстанції інсуліФракції аналізують методом високоефективної ну, а також одержання препарату інсуліну короткої рідинної хроматографії (методом ВЕРХ) на вміст дії на її основі ведуть аналогічно прикладу 1, але домішок. За результатами аналізу формують гона третьому етапі замість ізопропанолу викорисловну фракцію, яка містить 3,982г субстанції інсутовують етанол. Одержують 4,0г субстанції інсуліліну (380мл елюату з концентрацією інсуліну ну по технічній масі (3,802г в перерахунку на суху 10,48мг/мл) наступного складу: 98,9% основної речовину) наступного складу: 98,7% основної реречовини, 0,3% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,8% інсучовини, 0,4% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,9% інсулінлінспоріднених домішок. В розчин головної фраксцоріднених домішок, 0,9р.р.м. проінсуліну. Аналіз ції, перемішуючи, додають 381 мл розчину кислоти одержаного препарату інсуліну за допомогою аналимонної з масовою долею 2,0%, 4,19мл розчину літичної високоефективної рідинної хроматографії цинку хлористого з масовою долею 10%. Потім, за головними показниками засвідчує також високу перемішуючи, в розчин субстанції інсуліну додаякість препарату: активність - 39,7МО/мл; вміст ють розчин гідроокису натрію з масовою долею (А21)дезамідоінсуліну -0,35%; вміст інсулінспорід10,0% до значення рН=6,6. Розчин перемішують 7 57689 8 нених домішок - 0,85%; вміст високомолекулярних одержаної субстанції інсуліну не дозволяє викорибілків - 0,23%; осмоляльність - 253mOSмоль/кг. стовувати її для приготування препарату інсуліну. Приклад 4 Приклад 9 Процес виділення та очистки субстанції інсуліПроцес виділення та очистки ведуть аналогічну, а також одержання препарату інсуліну короткої но прикладу 1, але на другому етапі використовудії на її основі ведуть аналогічно прикладу 1, але ють буферний розчин А з вмістом ацетату натрію на третьому етапі замість лінійного градієнту ізоп0,5М . Одержують 3,734г субстанції інсуліну по ропанолу використовують ізократичний режим технічній масі (3,547г в перерахунку на суху речоелюції за концентраціїї ізопропанолу 15,5% об. вину) наступного складу: 98,2% основної речовиОдержують 4,157г субстанції інсуліну по технічній ни, 0,8% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,0% інсулінспомасі (3,947 г в перерахунку на суху речовину) наріднених домішок, 12р.р.м. проінсуліну. Якість ступного складу: 98,7% основної речовини, 0,6% одержаної субстанції інсуліну не дозволяє викоридезамідо(А-21)інсуліну, 0,7% інсулінспоріднених стовувати її для приготування препарату інсуліну. домішок, 0,5р.р.м. проінсуліну. Аналіз одержаного Приклад 10 препарату інсуліну за допомогою аналітичної виПроцес виділення та очистки, а також одерсокоефективної рідинної хроматографії за головжання препарату інсуліну короткої дії на її основі ними показниками засвідчує високу якість препаведуть аналогічно прикладу 1, але на другому етарату: активність 39,8МО/мл; вміст пі використовують буферний розчин А з вмістом (А21)дезамідоінсуліну - 0,55%; вміст інсулінспорідсульфату амонію 0,01М. Одержують 4,115г субснених домішок - 0,65%; вміст високомолекулярних танції інсуліну по технічній масі (3,924г в перерабілків - 0,14%; осмоляльність - 248mOSмоль/кг. хунку на суху речовину) наступного складу: 98,7% Приклад 5 основної речовини, 0,5% дезамідо(А-21)інсуліну, Процес виділення та очистки інсуліну, а також 0,8% інсулінспоріднених домішок, 0,3р.р.м. проінодержання препарату інсуліну короткої дії на її суліну. Аналіз одержаного препарату інсуліну за основі ведуть аналогічно прикладу 1, але на тредопомогою аналітичної високоефективної рідинної тьому етапі замість ізопропанолу використовують хроматографії за головними показниками засвідацетонітрил. Одержують 4,115г субстанції інсуліну чує високу якість препарату: активність по технічній масі (3,909г в перерахунку на суху 39,3МО/мл; вміст (А21)дезамідоінсуліну - 0,45%; речовину) наступного складу: 98,5% основної ревміст інсулінспоріднених домішок - 0,83%; вміст човини, 0,8% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,7% інсулінвисокомолекулярних білків - 0,25%; осмоляльність споріднених домішок, 0,6р.р.м. проінсуліну. Аналіз - 251mOSмоль/кг. одержаного препарату інсуліну за допомогою анаПриклад 11 літичної високоефективної рідинної хроматографії Процес виділення та очистки, а також одерза головними показниками засвідчує високу якість жання препарату інсуліну короткої дії на її основі препарату: активність - 39,4МО/мл; вміст ведуть аналогічно прикладу 1, але на другому ета(А21)дезамідо інсуліну - 0,79%; вміст інсулінспоріпі використовують буферний розчин А з вмістом днених домішок - 0,73%; вміст високомолекулярсульфату натрію 0,01М. Одержують 4,134г субстаних білків -0,2%; осмоляльність - 258mOSмоль/кг. нції інсуліну по технічній масі (3,928г в перерахунПриклад 6 ку на суху речовину) наступного складу: 98,8% Процес виділення та очистки субстанції інсуліосновної речовини, 0,6% дезамідо(А-21)інсуліну, ну ведуть аналогічно прикладу 1, але на другому 0,6% інсулінспоріднених домішок, 0,4р.р.м. проінетапі значення рН підвищують до 4,0. Внаслідок суліну. Аналіз одержаного препарату інсуліну за близькості до ізоелектричної точки інсуліну (рI = допомогою аналітичної високоефективної рідинної 5,3) не вдається одержати стабільний розчин його хроматографії за головними показниками засвідсубстанції. Процес припиняють. чує високу якість препарату: активність Приклад 7 39,4МО/мл; вміст (А21)дезамідоінсуліну - 0,48%; Процес виділення та очистки ведуть аналогічвміст інсулінспоріднених домішок - 0,63%; вміст но прикладу 1, але на другому етапі використовувисокомолекулярних білків - 0,15%; осмоляльність ють буферний розчин А з вмістом ізопропанолу - 247mOSмоль/кг. 10,0% об. Одержують 3,65г субстанції інсуліну по Приклад 12 технічній масі (3,467г в перерахунку на суху речоПроцес виділення та очистки, а також одервину) наступного складу: 97,7% основної речовижання препарату інсуліну короткої дії на її основі ни, 0,5% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,8% інсулінсповедуть аналогічно прикладу 1, але на другому етаріднених домішок, 15,1р.р.м. проінсуліну. Якість пі використовують буферний розчин А з вмістом одержаної субстанції інсуліну не дозволяє викориацетату амонію 0,05М. Одержують 4,145г субстанстовувати її для приготування препарату інсуліну. ції інсуліну по технічній масі (3,94г в перерахунку Приклад 8 на суху речовину) наступного складу: 98,8% осноПроцес виділення та очистки ведуть аналогічвної речовини, 0,5% дезамідо(А-21)інсуліну, 0,7% но прикладу 1, але на другому етапі використовуінсулінспоріднених домішок, 0,7р.р.м. проінсуліну. ють буферний розчин А з вмістом ізопропанолу Аналіз одержаного препарату інсуліну за допомо22,0% об. Одержують 4,275г субстанції інсуліну по гою аналітичної високоефективної рідинної хроматехнічній масі (4,061г в перерахунку на суху речотографії за головними показниками засвідчує вивину) наступного складу: 98,1% основної речовисоку якість препарату: активність - 39,3МО/мл; ни, 0,6% дезамідо(А-21)інсуліну, 1,3% інсулінсповміст (А21)дезамідоінсуліну - 0,44%; вміст інсулінріднених домішок, 52,2р.р.м. проінсуліну. Якість споріднених домішок - 0,71%; вміст високомолеку 9 57689 10 лярних білків - 0,18%; осмоляльність суліну менше 1,0р.р.м., що забезпечує поліпшення 241mOSмоль/кг. якості препаратів короткої дії на основі цієї субстаПриклад 13 нції; вихід по інсуліну збільшується на 27-44 %, Процес виділення та очистки субстанції інсуліпитомі навантаження на сорбент збільшуються на ну ведуть аналогічно прикладу 1, але на третьому другому етапі одержання субстанції свинячого етапі використовують буферні розчини В та С з інсуліну у 7-8 разів, а на третьому - у 2 рази, що вмістом кислоти оцтової 1,0М. Спостерігають різдозволяє збільшити ефективність виробництва кий ріст тиску на хроматографічній колонці внасліпрепаратів за технологією, що заявляється, прибдок полімеризації інсуліну. Процес припиняють. лизно на 30%; окрім того, заміна трипоточного Таким чином, при використанні рішення, що виробництва-на двохпоточне дозволяє спростити заявляється, вдається одержати субстанцію інсутехнологію та позбутися виконання ряду складних ліну з чистотою краще за 98,7%, з вмістом проіноперацій. Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601