Застосування вітамінної композиції, що містить вітаміни с та к3, як засобу для лікування вірусних інфекцій

Застосування вітамінної композиції, що містить вітаміни С та К3, як засобу для лікування вірусних інфекцій. (19) (21) u201107026 (22) 03.06.2011 (24) 26.12.2011 (46) 26.12.2011, Бюл.№ 24, 2011 р. (72) РИБАЛКО СВІТЛАНА ЛЕОНТІЇВНА, КОЗАК ВЯЧЕСЛАВА ВАДИМІВНА, ОРЛОВСЬКИЙ АЛЕКСІЙ АРКАДІЙОВИЧ, ДЯДЮН СВІТЛАНА ТЕРЕНТІЇВНА, ЖАРКОВА ЛЮДМИЛА ДМИТРІВНА, МАК 3 66165 композиції С+Кз на характер росту клітинних культур, інфікованих вірусами. Досліди проводять на перещеплюваній культурі клітин НГУК-1, одержаній з невриноми гесерова вузла щура, індукованої трансплацентарним введенням нітрозоетил сечовини. Культура одержана з Інституту цитології РАН. Композицію вітамінів С (аскорбінова кислота)+К3 (вікасол) у співвідношенні 100:1 вносять в добову культуру клітин. Надалі культури інфікують вірусом герпесу звичайного (HSV), гепатиту С 4 (HCV) та вірусом імунодефіциту людини (HIV). Через 24 години інкубації клітини фіксують і готують препарати для цитологічного анализу. Контролями були: 1) інтактні клітини; 2) клітини, оброблені лише вітамінною композицією; 3) клітини, інфіковані HSV (вірус герпесу), HCV (вірус гепатиту С) і HIV (вірус імунодефіциту людини) або їх комбінаціями, але не оброблені вітамінною композицією. Визначають характеристики росту культур, результати наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Показники мітотичного режиму та ефекту аутошизису в культурах НГУК-1 після інкубації з вітамінами і вірусами Вплив Мітотичний індекс, % 30±0,7 Аномальні мітози, % Характер моношару від усіх мітозів клітин 22,2±1,8 Рівномірний Інтактні клітини Вітамінна композиція HIV HCV 15±0,6 20,2±1,8 35,3±0,8 42,3±0,9 48,3±2,2 44,0±2,1 HSV 10,2±0,5 HIV+(C+K3) 2,0±0,1 HCV+(C+K3) 1,6±0,1 HSV+(C+K3) 7,0±0,3 Рівномірний Рівномірний Рівномірний Поодинокі клітини 48,6±2,2 та ріст острівцями 16,6±1,4 Ріст острівцями Не виявлені (із-за Поодинокі клітини низького МІ) та ріст острівцями Поодинокі клітини 20,0±1,9 та ріст острівцями Видно, що зниження мітотичного індексу спостерігається в контрольних культурах, оброблених вітамінною композицією С+К3 (що не дивно, оскільки використана культура клітин має пухлинне походження), а також при заражені вірусом герпеса (ефект 1). Водночас, НСV та HIV самі по собі, навпаки, стимулююсь мітотичну активність порівняно з інтактними культурами та контрольними культурами, що були оброблені композицією (ефект 2). Статистична значущість обох ефектів, особливо другого, дуже висока (відповідні значення t-критерію Стьюдента становлять t1=4,1; t2=10). Внесення вітамінної композиції в культури інфікованих вірусами клітин в усіх випадках призводить до зниження мітотичного індексу порівняно з відповідними інфікованими контролями, причому для культур, інфікованих HCV та HIV, таке зниження було статистично надзначущим (tHCV=44,9; tHIV=41,3), а для HSV - високозначущим (tHSV=5,5). В усіх вище зазначених контрольних культурах число атипових клітин, які є характерними для аутошизису (атипових клітин зі зменшеним об'ємом цитоплазми, зменшеним розміром ядер, крайовою конденсацією ядерного хроматину та збільшеними за розміром ядерцями), коливається від 0,8 % в інтактних культурах до 1,9 % в культурах, інфікованих HIV. При цьому характер моношару залишається без змін, крім культур, заражених HSV, де спостерігається ріст острівцями, а також поодинокі клітини, що відповідає звичайному характеру росту клітинних культур при даній інфекції. Особливу увагу звертає на себе той факт, що в культурах, заражених вірусами клітин, що були піддані дії вітамінної композиції, патологічні мітози Кількість атипових клітин, % 0,8±0,2 1,8±0,1 1,9±0,1 0,9±0,2 0,8±0,1 16,6±0,5 8,2±0,4 19,0±1,1 зустрічаються набагато рідше, ніж в контрольних інфікованих культурах, або навіть зовсім не виявляються (у випадку HCV-інфекції), хоча при дії вітамінної композиції на незаражені клітини відсоток патологічних мітозів практично не змінюється. В сукупності з дворазовим збільшенням відсотку патологічних мітозів під дією кожного з випробуваних вірусів за відсутності вітамінної композиції, цей факт свідчить про елімінацію вітамінною композицією з клітинної популяції саме вражених вірусами клітин, що вони і є головними "постачальниками" патологічних мітозів. Таким чином, як і при пухлинному процесі, внесення вітамінної композиції в культуру інфікованих вірусами клітин пригнічує їх мітотичну активність і сприяє появі атипових клітин та інших ознак, характерних для аутошизису. Приклад 2. Вплив вітамінної композиції на репродукцію HIV досліджують на моделі гострої HIVінфекції в клітинах чутливої до HIV Т-лімфоїдної лінії МТ-4, інфікованих лабораторним штамом HIV1/BIII. Композицію С+К3 вносять в культуру клітин в кінцевому розведенні 1:50, тобто до 1 мл культури клітин МТ-4 додають 0,02 мл С+К3. Через 30 хвилин клітини інфікують HIV в дозі 100 ID50. Після 5-добового культивування з оброблених та не оброблених вітамінною композицією клітин збирають вірусну суспензію і визначають в ній інфекційний титр вірусу методом кінцевих розведень. Крім того, визначають методом імуноферментного аналізу вміст вірусного білка р24 в різних розведеннях зібраної суспензії HIV. Результати наведено в таблиці 2. 5 66165 6 Таблиця 2 Вплив вітамінної композиції на репродукцію HIV Обробка клітин HIV+С+К3 HIV (контроль) Визначення білка р24 в розведеннях зібраної суспензії HIV (одиниць екстинкції)* -1 -2 -3 -4 -5 -6 10 10 10 10 10 10 3,567 1,105 0,195 0,078 0,055 0,041 4,210 2,306 1,215 0,675 0,195 0,110 Інфекційний титр (lg ID50) 3,5 6,1 Примітка * - Cut off (лінія відрізу, чутливість методу) 0,087 од екстинкції. З таблиці 2 видно, что вітамінна композиція пригнічує репродукцію HIV на 2,6 lg ID50. Цьому відповідає і значне пригнічення експресії білка р24 HIV в середньому по клітинній популяції. Такі явища, мабуть, відбуваються за рахунок елімінації вірусінфікованих клітин в результаті їх деградації під дією вітамінної композиції. Все це дає змогу припустити, що введення в схему лікування HIVінфекції вітамінної композиції С+К3 сприятиме покращенню перебігу інфекційного процесу або ж його стабілізації. Приклад 3. Було висунуто припущення, що ефект аутошизису вірусінфікованих клітин має місце також і при інших вірусних інфекціях. З метою перевірки цього припущення проводять дослідження протигрипозної активності вітамінної композиції in vivo на моделі грипозної пневмонії у мишей. Для цього використовують штам вірусу грипу (IV-Influenza Virus) A/FM/1/47 (H1N1), адаптований до легень білих нелінійних мишей, який пройшов 15 пасажів на мишах і мав інфекційний титр 4 lg LD50. При зараженні мишей таким вірусвмісним матеріалом на протязі 5 діб спостерігається 100 %-на летальність тварин. Випробування протигрипозної активності вітамінної композиції in vivo проводять за двома схемами: профілактичною і терапевтичною. Для цього мишам вводять внутрішньом'язово 0,2 мл розчину вітамінної композиції (группа 1) або стандартний препарат (препарат порівняння) таміфлю (TamifluOseltamivir) фірми Hoffmann la Rosh no 0,7 мг/кг ваги (група 2). Через 24 години після введення препарату (терапевтична схема) або за 24 години до введення препарату (профілактична схема) мишей інфікують вірусом грипу інтраназально в -3 дозі 10 LD50, тобто розведенням 10 вихідного вірусвмісного матеріалу. В експерименті визначають параметри смертності тварин, а також титр вируса грипу в легенях мишей за допомогою загальноприйнятого методу титрування екстрактів легеневої тканини на курячих ембріонах. Результати наведено в таблиці 3. Таблиця 3 Профілактичний та терапевтичний ефекти дії вітамінної композиції на моделі експериментальної грипозної інфекції in vivo Діючі агенти С+К3+IV С+К3+таміфлю+IV Таміфлю+IV IV (контроль) Терапевтична схема IV+С+К3 IV+С+К3+таміфлю IV+таміфлю IV (контроль) Кількість мишей Кількість загиблих Кратність за- Індекс ефективності Титр IV, в групі хисту (КЗ) (IE) (%) lg EID50 Всього % Профілактична схема 10 0 0 Повний захист 100,0 2,0 10 2 20 5,0 80,0 2,0 10 2 20 5,0 80,0 1,5 12 12 100 1 0 4,0 10 10 10 10 2 0 3 10 З таблиці 3 видно, що вітамінна композиція повністю захищає тварин від летальної грипозної інфекції при профілактичній схемі введення. Препарат таміфлю і комбіноване введення препарату таміфлю з вітамінною композицією при профілактичному введенні захищає мишей від інфікування грипом з однаковим індексом ефективності. При терапевтичній схемі введення повний захист від летальної грипозної інфекції спостерігається лише в групі з комбінованим застосуванням тест-агентів, однак і при їх окремому застосуванні активність 20 0 30 100 5,0 Повний захист 3,3 1 80,0 100,0 70,0 0 2,0 2,0 2,0 4,0 вітамінної композиції виявляється щонайменш не нижчою від активності препарату порівняння таміфлю. Таким чином, з одержаних даних можна зробити висновок, що як при профілактичному, так і (меншою мірою) при терапевтичному застосуванні вітамінної композиції реєструється ефективний захист тварин від грипозної інфекції у порівнянні з рівнем стандартного протигрипозного препарату таміфлю. Висновок. 7 Результати проведених досліджень дають змогу вважати, що вітамінний комплекс (С+К3) в умовах як in vitro, так і in vivo здатний специфічно елімінувати з клітинної популяції саме ті клітини, в яких хоча б частково експресований вірусний матеріал. Цей ефект спостерігається при експериментальних інфекціях, спричинених вірусами принципово різних таксономічних груп. Така елімінація заражених клітин веде до різкого зниження інфекційних титрів вірусів в ростовому середовищі клітинних культур та з уражених тканинах тварин. Завдяки цілеспрямованій елімінації практично всіх клітин, уражених вірусами, застосовувана корисна модель може розглядатися як перспективний засіб щодо радикального лікування персистентних вірусних інфекцій, що, як відомо, не досягається жодним з досі відомих в інфекційній патології лікарських засобів. Разом з тим, зазначені вище ефекти Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 66165 8 позитивно впливають на виживаність тварин, як видно, лише в тих випадках, коли здатність уражених тканин до регенерації перевищує цитодеструктивний потенціал вітамінного комплексу. Джерела інформації: 1. Zhang W., Negoro Т., Satoh К., Jiang Y., Hashimoto K., Kukuchi H., Nishikawa H., Miyata Т., Yamamoto Y., Nakano K., Yasumoto E., Nakayachi Т., Mineno K., Satoh Т., Sakagami H. Synergistic cytotoxic action of vitamin С and vitamin K3 // Anticancer Res.-2001.-21(5). - P. 3439-3444. 2. Baddour L., Gorbach S.L. Therapy of infectious diseases. - Elsevier Science, 2003.-605 p. 3. Gillotaaux J., Jamison J., Arnold D. et al. Cancer cell necrosis by autoschisis: synergism of antitumor activity of vitamin С and vitamin K3 on human bladder carcinoma T24 cells // Scanning.-1998.-20(8). - P. 564-575. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601