Спосіб стандартизації чистотілу звичайного (chelidonium majus l.) в багатокомпонентних рослинних сумішах

Спосіб стандартизації чистотілу звичайного (Chelidonium majus L.) в багатокомпонентних рослинних сумішах з використанням методу високоефективної рідинної хроматографії, який відрізня 3 яблучної кислоти в сировині трави чистотілу звичайного. За розробленою методикою було проаналізовано траву чистотілу звичайного вітчизняного виробництва. Зокрема, було проаналізовано траву чистотілу в пачках по 50 г (Виробник: ЗАТ "Ліктрави" (серії: 10111, 20111, 30311)). Згідно з отриманими даними, в усіх пробах було ідентифіковано та кількісно визначено кофеїляблучну кислоту. її вміст в досліджуваній сировині знаходився в межах від 0,0444±0,0021 % до 0,0604±0,0029 % в перерахунку на висушену сировину. Процес ідентифікації та кількісного визначення кофеїл-яблучної кислоти, як компонента сировини чистотілу звичайного в багатокомпонентних рослинних сумішах, полягає в знаходженні умов для хроматографічного розділення кофеїл-яблучної кислоти як компонента чистотілу звичайного та біологічно активних речовин інших рослин. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити ідентифікацію сировини трави чистотілу звичайного в багатокомпонентних рослинних сумішах шляхом підтвердження наявності кофеїл-яблучної кислоти та визначення її вмісту, і таким чином забезпечити можливість стандартизації багатокомпонентних рослинних сумішей, до складу яких входить сировина трави чистотілу звичайного. Поставлена задача вирішується тим, що запропонована ідентифікація та кількісне визначення кофеїл-яблучної кислоти як компонента чистотілу звичайного за допомогою методу ВЕРХ в присутності біологічно активних речовин інших рослин. Це досягається застосуванням твердофазної екстракції для очищення досліджуваних розчинів від заважаючих речовин. При цьому використовується градієнтне елюювання з використанням воднометанольної рухомої фази, застосування якої дозволяє добитися розділення піків кофеїл-яблучної кислоти чистотілу звичайного та біологічно активних речовин інших рослин. Приклади конкретного виконання. Приклад 1: Приготування досліджуваного розчину: До 1 г рослинної суміші наступного складу: трави чистотілу звичайного - 1 г, трави деревію звичайного - 1 г, листя м'яти перцевої - 1 г, квіток ромашки лікарської - 1 г, квіток нагідок лікарських 1 г, квіток пижмо звичайного - 1 г та квіток лаванди колоскової - 1 г, додають 25 мл 40 % етилового спирту та екстрагують в ультразвуковій бані "Transsonic Т 460/Н" (Німеччина) при температурі 40 °C протягом 30 хвилин. Отриманий розчин фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 5 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 5 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. 67509 4 По 5 мкл досліджуваного розчину та розчину достовірного зразку кофеїл-яблучної кислоти поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі, обладнаному УФ-детектором в наступних умовах: колонка С18 Х-Теrra, розміром 150 мм × 4,6 мм, розмір частинок 5 мкм; температура колонки - 35 °C; довжина хвилі детектування - 330 нм; швидкість потоку рухомої фази - 1 мл/хв; об'єм проби, що вводився - 5 мкл; рухома фаза: Час хроматографуЕлюент А, % вання (хв.) 0-1 100 1-40 100→76 40-45 76→20 45-50 20 50-65 100 Елюент Б, % 0 0→24 24→80 80 0 Елюент А: метанол - вода (5:95) (рН суміші доведено до 2,3 ортофосфорною кислотою); Элюент Б: метанол. Вміст кофеїл-яблучної кислоти в досліджуваній багатокомпонентній рослинній суміші (в %) обчислюється за наступною формулою: A пр  Сст  25  100  100 ; X А ст  mпр  100  W  де Апр - площина піку кофеїл-яблучної кислоти на хроматограмі досліджуваного розчину; Аст - площина піку кофеїл-яблучної кислоти на хроматограмі розчину порівняння кофеїл-яблучної кислоти; Сст - концентрація кофеїл-яблучної кислоти в розчині порівняння кофеїл-яблучної кислоти, г/мл; mпр - наважка досліджуваної суміші, г; W - втрата в масі при висушуванні досліджуваної рослинної суміші. Приготування розчину порівняння кофеїляблучної кислоти: 0,005 г (точна наважка) достовірного зразку кофеїл-яблучної кислоти вміщують в мірну колбу місткістю 25 мл, розчиняють в 15 мл 40 % етилового спирту, доводять до мітки тим же розчинником та перемішують. В мірну колбу місткістю 10 мл вміщують 1 мл отриманого розчину, доводять до мітки метанолом та перемішують. На хроматограмі досліджуваного розчину повинен бути присутній пік, час виходу якого відповідає часу виходу піку кофеїл-яблучної кислоти на хроматограмі розчину порівняння кофеїл-яблучної кислоти. На підставі експериментальних даних для сировини трави чистотілу звичайного нами рекомендований наступний граничний вміст кофеїляблучної кислоти: не менше 0,03 % в перерахунку на висушену сировину. За вказаних вище умов було проаналізовано досліджувані розчини, приготовлені наступним чином: Модельна суміш без вмісту чистотілу звичайного. До 1 г рослинної суміші наступного складу: трави деревію звичайного - 1 г, листя м'яти перцевої - 1 г, квіток ромашки лікарської - 1 г, квіток нагідок лікарських - 1 г, квіток пижмо звичайного - 1 г 5 67509 та квіток лаванди колоскової - 1 г, додають 25 мл 40 % етилового спирту та екстрагують в ультразвуковій бані "Transsonic Т 460/Н" (Німеччина) при температурі 40 °C протягом 30 хвилин. Отриманий розчин фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 5 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 5 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. Екстракт трави чистотілу звичайного. До 0,2 г сировини додають 25 мл 40 % етилового спирту та екстрагують в ультразвуковій бані "Transsonic T 460/Н" (Німеччина) при температурі 40 °C протягом 30 хвилин. Отриманий розчин фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. До 5 мл отриманого розчину додають таку кількість води, щоб концентрація спирту становила 5 %, та пропускають отриманий зразок через попередньо активований (метанол 5 мл) та промитий 10 мл води патрон для твердо-фазної екстракції "Superclean lc-18 SPE Tubes 2 ml" виробництва фірми Supelco (США). Патрон промивають 10 мл 5 % етилового спирту. Пробу із патрону вимивають 10 мл метилового спирту. Отриманий аналіт концентрують за допомогою випаровування до об'єму 5 мл та фільтрують через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм. 6 Хроматограми стандартного розчину кофеїляблучної кислоти, екстракту трави чистотілу звичайного, досліджуваного розчину та модельної суміші без вмісту трави чистотілу звичайного представлені на фіг.1, фіг.2, фіг.3 та фіг.4 відповідно. За даних умов аналізу пік кофеїл-яблучної кислоти має час виходу біля 29,2 хвилин (фіг.1). На хроматограмах екстракту трави чистотілу звичайного та досліджуваного розчину присутній пік кофеїл-яблучної кислоти (фіг.2 та фіг.3 відповідно), на хроматограмі модельної суміші без вмісту трави чистотілу (фіг.4) - даний пік відсутній. На підставі отриманих даних зроблено висновок, що у рослинній суміші, до складу якої входять трава чистотілу звичайного, трава деревію звичайного, листя м'яти перцевої, квітки ромашки лікарської, квітки нагідок лікарських, квітки пижмо звичайного та квітки лаванди колоскової, присутність та вміст трави чистотілу звичайного можна визначати за наявністю та кількісним вмістом кофеїл-яблучної кислоти. Корисна модель обумовлює можливість ідентифікації та визначення кількісного вмісту сировини трави чистотілу звичайного в багатокомпонентних рослинних сумішах, до складу яких входить трава чистотілу звичайного, трава деревію звичайного, листя м'яти перцевої, квітки ромашки лікарської, квітки нагідок лікарських, квітки пижмо звичайного та квітки лаванди колоскової за наявністю та вмістом кофеїл-яблучної кислоти як фізіологічно активного компонента, що присутній в траві чистотілу звичайного. Порівняння способів іденідентифікації у прототипі та винаході наведено в таблиці. Таблиця Характеристика способів стандартизації трави чистотілу звичайного № п/п 1 2 Об'єкт Компонент сума алкалоїНайближчий дів, в перерааналог хунку на хелідонін Корисна модель Об'єкти дослідження Моносировина трави чистотілу звичайного Багатокомпонентні рослинні суміші, до складу яких входять: трава чистотілу звичайного, трава деревію звикофеїл-яблучна чайного, листя м'яти перцевої, квітки кислота ромашки лікарської, квітки нагідок лікарських, квітки пижмо звичайного та квітки лаванди колоскової Джерела інформації: 1) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 1. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К.: Моріон, 2007. - 1128 с. 2) Компендиум. Лекарственные препараты 2007: т. 2. / За ред. В.М. Коваленка, О.П. Вікторова. - К.: Моріон, 2007. - 1126 с. 3) Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / Відп. ред. Гродзінський А.М. - К.: Головна ред. УРЕ, 1989. - 544 с. Метод визначення Метод УФ-спектрофотометрії. Можливість кількісної стандартизації моносировини трави чистотілу звичайного; неспецифічне визначення Метод ВЕРХ. Можливість кількісної стандартизації сировини та багатокомпонентних рослинних сумішей трави чистотілу звичайного; специфічне визначення 4) Универсальная энциклопедия лекарственных растений / Сост. Путырский И., Прохоров В. М.: "Дом". - 2000. - 656 с. 5) Gilca М., Gaman L, Panait E., Stoian I., Atanasiu V. Chelidonium majus-an integrative review: traditional knowledge versus modern findings // Forsch Komplementmed.-2010. - Vol. 17(5). - P. 241248. 6) Boegge S., Kesper S., Verspohl E., Nahrstedt A. Reduction of ACh-induced contraction of rat 7 67509 isolated ileum by coptisine, (+)-caffeoylmalic acid, Chelidonium majus, and Corydalis lutea extracts // Planta Med. - 1996. - Vol. 62(2). - P. 173-174. 7) Hahn R., Nahrstedt A. Hydroxycinnamic acid derivatives, caffeoylmalic and new caffeoylaldonic 8 acid esters, from Chelidonium majus // Planta Med.1993. - Vol. 59(1). - P. 71-75. 8) Державна Фармакопея України / ДП "Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е вид. Доповнення 2. - X.: ДП "Науково-експертний фармакопейний центр", 2008. - 620 с. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601