Нанокомпозитний протипухлинний препарат

Нанокомпозитний протипухлинний препарат, що містить ЕМАР II, буфер у вигляді: 50 мМ NaP, рН 8,0; 150 мМ NaCl та декстран-70 у такому співвідношенні компонентів в продукті, об. %: - ЕМАР II - 0,4-0,5; - декстран-70 - 1,5±0,1; - буфер: 50 мМ NaP, рН 8,0; 150 мМ NaCl - решта. (19) (21) u201103202 (22) 18.03.2011 (24) 10.11.2011 (46) 10.11.2011, Бюл.№ 21, 2011 р. (72) КОРНЕЛЮК ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, БАБЕНКО ЛЕСЯ АНАТОЛІЇВНА, КОЗЛОВ ОЛЕКСАНДР ВАДИМОВИЧ, РЕЗНІКОВ ОЛЕКСАНДР ГРИГОРОВИЧ, ЧАЙКОВСЬКА ЛЮДМИЛА В'ЯЧЕСЛАВІВНА, ПОЛЯКОВА ЛЮБОВ ІВАНІВНА (73) ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, 3 NaP, pH 8,0; 150 мМ NaCl та декстран-70 у такому співвідношенні компонентів в продукті, об.%: - ЕМАР II - 0,4-0,5 %; (цільовий білок) - декстран-70-1,5 % ± 0,1 %; - буфер: 50 мМ NaP, pH 8,0; 150 мМ NaCl решта. Авторами методом біоінформативного аналізу були підібрані поєднання компонентів та їх співвідношення. Створені біонаносистеми будуть використані для доставки антиангіогенного цитокіна ЕМАР II до ендотеліальних клітин при нанотерапії злоякісних пухлин. Рекомбінантний білок ЕМАР II одержано в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України. ЕМАР II: рекомбінантний ендотеліальний та моноцитактивуючий поліпептид II - цитокін, який викликає ефект апоптозу, функціонує як інгібітор ангіогенезу і приводить до інгібування росту пухлин. Стабілізатор - полімерна матриця: декстран-70 Латинська назва речовини Декстран: Dextran Хімічна назва: полісахарид, який складається із розгалужених одиниць -D-глюкопіранозилу, що синтезуються із сахарози бактеріями Leuconostoc mesenteroides. Фармакологічна група речовини Декстран: замінники плазми та інших компонентів крові. За рахунок введення до складу препарату ЕМАР II досягається протипухлинний ефект на ріст карциноми передміхурової залози. ЕМАР II активує моноцити, викликає ефект апоптозу, гальмує ангіогенез. Властивості декстрану. Різні білки, в тому числі антитіла, зв'язуються з поверхнями чужорідних тіл, прискорюючи їх захоплення. Для уникнення опсонізації у ролі біосумісного покриття застосовують декстран - полісахаридний полімер, який складається із розгалужених одиниць -Dглюкопіранозилу. Декстран часто служить полімерним покриттям через його високу біосумісність (Lee K. M. et аl., 2002; Gamarra L. F. et al., 2005). Властивості поверхневого покриття нанопрепарату можуть впливати на захоплення їх клітинами-мішенями, наприклад злоякісними клітинами. При цьому позитивно заряджене покриття з декстрану приводить до кращого накопичення наночастинок у клітинах HeLa порівняно із негативно зарядженим (Villanueva A. et al., 2009). В лінійній частині молекули декстрану залишки глюкози з'єднані зв'язками між 1 та 6-м атомами вуглецю; розгалуження зумовлене зв'язками між 1 та 4-м, 1 та 3-м, 1 та 2-м атомами. Авторами експериментально встановлено наступне: Декстран-70 у складі нанокомпозитного препарату в кількості 1,5 % ± 0,1 % служить полімерним покриттям, кріопротектором та наповнювачем, зменшує пошкоджуючий ефект ліофілізації в якості стабілізуючого компоненту в нанокомпозитному протипухлинному препараті, а також забезпечує контрольовану доставку препарату в пухлинні клітини, підвищуючи цим самим активність препарату. Збільшення ж кількості декстрану-70 у складі пропонованого препарату призведе до того, що в 64374 4 препараті буде зайва кількість не зв'язаного з ЕМАР II декстрану, а зменшення його кількості суттєво знижує протипухлинну дію препарату. Буфер, що містить 50 мМ NaP, pH 8,0; 150 мМ NaCl використовували для виділення цільового білка ЕМАР II. При цьому забезпечується ізотонічність розчину нанокомпозитного протипухлинного препарату, що відповідає тілу людини. Склад препарату в перерахунку на одну дозу: Цільовий білок 0,1 мг, буфер: 50 мМ NaP, pH 8,0; 150 мМ NaCl, 15 мг ± 0,1 % декстрану-70. Кількість білка в препараті по 100 мкг в ампулі. Препарат зберігають при температурі +4 °С. Отриманий препарат являє собою ліофільний порошок білого кольору, що добре розчиняється у дистильованій воді та фізіологічному розчині протягом декількох секунд з утворенням прозорого розчину. Поєднання всіх компонентів з визначеним співвідношенням інгредієнтів дозволило отримати нанокомпозитний препарат ЕМАР II з декстраном70, що проявляє протипухлинний ефект в дозі 10 мкг/кг і забезпечує при цьому 77 % гальмування прогресу росту пухлини передміхурової залози. Даний ефект досягається завдяки технології отримання нових наноконструкцій з підвищеною активністю та стабільністю терапевтичного білка ЕМАР II. Перевагами нанокомпозитного препарату є низька токсичність, підвищена стабільність білка як терапевтичного агента, можливістьконтрольованого вивільнення активного лікарського компонента з полімерної матриці, пролонговані терапевтичні характеристики препарату. Лікарські препарати, у яких в якості активного інгредієнту виступають білки, в основному використовуються у вигляді ліофілізату. Процес заморожування-висушування може призвести до пошкодження структурної цілісності білкової молекули. Для зниження пошкоджуючого ефекту в якості стабілізуючого компоненту нанокомплексу, кріопротектора та наповнювача автори використали відомий полісахарид - декстран-70 - полісахарид, який складається із залишків -D-глюкопіранози і є біосумісним полімером. Одержання нанокомпозитного препарату протипухлинного цитокіна ЕМАР II з декстраном-70 включає виготовлення рекомбінантного білка ЕМАР II шляхом експресії в клітинах Е. соlі штаму BL21(DE3)pLysE, трансформованим введенням плазміди рЕТ30а, що кодує синтез вказаного білка в рідкому поживному середовищі з наступним виділенням та очисткою білка. Культивування проводять в рідкому поживному середовищі LuriaBertani (LB), яке містить 30 мкг/мл антибіотика канаміцину при 37 °С та інтенсивній аерації (180 об/хв.). При цьому використовують свіжоотримані трансформанти. Індукцію експресії рекомбінантного білка здійснювали шляхом додавання після 2 годин культивування бактеріальної культури в середовищі LB ізопропіл--тіогалактопіранозиду в концентрації 1,25 мМ та додатково культивували 4,5 год. Рекомбінантний білок виділяли в нативних умовах, осад бактеріальних клітин ресуспендували у буфері, що містив 50 мМ натрій-фосфатного буферу, рН 8,0; 500 мМ NaCl, 10 мМ імідазолу, 5 5 мМ -меркаптоетанолу, 50 мг/мл лізоциму, клітини руйнували ультразвуком, отриманий лізат центрифугували при 13000 g протягом 30 хвилин при температурі +4 °С, надосадову рідину наносили на хроматографічну колонку з Ni-NTA агарозою (Qiagen, США), колонку промивали 10 об'ємами буфера для нанесення (50 мМ натрій-фосфатного буферу, рН 8,0; 500 мМ NaCl, 10 мМ імідазолу, 5 мМ -меркаптоетанолу), а потім послідовно 5 об'ємами буферу для промивки (50 мМ натрійфосфатного буферу, рН 8,0; 500 мМ NaCl, 20 мМ імідазолу, 5 мМ -меркаптоетанолу), рекомбінантний білок елюювали ступінчатим градієнтом концентрацій імідазолу від 30 до 200 мМ, буфер для елюції містив 50 мМ натрій-фофатного буферу, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 30-200 мМ імідазолу, 5 мМ меркаптоетанолу, при цьому чистоту препарату білка контролювали методом денатуруючого SDSгель-електрофорезу, з подальшим забарвленням Куммасі синім. Колонку з Ni-NTA агарозою промили 5 об'ємами буферу для змиву (50 мМ натрійфофатного буферу рН 8,0, 1М NaCl, 500 мМ імідазолу). Фракції, у яких було виявлено білок, об'єднали і поставили на діаліз (активний) проти 300 мл буферу для діалізу (50 мМ натрій-фофатного буферу рН 8,0, 150 мМ NaCl) впродовж 20 год. при +4 °С. Далі провели відщеплення константної частини рекомбінантного білка ентерокіназою за стандартною методикою виробника (New England Biolabs) та додатково очистили на колонці з NiNTA агарозою та діалізували описаними вище методами. Очищений препарат після цього стерилізували методом холодної фільтрації через мембрани з розміром пор 0,22 мкм. і використовували для приготування сухого стабільного препарату. Аналіз бактеріальних білків проводили за допомогою SDS-гель-електрофорезу за методом Леммлі в денатуруючих умовах, використовуючи для їх розділення 15 %-й поліакриламідний гель із 0,1 % додецилсульфату натрію, використовуючи суміш маркерних білків фірми Fermentas (Литва). Попередньо методами спектрофотометричного, флуориметричного та біоінформатичного аналізу автори встановили, що комплекс ЕМАР II з декстраном-70 утворюється при додаванні останнього в концентрації 1,5 %. Тому для створення нанокомпозитного комплексу до розчину препарату рекомбінантного білка ЕМАР II додали 1,5 % декстрану-70, порошок (субстанція) у подвійних поліетиленових мішках для виробництва стерильних лікарських форм (Біотика AT, Республіка Словаччина). По 1 мл розчину препарату ЕМАР II стерильно розливали в ампули у ламінарному боксі. Ампули з препаратом ЕМАР II заморозили при -80 °С протягом 96 год. та ліофілізували. Режим ліофільного висушування комплексу ЕМАР II/Декстран-70: 1. Заморожування препарату до температури 20 °С. 2. Встановлення на плиту (попередньо охолоджена) в приладі для ліофільної сушки. 3. Охолодження до - 30 °С у вакуумі. 4. Охолодження до - 70 °С. Швидкість охолодження 10°С/год. Вакуум 100 mТоrr. 64374 6 5. Інкубація в зазначених умовах 1 год. 6. Зниження температури до - 20 °С, а потім до - 10 °С. Кожна стадія по 10 годин. 7. Нагрівання до температури +5 °С. Тривалість - 10 годин. 8. Запаювання ампул в атмосфері азоту. Тиск 760  50mbar. Склад препарату в перерахунку на одну дозу: Цільовий білок, буфер: 50 мМ NaP, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 1,5 % ± 0,1 % декстрану-70. Кількість білка в препараті по 100 мкг в ампулі. Зберігати при +4 °С. Отриманий препарат представляє собою ліофільний порошок білого кольору, добре розчиняється у дистильованій воді та фізіологічному розчині протягом декількох секунд з утворенням прозорого розчину. Вперше, спільно з Інститутом ендокринології та обміну речовин ім. В. П. Комісаренка АМН України проведено дослідження нанокомпозитних препаратів ЕМАР II на моделі трансплантованих фрагментів аденокарциноми простати людини та виявлено їх антипухлинний ефект. Новий біонанокомпозитний препарат ЕМАР II має ряд переваг перед існуючими протипухлинними препаратами, а саме: низьку токсичність, підвищену стабільність білка як терапевтичного агента, можливість контрольованого вивільнення активного лікарського компонента з полімерної матриці, пролонговані терапевтичні характеристики препарату. Тестування протипухлинної активності ЕМАР II проводили на мишах лінії СВА (маса тіла 18-22 г) нефро-субкапсулярним методом (підкапсулярний тест Богдена), що полягає у гетеротрансплантації ксенографтів злоякісної пухлини, в даному випадку аденокарциноми людини, під капсулу нирки мишей лінії СВА. Зразки малігнізованих тканин були взяті у хворих під час радикальної простатектомії пухлин простати, що виконувалася в Київському обласному онкологічному центрі. Хворі не отримували неоадьювантну терапію. Тканини пухлин відносились до помірно диференційованих (6 балів за шкалою Гліссона). Видалену під час простатектомії пухлинну тканину доставляли в лабораторію в охолодженому середовищі MEM (Serva), що містить сольову суміш Хенкса і буфер HEPES. Пухлину нарізали на шматочки масою 1 мг і трансплантували під капсулу однієї з нирок мишей (по 2 ксенографти). Після триденного періоду вільного росту пухлини мишам вводили підшкірно в об'ємі близько 0,2 мл розчин нанопрепарату ЕМАР II в мікродозах 1-10 мкг/кг маси тіла, в ізотонічному розчині натрію хлориду, а контрольним тваринам - розчинник впродовж подальших трьох днів. Через 24 г після останньої ін'єкції мишей знеживлювали диетиловим ефіром. Вилучені трансплантати зважували, фіксували в 4 %-ному параформальдегіді для гістологічного або в розчині Буена для гістохімічного дослідження, заливали в парафінові блоки та готували серійні зрізи, які фарбували гематоксиліном та еозином або гематоксиліном та реактивом Шиффа. Протипухлинний ефект оцінювали за ступенем гальму 7 вання зростання ксенографтів, порівнюючи величини приросту їх маси в дослідній і контрольній групах. Істотним вважали зменшення приросту маси ксенографта в групі мінімум на 25 %. Достовірність різниці (Р