Суміш фуростанолових сапонінів, отриманих з tribulus terrestris l., що має імуномодулюючі властивості, спосіб її отримання і її застосування

1. Суміш стероїдних сапонінів, що має імуномодулюючу і/або імуностимулюючу дію, отримана з надземної частини Tribulus terrestris L., при цьому суміш містить більш 80% фуростанолових сапонінів. 2. Спосіб отримання суміші стероїдних сапонінів за п.1 з Tribulus terrestris L. за допомогою екстрагування насиченим водою н-бутанолом, концентрування і сушіння, який відрізняється тим, що перше екстрагування виконують з використанням C2 2 (19) 1 3 80182 для отримання нових лікарських засобів з новими показаннями для застосування. Відповідно до даного винаходу задача може бути вирішена шляхом отримання стандартизованої суміші стероїдних сапонінів, що містить 80 процентів фуростанолових сапонінів. Спосіб отримання полягає в тому, що подрібнений рослинний матеріал піддають екстрагуванню з використанням водного метанольного розчинника з співвідношенням води/метанолу, що знаходиться в інтервалі від 1:1 до 1:99 при температурі від 52 до 55°С. Екстракт потім обробляють активованим вугіллям і, після фільтрування, концентрують під вакуумом доти, поки метанол не видалиться повністю. Водний концентрат потім піддають екстрагуванню дихлорметаном. Дихлорметан потім відганяють і регенерують для подальшого використання при даному способі. Очищений водний розчин підкисляють соляною кислотою до рН 4 і піддають екстрагуванню насиченим водою н-бутанолом відомим способом. Бутанольні екстракти потім промивають розчином хлориду натрію і концентрують під вакуумом з отриманням сухого залишку, який розчиняють в низькомолекулярному спирті. Потім концентрат або додають краплями в ацетон і залишають при температурі 10-15°С протягом 24 годин, потім фільтрують, промивають ацетоном і сушать, або промивають 0,5-1,5-процентним розчином гідроксиду натрію і, після розділення двох шарів, бутанольний шар промивають водою до досягнення рН=7, потім бутанольні екстракти концентрують під вакуумом доти, поки органічний розчинник не буде повністю видалений, і водний розчин сушать. Таким чином, отримують м'який і світлий коричнювато-жовтий порошок, що містить більше 80 процентів фуростанолових сапонінів. Вихід з висушеного на повітрі рослинного матеріалу становить приблизно 3 проценти. Цей новий продукт, що містить більше 80 процентів фуростанолових сапонінів, можна використати для отримання нових лікарських речовин, що виявляють імуномодулюючу і/або імуностимулюючу дію. Приклади Приклад 1 Одну тонну подрібненого рослинного матеріалу піддають екстрагуванню, з використанням 70процентного метанольного водного розчину, при 50°С до виснаження. Екстракт відціджують, потім до нього додають активоване вугілля. Отримане пропускають через фільтр-прес. Водний концентрат, отриманий таким чином, піддають потрійному екстрагуванню дихлорметаном в співвідношенні 1:2, 1:1 і 1:1, відповідно. Органічний розчинник відганяють і регенерують, тоді як кубовий залишок відкидають. Очищений водний екстракт підкисляють соляною кислотою до рН 4 і піддають восьмиразовому екстрагуванню водою, н-бутанолом в співвідношенні 1:1. Бутанольні екстракти промивають 5-процентним розчином хлориду натрію і концентрують до отримання сухого залишку під вакуумом при 60°С і потім розчиняють в метанолі. Суміш повільно капають в ацетон, залишають при температурі 10°С протягом 20 годин і в кінці філь 4 трують через нутч-фільтр, промивають ацетоном і сушать. У результаті отримують ясно-жовтий порошок, що містить 85 процентів фуростанолових сапонінів. Вихід становить 3 проценти від висушеного на повітрі рослинного матеріалу. Аналіз продукту виконують, виходячи з протодіосцину. [R. Gyulemetova, M. Tomova, Μ. Simova, Τ. Pangarova, Pharmazie, 37, H.4 1982]. Приклад 2 Одну тонну подрібненого рослинного матеріалу піддають екстрагуванню, з використанням 70процентного метанольного водного розчину, при 50°С до виснаження. Екстракт відціджують, потім до нього додають активоване вугілля. Отримане пропускають через фільтр-прес. Водний концентрат, отриманий таким чином, піддають потрійному екстрагуванню дихлорметаном в співвідношенні 1:2, 1:1 і 1:1, відповідно. Органічний розчинник відганяють і регенерують, тоді як кубовий залишок відкидають. Очищений водний екстракт підкисляють соляною кислотою до рН 4 і піддають восьмиразовому екстрагуванню водою, н-бутанолом в співвідношенні 1:1. Бутанольні екстракти промивають 1-процентним розчином гідроксиду натрію, відношення лужної води до бутанольного екстракту становить 1:1, і після розділення двох шарів бутанольний шар промивають водою до рН 7. Бутанольні екстракти потім концентрують під вакуумом доти, поки не видалять розчинник повністю, після чого водний розчин сушать. У результаті отримують ясно-жовтий порошок, що містить 85 процентів фуростанолових сапонінів. Вихід становить 3 проценти від висушеного на повітрі рослинного матеріалу. Аналіз продукту виконують, виходячи з протодіосцину. [R. Gyulemetova, M. Tomova, Μ. Simova, Τ. Pangarova, Pharmazie, 37, H.4 1982]. Результати випробування впливу суміші стероїдів згідно з даним винаходом на імунну систему експериментальних тварин Матеріал і метод Рослинний матеріал Речовина, що містить фуростанолові сапоніни (ФС), виділяли з Tribulus terrestris L. (Zigophyllaceae) відповідно до даного винаходу. Ліофілізовані ФС зберігали при 4°С захищеними від світла і вологи. Розчин, що використовується при експериментах, готували у міру потреби в фізіологічному розчині. Експериментальні тварини і методика Самцям мишей ICR (середня вага тіла від 18 до 20г) давали перорально різні дози ФС відповідно до опису, представленого в таблиці 1. Експериментальна інфекція Експериментальну інфекцію викликали у миші шляхом підшкірного введення 25-30 бактерійних клітин з 18-годинної вирощеної на агарі культури K1. Pneumoniae (штам №52145, Інститут Пастера, Париж). Доза зараження була вибрана після попередніх експериментів, призначених для визначення 50-процентного рівня виживаності. Інфекція слідувала протягом до восьми днів, причому враховували загальний стан суб'єкта, рівень смертності (процент), рівень виживаності і середню трива 5 80182 лість виживання (СТВ8 в днях). Захисний ефект ФС оцінювали по підвищенню рівня виживаності, і середню тривалість виживання розраховували як різницю між результатами для експериментальних груп і контрольних груп. Випробування in vitro на антибактерійну придушувальну дію Чутливість клітин K1. Pneumoniae до ФС визначали, використовуючи адаптований варіант методу Бауера (Bauer) (4). У чашки Петрі (100мм), що містять агар, засівали 0,2мл бактерійної суспензії (10клітин/мл). Робили ямки (10мм) і заповнювали 0,2мл розчину ФС з різними концентраціями. Зони придушення вимірювали після інкубації протягом 24 годин при 31°С. Як позитивний контроль використали кефлін (Lilly, США) з мінімальними переважними концентраціями, що дорівнювали 0,150мг/мл. Фагоцитарна і мікробіцидна активність альвеолярних макрофагів аМа Альвеолярні макрофаги були отримані промиванням легенів in situ шляхом вливання і витягання 0,1-1,0мл розчину ТСМ 199, що містить 20мМ HEPES, 100Од/мл пеніциліну і 0,1мг/мл стрептоміцину (Flaw Lab., UK) плюс 3Од/мл гепарину (G. Richter, Hungary). Визначали середнє число вимитих аМа з кожної групи, і потім клітини вміщували в інкубаційні планшети (BDSL, Шотландія) в концентрації 3x10клітин/мл для оцінки їх фагоцитарної і мікробіцидної активності з використанням 3Нтимідинового радіометричного методу. (5) Результати Захисна дія від інфекції Результати, отримані таким чином, показують, що ФС впливають на хід і ви хід експериментальної інфекції у мишей, викликаної K1. Pneumoniae. У лікованих тварин рівень смертності досягав максимума 30-40% на 4-ий - 5-ий день після інфікування (Фіг.). Пік рівня смертності в контрольних групах б ув значно вищим (70-80%) і спостерігався на 2-ий - 3-ий день після інфікування. Підводячи підсумок, введення ФС приводить до зниженої тяжкості клінічної картини, більш низького рівня смертності, пролонгованого часу виживання лікованих тварин. Протиінфекційна дія ФС міняється відповідно до дозування і режиму введення (таблиця 1). Най 6 вища доза (625,0мг/кг), що вводиться, давала найсильніший захисний ефект при всіх 10-денних режимах введення, починаючи з 35, 25 або 15 дня перед інфікуванням; пік ефекту спостерігали, коли останню дозу ФС вводили за 15 днів перед інфікуванням. У протилежність помітній активності in vivo, ФС не виявляв антибактерійної активності in vitro. Розчин ФС в фізіологічній сироватці при концентраціях 0,01; 0,025; 0,05; 0,1; 2,0; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 100,0; 250,0 і 500,0мг/мл не придушував зростання K1. Pneumoniae на відміну від помітного придушення, що спостерігається в групі, яка отримувала кефлін, зі середнім діаметром 21,5±1,0мм. Стимуляція аМа Дози в 625,0мг/кг спричиняють збільшення числа аМа і підвищення їх фагоцитарної і мікробіцидної активності з максимумом на 20-ий день після останнього введення ФС (таблиця 2). Обговорення На відміну від інши х сапонінів (3) ФС не виявляють бактерицидного ефекту. ФС впливають на головні ефекторні механізми клітинного і гуморального імунітету, забезпечуючи, таким чином, істотний захист від інфекції. Оптимальна доза в 625,0мг/кг, що вводиться протягом послідовних 10 днів, є дуже близькою до режиму (6), що застосовується у людей. Найсильніший ефект, отриманий при цьому режимі, коли інтервал між останнім прийомом ФС і інфікуванням становить 15 днів, можна пояснити динамікою активації аМа. Максимальне підвищення їх функціональної активності спостерігається на 20-ий день, що співпадає з гострою фазою інфекції (день з 3 по 5). Велике число аМа з підвищеною фагоцитарною і мікробіцидною здатністю запобігає прогресуванню інфекції і знижує рівень смертності, одночасно підвищуючи рівень виживаності. Очевидно, захисний ефект ФС повністю досягається тільки після даного періоду часу, необхідного для реакції імунної системи. ФС активує аМа, які грають значну роль в антибактерійному захисті легенів, зокрема, лікуванні інфекцій, викликаних умовно-патогенними мікроорганізмами, такими як K1. Pneumoniae (6). Імуностимулюючі властивості ФС Таблиця 1 ФС-індукований протиінфекційний ефект відносно експериментальної інфекції, викликаної K1. Pneumoniae Дозаа 62,5 Лікування Лікування b 15,14,13,12,11,10,9,8,7,6 25,24,23,22,21,20,19,18,17,16 35,34,33,32,31,30,29,28,27,26 10,9,8,7,6 20,19,18,17,16 30,29,28,27,26 18,17,16 7,6 17,16 27,26 Загальна доза c 625,0 312,5 187,5 125,0 Захисний ефект Підвищений рівень виживаностіd 32,6 45,6 28,5 10,0 20,0 15,5 42,9 14,3 33,9 27,3 ASTc 0,8 1,8 0,9 0,4 0,4 0,5 1,2 3,5 0,4 2,1 7 80182 8 Продовження таблиці 1 50,0 12,5 25,23,21,19,17 25,24,23,22,21,20,19,18,17,16 250,0 125,0 16,2 10,0 0,4 0,4 а Однократна доза ФС (мг/кг на добу) Дні c Доза (мг/кг) d Зміна (D) рівня виживаності (%) е Зміна (D) середньої тривалості виживання (дні) b Представлені вище результати є типовими даними, отриманими з трьох незалежних експериментів з використанням різних експериментальних тварин. Імуномодулюючі властивості ФС Таблиця 2 Активація аМа у мишей, що о тримували ФС Дні дослідження a 1 5 10 15 20 30 Контроліf Кількість b 202±62е 213±81е 318±120 323±202 476±88 371±191 176±31 Фагоцитоз c 22,1±2,0е 25,0±3,7 29,2±4,4 33,0±4,4 37,2±1,7 32,2±5,8 21,2±1,9 Мікробіцидний ефектd 10,1±1,2 13,3±1,9 15,0±2,7 16,6±4,8 18,0±4,7 17,2±2,2 9,0±1,2 а Дні від останнього введення ФС протягом 10 послідовних днів в дозах 62,5мг/кг перорально В тисячах (х103) с Процентний вміст фагоцитарних аМа бактерійних клітин d Процентний вміст бактерійних клітин, убити х через 1 годину після фагоцитозу а Ма е Статистично недостовірне (р>0,05 по критерію Стьюдента) f В контролі вводили тільки фізіологічну сироватку b Дані результати представляють середні арифметичні даних з чотирьох незалежних експериментів з використанням 10 експериментальних тварин для кожної групи. Література 1. Yamaha, Η. (1991) Curr. Opin. Biotechnol., 2, 203. Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 2. Wagner, H. (1990) Pure Appl. Chem. 131 q 117. 3. Cambell, J.B., Dede J.C. (1989) E.A.G. Lett., 5, 12. 4. Bauer, A.W., Kirby, W.M.M., Sherris, J.C, Truck, M. (1966) Am. J. Clin. 5. Dimov, V., Ivanovska, N., Bankova, V.V., Nikolov, N.. Popov, S. (1991) Apidologie 22,155. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601