Тест-система імуноферментна для якісного та напівкількісного аналізу та визначення авідності антитіл класу igg до цитомегаловірусу людини (dia-cmv-igg-av)

Реферат: Тест-система імуноферментна для напівкількісного аналізу та визначення авідності антитіл класу IgG до цитомегаловірусу людини (DIA-CMV-IgG-av), в якій на полістироловий планшет сорбовані рекомбінантні антигени, а як кон'югат використовуються антитіла проти імуноглобулінів класу IgG людини. Досліджувану сироватку інкубують в паралельних лунках імуносорбенту і потім один зразок промивають в звичайному режимі, а інший обробляють дисоціюючим розчином, який руйнує комплекси антигенів з низькоавідними IgG антитілами, причому індекс авідності розраховують як відношення оптичної густини, отриманої при виявленні специфічних IgG антитіл в присутності дисоціюючого розчину, до оптичної густини, отриманої при аналізі даного зразка, не обробленого ним. UA 78417 U (12) UA 78417 U UA 78417 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для напівкількісного аналізу авідності антитіл класу IgG до цитомегаловірусу (CMV) людини в сироватці або плазмі крові. При встановленні діагнозу первинної цитомегаловірусної інфекції тест на авідність специфічних IgG антитіл (міцність зв'язку специфічних антитіл з антигенними детермінантами вірусу) є обов'язковим в алгоритмі обстеження, особливо вагітних жінок. Низькоавідні IgG антитіла є характерними для первинного гострого інфекційного процесу. Високоавідні IgG антитіла з'являються на пізній стадії гострого періоду захворювання. Вони виявляються при хронічній формі інфекції і свідчать про захворювання перенесене в минулому. Відома тест-система для виявлення антитіл проти CMV у сироватках і плазмі крові людини при діагностиці цитомегаловірусної інфекції [1]. В основі тест-системи лежать антигени вірусу або рекомбінантні поліпептиди аналоги антигенів CMV, використані в складі імуносорбенту, а як кон'югат застосовують козячі антилюдські антитіла, зв'язані з пероксидазою. Суть корисної моделі в створенні імуноферментної тест-системи для напівкількісного аналізу та визначення авідності антитіл класу IgG до цитомегаловірусу людини в сироватці або плазмі крові. Для напівкількісного аналізу досліджувані сироватки вносять в лунки планшета, сенсибілізовані антигенами CMV, з якими зв'язуються присутні у зразку специфічні IgG антитіла, утворюючи комплекси антиген-антитіло. Імунні комплекси виявляють за допомогою пероксидазного кон'югату моноклональних антитіл до IgG людини. Після відмивання незв'язаних компонентів в лунки додають розчин проявника. Пероксидазну реакцію зупиняють, додаючи стоп-реагент, і вимірюють оптичну густину суміші у лунках при довжині хвилі 450/620 нм, яка пропорційна концентрації специфічних IgG антитіл до CMV у зразках сироваток або плазми крові. Для оцінки динаміки рівня специфічних антитіл результат аналізу виражається в одиницях DIA Units (DU). Для визначення індексу авідності специфічних IgG антитіл досліджувану сироватку інкубують в паралельних лунках імуносорбенту. Потім один зразок промивають в звичайному режимі, а інший обробляють дисоціюючим розчином (ДР), який руйнує комплекси антигенів з низькоавідними IgG антитілами. Антитіла, що залишились зв'язаними з антигеном, виявляють пероксидазним конъюгатом. Індекс авідності розраховують як відношення оптичної густини, отриманої при виявленні специфічних IgG антитіл в присутності ДР, до оптичної густини, отриманої при аналізі даного зразка, не обробленого ДР, та виражають його в %. Приклад. Визначення авідності антитіл класу IgG до CMV в сироватці крові хворої Α., 1990 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього в лунки імуносорбенту з фіксованими на ньому рекомбінантними поліпептидами аналогами-антигенів р150 ні і р28 CMV вносять в лунки по 90 мкл розчину для розведення сироваток, а потім по 10 мкл досліджуваних сироваток та контролів. Для визначення індексу авідності специфічних IgG антитіл досліджувану сироватку інкубують в паралельних лунках імуносорбенту. Потім один зразок промивають в звичайному режимі, а інший обробляють дисоціюючим розчином (ДР), який руйнує комплекси антигенів з низькоавідними IgG антитілами. Накривають планшет кришкою та інкубують при температурі (37±2) °С протягом 60 хв. Після закінчення інкубації промивають планшет 4 рази розчином для промивання. Антитіла, що залишились зв'язаними з антигеном, виявляють пероксидазним кон'югатом, який вносять в лунки по 100 мкл. Знову інкубують планшет, але вже при кімнатній температурі (18-25) °С протягом 30 хвилин. Промивають лунки 6 разів розчином для промивання, вносять в них по 100 мкл однокомпонентного розчину хромогену ТМБ і інкубують при температурі (18-25) °С в темному місці протягом 30 хв. Для зупинення кольорової реакції (в тій же послідовності внесення що й ТМБ) вносять в лунки по 100 мкл стоп-реагенту. Не більше як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (450 нм відносно 620 нм). Для обліку результатів розраховують середнє значення ОГ негативного контролю - НКсер і граничне значення (ГЗ) по формулі: ГЗ = НКсер + 0,2. Результат аналізу вважається негативним, якщо ОГ досліджуваного зразка менше ГЗ. Результат аналізу вважається позитивним, якщо ОГ досліджуваного зразка більше ГЗ. Для оцінки зміни рівня антитіл в динаміці результат аналізу оцінюється в одиницях DIA Units (DU) за формулою: DU = (ОГ сироватки  10): ГЗ Результат кожного аналізу оцінюють наступним чином: 1 UA 78417 U >10 DU