Спосіб очищення та концентрування реовірусу

Реферат: Спосіб очищення та концентрування реовірусу курей включає використання центрифугування з ПЕГ-6000 (поліетиленгліколь), обробку ультразвуком і ультрацентрифугування через розчин сахарози. Використовують культуральні розплідки штамів. Культуральну рідину утримують з 7 % ПЕГ-6000 (поліетиленгліколь) від загального об'єму, після чого центрифугують з 7 % ПЕГ. Отримані осади ресуспензують у TSE-буфері, піддають дії ультразвуку і центрифугують на ультрацентрифузі. UA 73381 U (12) UA 73381 U UA 73381 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної медицини і, зокрема, стосується способу одержання антигену реовірусу, який використовується для виготовлення діагностичних наборів для виявлення антитіл у сироватці крові курей методом імуноферментного аналізу (ІФА). Існує нагальна проблема у розробці високочутливого вітчизняного експрес-методу діагностики реовірусної інфекції, що прискорить проведення наукових досліджень і дасть змогу скоротити тривалість оцінки епізоотичної ситуації і напруженості імунітету у щеплених курей. Реалізація ідеї створення діагностичних наборів ІФА потребує вирішення складних і різноманітних завдань, основним з яких є очищення і концентрування вірусу, який наносять на планшети для ІФА як антиген. Відомий спосіб очищення та концентрування реовірусу, запропонований О.І. Купріяновим [1, 2], першим етапом якого є попереднє очищення та концентрування ПЕГ-8000 (поліетиленгліколем). Наступна екстракція вірусного матеріалу здійснюється двома способами: з використанням хлороформу або трифтортрихлоретану (фреон 113) при низько швидкісному центрифугуванні. На завершальному етапі вірус осаджували через 20 % розчин сахарози. Ці способи мають кілька недоліків: у першому випадку - при використанні хлороформу для очищення, спостерігається короткочасна активність антигену при використанні його в непрямому ІФА, у другому випадку - висока собівартість матеріалів, триразовий процес екстракції трифтортрихлоретаном (фреон 113). Найближчим аналогом способу очищення та концентрування реовірусу, що пропонується, може бути спосіб, заявлений у патенті UA № 60381 [3]. Це - спосіб очищення та концентрування вірусу ентериту гусей, який включає очищення та концентрування парвовірусу гусей з використанням ценрифугування вірусного матеріалу з ПЕГ-6000 (поліетиленгліколем), обробку його ультразвуком та детергентом та ультрацентрифугуванням через градієнти густини сахарози-хлористого цезію. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб очищення та концентрування реовірусу курей для виготовлення діагностикуму ІФА. Спосіб виконується таким чином. Для отримання очищеного антигену реовірусу використовують культуральну розплідку 3 штамів "1733" та "Вг-06" з титром 6,0-6,5 lg ТЦД50/СМ . Культуральна рідина утримується з 7 % ПЕГ-6000 (поліетиленгліколь) від загального об'єму 16 год. за температури 4 °C. Культуральна розплідка центрифугується з 7 % ПЕГ-6000 протягом 30 хв. при 17000 g (кутове прискорення) за температури 4 °C. Отримані осади ресуспензуються у TSE-буфері (трис-сульфатний буфер) з рН 7,6. На наступному етапі вірусна суспензія піддається дії ультразвуку частотою 22 кГц протягом 40 секунд. Надалі ресуспензовані проби з вірусом центрифугуються на ультрацентрифузі через розчин 30 % сахарози при 70000 g при температурі 4 °C протягом 2 год. Приклад 1. Однорідність і чистоту отриманого антигену підтверджували проведенням електронної мікроскопії, методом негативного контрастування (див. фіг.). При електронно-мікроскопічних дослідженнях, у зразках було виявлено віріони розміром 75 нм, які за морфологічними характеристиками відносяться до реовірусу. Приклад 2. Контроль активності та специфічності. Отриманий антиген реовірусу сенсибілізували на планшети у концентрації 0,02-0,05 мг/мл. Сенсибілізацію антигену на планшет проводили у буфері КББ (карбонатно-бікарбонатний буфер) рН 9,6. Вірусний матеріал у робочому розведенні наносили на планшет, інкубували протягом 16 годин при температурі 4 °C. Як блокуючий розчин використовували 10 % конячу сироватку, розведену у буферному розчині (0,05М тріс-НСl+0,2М NaCl) +0,1 % твін-20 і проводили непрямий варіант ІФА з позитивними референтними сироватками, титр яких становив не менше ніж 1:3200, що вказує на достатню активність антигену. Як детекторні антитіла використовували антивидовий імунопероксидазний кон'югат проти імуноглобулінів курей (виготовлений філіалом "Медгамал" ДП НДІЕМ їм. М.Ф. Гамалєї РАМН). Як субстрат застосовували АБТС (2,2`-Azino-bis(3ethilbenzothiazoline-6-sulfonic acid). Постановку ІФА проводили за стандартною методикою, облік реакції здійснювали за допомогою спектрофотометру при довжині хвилі 405 нм. У специфічних гетерологічних сироватках, що входять до складу комерційних наборів фірми BioChek та "Сінко" ВНДІЗТ (для визначення антитіл до інфекційного бронхіту курей, синдрому зниження несучості, мікоплазми, ньюкаслської хвороби, хвороби Гамборо) не виявлено позитивних та сумнівних титрів до реовірусної інфекції, що вказує на специфічність отриманого антигену по відношенню до гомологічних антитіл. Приклад 3. Оцінка стабільності антигену при зберіганні на планшетах. Перевірку проводили через кожні 7 днів протягом 10 тижнів в умовах штучного старіння при температурі 37 °C. 1 UA 73381 U 5 10 15 Активність реовірусного антигену, очищеного та концентрованого з використанням ультразвуку, протягом досліджуваного періоду не знижувалася. Таким чином, спосіб очищення та концентрування реовірусу курей, дозволяє отримати однорідний антиген, який відрізняється активністю, специфічністю та стабільністю і є ефективним при виготовленні діагностикумів ІФА для виявлення антитіл до реовірусу. Джерела інформації: 1. Куприянов А.И. Получение антигена реовирусной инфекции птиц для постановки непрямого варианта ИФА / Куприянов А.И., Андрейчук Д.Б, Старов С. К./ Материалов научнопрактической конференции "Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных". - Минск, 5-6 октября 2000г. - С. 131-133. 2. Методические указания по выявлению антител к возбудителю реовирусной инфекции птиц в сыворотках крови кур методом одного разведения в непрямой реакции иммуноферментного анализа / [Куприянов А.И., Мудрак Н.С., Дрыгин В. В., Старов С. К.].- ФГУ ВНИИЗЖ. - Владимир.-2008.-С.88-94 3. Патент UA № 60381, А61К39/135, C12N 15/50, А61К39/225, С07К 14/17, А61К 31/28. Спосіб очищення та концентрування вірусу ентериту гусей. Опубл. 25.06.2011, бюл. № 12. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб очищення та концентрування реовірусу курей, що включає використання центрифугування з ПЕГ-6000 (поліетиленгліколь), обробку ультразвуком і ультрацентрифугування через 30 % розчин сахарози, який відрізняється тим, що використовують культуральні розплідки штамів "1733" або "Вr-06" з титром не нижче 6,0-6,5 lg 3 ТЦД50/См , культуральну рідину утримують з 7 % ПЕГ-6000 (поліетиленгліколь) від загального об'єму протягом 16 год. за температури 4 °C, після чого центрифугують з 7 % ПЕГ протягом 30 хв. при 17000 g при температурі 4 °C, отримані осади ресуспензують у TSE-буфері, піддають дії ультразвуку частотою 22 кГц протягом 40 сек. і центрифугують на ультрацентрифузі через розчин 30 % сахарози при 70000 g при температурі 4 °C протягом 2 год. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2