Спосіб одержання бета-каротину

Винахід відноситься до біотехнології, а саме до способів одержання бета-каротину з мікроводоростей роду Dunaliella. Бета-каротин є натуральним рослинним пігментом, який широко використовується у медицині як джерело вітаміну А, у харчовій промисловості як харчовий барвник, у косметології. Відомо, що бета-каротин є потужним антиоксидантом, який захищає організм людини від агентів, здатних викликати рак. Відповідно бета-каротин має високу комерційну вартість. Хоча бета-каротин промислово виробляють шляхом хімічного синтезу, проте його природні джерела, як відомо, є кращими з точки зору протиракового ефекту. Мікроводості роду Dunaliella мають здатність до надсинтезу та накопичення каротиноїдів і використовуються в якості природних джерел бета-каротину. Найбільш продуктивною у цьому плані є Dunaliella salina. Ця солоноводна мікроводорость промислово культивується у ставках з ропою. Відомо, що швидкість росту Dunaliella salina і накопичення бета-каротину в її клітинах залежать від густини ропи, яка використовується як культуральне середовище, від концентрації поживних речовин, інтенсивності освітлення та температурного режиму. Досліджено, що умови, які сприяють максимальному накопиченню бета-каротину в клітинах Dunaliella не обумовлюють високу швидкість її росту. Навпаки, умови, які забезпечують високу швидкість росту, одночасно викликають менше накопичення бета-каротину у кожній клітині [1]. Проте навіть при найкращих умовах культивування швидкість росту Dunaliella salina низька у порівнянні з іншими мікроводоростями. Динаміка росту Dunaliella salina включає лаг-фазу, яка триває близько тижня, коли культура не росте, фазу максимальної швидкості росту культури (експоненціальна фаза), фазу лінійного росту, коли ріст уповільнюється, і стаціонарну фазу, коли ріст культури припиняється. Збирання біомаси мікроводостей проводять звичайно на останній фазі. В умовах промислового культивування бажано, щоб культура, готова до збору "врожаю", була у наявності кожний день. Цього намагаються досягти за допомогою відомих з відкритих літературних джерел підходів: модульного принципу, який передбачає наявність декількох резервуарів (ставків) з культурами мікроводостей на різних стадіях росту, безперервного або напівбезперервного культивування, коли біомасу водоростей відбирають безперервно або з невеликою періодичністю, щоб концентрація клітин весь час відповідала фазі експоненціального росту для забезпечення належної продуктивності культури. Проте останній підхід є трудомістким, вимагає автоматизованого безперервного стеження за концентрацією культури, дозволяє відбір обмеженої кількості біомаси, має недостатню ефективність і потребує нових шляхів підвищення продуктивності. Відомими є спосіб і пристрій для збору мікроорганізмів, зокрема одноклітинних водоростей, таких як Dunaliella [2]. Цим способом передбачено концентрування та збір клітин у лоток на поверхні резервуару з культуральним середовищем. Передбачена також система волокон з інертного матеріалу (бавовна, пластик, скловата, неіржавіючий дріт) або ємність з камінням та галькою, зв'язані з лотком і утворюючі капілярний механізм, уздовж якого клітини підіймаються вгору до світла, накопичуються у лотку і починають ділитися. Спосіб частково вирішує проблему тривалої лаг-фази, провокуючи ділення клітин. Вважається, що клітини для того, щоб почати ділитися, повинні знаходитися у стані комунікації. Єдина клітина навіть у невеликому об'ємі поживного середовища скоріш за все загине. До того ж автори вважають, що сам інертний матеріал волокон або каміння є механічним сигналом, при зустрічі з яким клітини теж починають ділитися. Зібрані у лоток одноклітинні мікроводорості видаляються з резервуару. Процес збору повторюють через період, достатній для росту культури і досягнення нею промислової концентрації. Проте відомий спосіб не передбачає одержання чистого бета-каротину. Зібрані мікроводорості містять бета-каротин у складі суміші каротиноїдів та інших біологічно активних речовин клітини. Чистий бета-каротин вилучають з клітин звичайно шляхом екстракції, що призводить до загибелі мікроводоростей, які видаляються з резервуару без повернення у культуральне середовище. Відомий також спосіб руйнування мікроводостей у водній суспензії [3] для одержання суміші каротиноїдів з клітин мікроводоростей Dunaliella salina. Спосіб передбачає вилучення з резервуару (ставка) водної суспензії клітин мікроводоростей за допомогою насосу. Для руйнування клітин суспензію, що циркулює у петлі насосу під тиском, піддають стрибку тиску від 50 до 200psig (345-1379кПа) при проходженні суспензії через звуження у рідкій фазі. Кількість зруйнованих клітин регулюється величиною стрибку тиску і багаторазовим проходженням суспензії з клітинами через звуження при циркуляції. Зруйновані клітини видаляють з рідкого середовища методом флотації за допомогою бульбашок повітря, утворених спеціальним генератором. Клітини Dunaliella salina адгезують до гідрофобної поверхні бульбашок, утворюючи піну. Процес є більш ефективним для зруйнованих клітин. Способом передбачена додаткова механічна фільтрація клітин. Ропа після вилучення клітин мікроводоростей повертається до резервуару. Даний спосіб вибрано за прототип за сукупністю подібних ознак: вилучення зі ставка з ропою суспензії клітин мікроводорості Dunaliella salina за допомогою насосу, створення стрибка тиску при проходженні через звуження у рідкій фазі, повернення "відпрацьованої"" рідини до резервуару (ставка). Недоліками прототипу можна вважати: 1. спосіб не передбачає одержання чистого бета-каротину, у цільовому продукті за даним способом бетакаротин входить до складу суми біологічно активних речовин клітин, яка складається з суміші каротиноїдів, ліпідів, білків та ін.; 2. чистий бета-каротин можна одержати лише шляхом додаткової екстракції та очищення; 3. після здійснення способу до ставка повертається ропа, звільнена від клітин, а загальний рівень концентрації мікроводоростей у ставку знижується; 4. спостерігається подовження лаг-фази, виникає необхідність очікування відновлення рівня промислової концентрації мікроводоростей. Будь-який з відомих способів одержання бета-каротину з мікроводоростей Dunaliella передбачає руйнування і загибель клітини. Це відбувається або при екстракції бета-каротину з клітин тими чи іншими розчинниками або руйнування клітин передбачено технологічною схемою одержання як у випадку прототипу. При руйнуванні клітин Dunaliella salina неможливо одержати чистий бета-каротин, бо сама клітина містить суміш каротиноїдів, ліпіди, білки та ін. У такому разі необхідно передбачати додаткові операції екстракції та очищення бета-каротину, що збільшує трудомісткість та вартість процесу одержання кінцевого продукту. Будь-яке подальше використання ропи, з якою у процесі виробництва вилучено Dunaliella salina, обов'язкового потребує тривалого періоду часу, протягом якого мікроводорості ростуть у ропі до досягнення концентрацій, придатних для комерційного використання. Ці особливості сучасних методів виробництва бетакаротину обумовлюють великі площі солоних ставків, необхідних для виробництва комерційно вигідних обсягів бета-каротину. Завданням винаходу є створення нового способу одержання бета-каротину, який передбачає вплив на клітини Dunaliella salina, що знаходяться у культуральному середовищі (ропі), специфічного стрибка тиску, який не призводить до руйнування клітин, завдяки чому ропа, з якої зібрано бета-каротин, як і раніше містить життєздатні клітини Dunaliella salina і таким чином може бути використана для подальшого виробництва бетакаротину без тривалого проміжку часу для досягнення ропою промислової концентрації Dunaliella salina. При цьому очевидно, що, якщо клітини Dunaliella salina не зруйновані у процесі збирання "врожаю", загальний процес виробництва стає значно більш ефективним. Важливо, що при цьому одержують практично чистий бета-каротин. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі одержання бета-каротину з мікроводоростей Dunaliella, який включає обробку суспензії клітин мікроводоростей у культуральному середовищі стрибком тиску при пропусканні останньої під тиском через канал з локальним звуженням, винаходом передбачені наступні відміни: створюють стрибок тиску такої величини, яка є вже достатня для часткового порушення клітинної мембрани і вивільнення глобул з бета-каротином у принаймні частини клітин суспензії, але ще не призводить до руйнування клітин, а збір бета-каротину здійснюють безпосередньо із суспензії, обробленої стрибком тиску. Важлива ознака винаходу полягає у тому, що стрибок тиску, який здійснюється від підвищеного до атмосферного тиску, варіює у залежності від кількісного вмісту солі у культуральному середовищі. Заявлений спосіб є придатним для всіх мікроводоростей роду Dunaliella, проте оптимальним він є для Dunaliella salina, для якої згідно з винаходом величина стрибка тиску становить від 450кПа до 1100кПа при концентрації солі у культуральному середовищі від 10% до 25% за вагою. Винаходом визначено, що при вмісті солі у культуральному середовищі 10%-11% за вагою величина стрибка тиску становить 1000-1100кПа відповідно, при 14%-16% - 800-880кПа; при 19%-21% - 600-670кПа; при 24%-25% - 450-500кПа. Винаходом також передбачено, що суспензію, оброблену стрибком тиску, приводять у контакт із елементом з розвинутою гідрофобною поверхнею, на яку адсорбується бета-каротин, і оброблюють відповідним розчинником для вивільнення бета-каротину. При створенні винаходу авторами були вперше використані особливості будови клітини Dunaliella salina, які дозволили запропонувати новий спосіб одержання бета-каротину, ефективніший за існуючі. Dunaliella salina на відміну від інших рослинних клітин, не має клітинної оболонки з целюлози або кремнію. Клітини Dunaliella salina оточені гнучкою клітинною мембраною, яка дозволяє їм витримувати зміни щільності та осмотичний стрес ропи, в якій вони ростуть. Проте гнучкість клітинної мембрани означає також, що клітини дуже чутливі до механічних сил і легко розриваються (руйнуються), порушуючи таким чином цілісність клітини. Особливості будови клітини Dunaliella salina полягають у тому, що практично чистий бета-каротин локалізується у глобулах (краплях) відразу під поверхню клітинної мембрани, тоді як інші життєвоважливі органели, такі як ядро, мітохондрії та хлоропласт, містяться глибше всередині клітини і далі від клітинної мембрани. Глобули, що містять бета-каротин, оточені ліпідною мембраною, яка може зливатися з клітинною мембраною. У відповідності з заявленим способом на клітини Dunaliella salina, які знаходяться у культуральному середовищі, впливають стрибком тиску, величина якого вибрана таким чином, щоб бути достатньою для порушення клітинної мембрани у мінімальному ступені, необхідному для вивільнення з клітини глобул з бетакаротином без руйнування життєвоважливих органел клітини. При здійсненні заявленого способу створюються такі умови, що після вивільнення глобул з бетакаротином внутрішній тиск у клітині знижується настільки, щоб мембрана могла відновитися і таким чином захистити внутрішні органели у клітини. Цей процес аналогічний так званому екзоцитозу - явищу, що спостерігається в інших клітинах, проте якщо екзоцитоз контролюється самою клітиною, описане вище явище провокується і контролюється заявленим способом. При плавному підвищенні зовнішнього тиску клітини Dunaliella завдяки гнучкості клітинної мембрани адаптуються до середовища, підвищуючи внутрішньоклітинний тиск. При проходженні через звуження у рідкій фазі (отвір) клітини миттєво переміщуються з зони підвищеного тиску (до отвору) у зону атмосферного тиску (після отвору). Заданий заявленим способом стрибок тиску викликає часткове руйнування клітинної мембрани. Рівновага між зовнішнім і внутрішньоклітинним тиском порушується, внутрішній тиск клітини стає вищим за тиск зовнішнього культурального середовища. Це сприяє вивільненню з клітини глобули з бетакаротином і зниженню внутрішньоклітинного тиску до атмосферного, що необхідно для нормалізації життєздатності клітини. У цьому контексті дуже важливою відмітною ознакою способу є створення короткочасного стрибка заданої величини від підвищеного до атмосферного тиску, якому клітини Dunaliella salina у процесі одержання бетакаротину піддаються лише один раз, тобто забезпечуються м'які умови, при яких клітина зберігає свою життєздатність. Для одержання специфічного стрибка тиску суспензію клітин Dunaliella salina у культуральному середовищі спочатку за допомогою насосу піддають плавно підвищеному гідростатичному тиску без різких коливань, які можуть викликати руйнування клітин, а потім провокують стрибок тиску від підвищеного до атмосферного при проходженні потоку суспензії через звуження у рідкій фазі. Технічно це здійснюється за допомогою клапану довільної конструкції, що регулює розмір отвору, через який витікає суспензія. Експериментальним шляхом визначено, що ступінь вивільнення бета-каротину з клітин Dunaliella salina чутлива до хімічного складу, зокрема до вмісту солі у культуральному середовищі. Авторами вперше досліджений зв'язок і виявлена залежність між концентрацією солі у культуральному середовищі і величиною стрибка тиску, який забезпечує вивільнення з клітин глобул з бета-каротином при збереженні життєздатності клітин. Експериментальним шляхом було встановлено величини стрибків тиску при різному вмісті солі у культуральному середовищі (ропі), які забезпечують вивільнення бета-каротину з Dunaliella salina без порушення цілісності клітин. Результати наведені у таблиці. Таблиця Залежність величини стрибка тиску від концентрації солі у культуральному середовищі Концентрація солі Мінімальний стрибок тиску, кПа Максимальний стрибок тиску, кПа 10%-11% 14%-16% 19%-21% 24%-25% за вагою за вагою за вагою за вагою 1000 800 600 450 1100 880 670 500 Наведений інтервал концентрації солі у ропі відповідає реальним умовам промислового культивування Dunaliella salina у відкритих ставках з метою одержання бета-каротину в умовах Криму або наближений до них. При вмісті солі у ропі меншому 10% за вагою концентрація клітин Dunaliella salina у ропі не досягає рівня, придатного для промислового використання. При вмісті солі у ропі понад 25% ріст Dunaliella salina суттєво уповільнюється. Інтервал значень стрибків тиску від мінімального до максимального для кожної з наведених концентрацій солі у ропі за змістом означає: - мінімальний стрибок тиску забезпечує часткове порушення клітинної мембрани, достатнє для вивільнення без руйнування клітин глобул з бета-каротином у такої кількості клітин, яка становить промисловий інтерес, при зниженні значення мінімального стрибка тиску така мета не досягається; - максимальний стрибок тиску відповідає завданню заявленого способу, але є тим пороговим значенням, при перевищенні якого починається повне руйнування клітин водорості. Для збирання бета-каротину використовують здатність вивільнених глобул адсорбуватися на гідрофобній поверхні. Чим більше площа такої поверхні, тим ефективніше проходить процес адсорбції. Технічно цей процес може бути здійснений шляхом пропускання суспензії після стрибка тиску через судину з інертного матеріалу, наприклад скла, заповнену волокнами гідрофобного матеріалу, наприклад поліетилену, які забезпечують необхідну площу адсорбції. Важливо враховувати, що бета-каротин руйнується у процесі окислення, якщо він піддається дії кисню або інших окисників. Відповідно, бета-каротин вивільнений з Dunaliella salina повинен бути швидко відокремлений від культурального середовища для попередження його деградації окисленням. Найкращим шляхом для вирішення цієї проблеми є піддавання суспензії Dunaliella salina стрибку тиску безпосередньо перед судиною з волокнами для збору бета-каротину. Після протікання через останню заданої порції суспензії потік зупиняють, ропу, що залишилась у судині, вивільняють при відкриванні дна судини. Ропу, вміщуючу суспензію життєздатних клітин Dunaliella salina, повертають у ставок для подальшої культивації, тим самим постійно підтримуючи високу концентрацію клітин культури, здатних до каротиногенезу. Бета-каротин збирають з сорбційної поверхні волокон, розміщених всередині судини, за допомогою будьяких придатних для цієї мети розчинників. Після відокремлення розчинника одержують практично чистий бета-каротин, не потребуючий подальшого очищення. Заявлений спосіб здійснюють за наступною схемою: - культивування Dunaliella salina у солоноводному ставку до одержання промислово придатної концентрації; - відбір ропи, вміщуючої суспензію Dunaliella salina, за допомогою насосу, який запобігаючи руйнуванню клітин, плавно без коливань створює гідростатичний тиск, розрахований у відповідності з заявленим способом і достатній для здійснення стрибка тиску у залежності від концентрації солі у ропі; - піддавання суспензії Dunaliella salina у ропі стрибку тиску від підвищеного до атмосферного шляхом пропускання зазначеної суспензії через отвір, розмір якого обумовлює заданий стрибок тиску; - пропускання ропи, вміщуючої вивільнені глобули з бета-каротином і життєздатні клітини Dunaliella salina, через судину з гідрофобними волокнами, адсорбція бета-каротину на поверхні волокон; - повернення ропи з життєздатними клітинами Dunaliella salina після вилучення бета-каротину до ставка для подальшого культивування; - збір бета-каротину з поверхні волокон за допомогою розчинника, відокремлення розчинника, одержання практично чистого бета-каротину, який не потребує додаткового очищення. Заявлений спосіб може бути здійснений за допомогою будь-якого обладнання та апаратів, які можуть забезпечити одержання бета-каротину за наведеною схемою. Стосовно вимог до такого обладнання, то його матеріал має бути інертним при контактуванні з клітинами Dunaliella salina та глобулами з бета-каротином. Бажано, щоб насос, який створює гідростатичний тиск, сам по собі не викликав стрибків тиску в суспензії Dunaliella salina у ропі. Це може бути досягнуто шляхом використання насосу позитивного заміщення, такого як поршневий насос або насос, у якому поршень рухається по спіралі. Бажано, але не так суттєво, щоб механізм вивільнення тиску для генерування специфічного стрибка тиску був у вигляді пластинки з отвором, проте можуть бути використані воротний або ножевий клапани. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. Культуру Dunaliella salina вирощували у відкритих солоноводних ставках у Криму. Концентрація солі у ропі становила 20% за вагою. Після 30 днів росту при сонячному освітленні культура містила 45000 клітин на 1мл з концентрацією бета-каротину 4,8мг/л. Культуру відбирали зі ставка з використанням насосу, який генерував тиск 740кПа на виході. Ропу з культурою Dunaliella salina прокачували при цьому тиску у скляну судину з тонкими поліетиленовими волокнами всередині. Вхід у судину містив пластинку з отвором, який знижував тиск рідини з 740кПа до атмосферного (приблизно 100кПа). Величина стрибка тиску становила 640кПа. Ропа після проходження через пластинку з отвором і далі через скляну судину з волокнами містила 38000 клітин на 1мл з концентрацією бета-каротину 0,3мг/л. Мікроскопічне дослідження культури, що витікала з судини, виявило, що клітини були інтактними, але блідо-жовтого кольору, тоді як клітини, які відбиралися насосом, були інтенсивно червоного кольору. Після того, як 100л культури описаним чином пройшли через судину, потік зупиняли і ропу, що залишилася у судині, вивільняли при відкритті дна судини. Волокна всередині судини відмивали 1л петролейного ефіру. Далі ефір видаляли і одержували 420мг бета-каротину. Ропа з Dunaliella salina після завершення процесу вилучення бета-каротину поверталася у ставок і піддавалася дії сонячного світла. Через 6 днів концентрація клітин становила 47000 клітин на 1мл, а концентрація бета-каротину була 5,1мг на 1л. Цей факт свідчить, що клітини, з яких вилучили бета-каротин, залишилися життєздатними і здатними продуцирувати бета-каротин. Приклад 2. Культуру Dunaliella salina вирощували у відкритих солоноводних ставках при концентрації солі у ропі 25%. Через 45 днів росту в умовах літа культура містила концентрацію клітин Dunaliella salina 32000 на 1мл з концентрацією бета-каротину 6,1мг/л. Як і у попередньому прикладі, культуру відбирали зі ставка за допомогою насосу. Пластину з отвором замінили таким чином, що насос генерував тиск 570кПа. Ропу з культурою Dunaliella salina прокачували у скляну судину з поліетиленовими волокнами і тиск знижувався на вході у судину до атмосферного (~100кПа). Скачок тиску становив 470кПа. Культуральне середовище після виходу з судини містило 22000 клітин на 1мл і бета-каротину 0,4мг/л. Після пропускання через судину 1000л культури потік зупинили і ропу, що залишилася у судині, видалили. Волокна всередині судини відмили етилацетатом. В ньому виявилося 5600мг бета-каротину. Культуральне середовище, яке пройшло через судину, повільно розвели прісною водою до концентрації 20% солі за вагою і повернули до ставка на сонячне світло. Через 7 днів концентрація солі збільшилася до 26% за вагою і клітини вирощувалися до концентрації 31000 на 1мл, а концентрація бета-каротину склала 5,5мг/л. Як свідчать наведені приклади, заявлений спосіб дозволяє дуже ефективно вилучати бета-каротин з культур Dunaliella salina, при цьому клітинна біомаса залишається життєздатною та інтактною, здатною швидше продуцирувати більше бета-каротину. Таким чином час, необхідний для регенерації культури Dunaliella salina значно знижується у порівнянні з іншими способами одержання бета-каротину, забезпечуючи значно вищу продуктивність заявленого способу. Джерела інформації 1. Комариста В.П. Взаємозв'язок інтенсивності проліферації і ліпідно-каротиноїдного обміну в клітинах Dunaliella teod та вплив ліпідно-каротиноїдних екстрактів на функціональну активність гепатоцитів. Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук. Харківський державний університет. Харків, 1999, с.6-13. 2. Патент 4,324,067, США, МПК 3 A01G7/00, з. №118,585. Заявл. 04.02.80, Опубл. 13.04.82. 3. Патент 6,000,551, США, МПК 6 C12N1/06, C12N1/12, A01G7/00, В03Д1/02, з. №08/772,589. Заявл. 20.12.96, Опубл. 12.12.99.