Лікарський засіб, який містить бактеріальний лектин для лікування хворих, уражених герпесом 1 і 2 типів

Лікарський засіб для лікування хворих, уражених вірусами герпесу 1 і 2 типів, який відрізняється тим, що містить як активну речовину позаклітинний сіалоспецифічний лектин сапрофітного штаму Bacillus sub tilis ІМВ В-7014 в дозі 2,0-1,0мкг/кг, який повністю блокує поверхневі структури глікопротеїнів вірусу герпесу 1 і 2 типів, в яких термінальна Nацетилнейрамінова кислота зв'язана з субтермінальною D-галактозою a2,3- або a2,6-зв'язками. Винахід належить до мікробіології, а саме: застосування бактерійного лектину для лікування хворих, уражених герпесом 1 і 2 типів. Герпетичні інфекції - це група антропонозних інфекційних захворювань, які викликаються вірусами герпесу людини та протікають у вигляді інапарантних, субкліничних і клінічно маніфестних форм [2, 5]. Розмаїття клінічних проявів, особливості збудників, можливість їх поширення практично усіма відомими шляхами передачі спонукало Європейське регіональне бюро ВООЗ зарахувати герпетичні інфекції до групи хвороб, які вагомо впливають на майбутнє інфекційної патології [3]. Найтиповіший представник вірусів герпесу людини (ВГЛ) - вірус простого герпесу 1 типу – ВПГ - 1 (або ВГЛ - 1) викликає орофаціальний герпес. Близький до нього за морфологічними, антигенними та фізико - хімічними властивостями вірус герпесу людини 2 типу (ВПГ - 2 або ВГЛ - 2). Він викликає генітальний герпес. Герпес - одна з найбільш поширених і погано контрольованих інфекцій людини. В організмі з нормальною імунною системою герпетичні віруси можуть циркулювати безсимптомно, у людей з імуносупресією вони викликають тяжкі захворювання з летальними наслідками. Лікування герпетичної інфекції лишається до тепер складною проблемою [1]. Тривалий хронічний процес призводить до негативної імунної перебудови організму. Спостерігається розвиток повторної імунної недостатності, пригнічення реакцій клітинного імунітету, послаблення неспецифічного захисту організму, що виражається у зниженій здатності лейкоцитів синтезувати a - та g інтерферони (ІФН), гіпоімуноглобулінемії, сенсибілізації до вірусних антигенів. З огляду на етіологію, патогенез та клінічну симптоматику для терапії герпетичних захворювань запропоновано численні препарати етіотропної та імунокорективної дії. На сьогодні антигерпетики складають близько 80% наявних вірусних препаратів, але герпетичні захворювання все ще погано контролюються. Найближчим до винаходу, що заявляється, є антигерпесний препарат Віролекс, який використовує тимідінкіназу в якості матриці, в наслідок (19) UA (11) 84928 (13) C2 (21) a200613192 (22) 13.12.2006 (24) 10.12.2008 (46) 10.12.2008, Бюл.№ 23, 2008 р. (72) ПІДГОРСЬКИЙ ВАЛЕНТИН СТЕПАНОВИЧ, UA, КОВАЛЕНКО ЕММА ОЛЕКС АНДРІВН А, U A, РИБАЛКО СВІТЛАН А ЛЕОНТІЇВН А, U A, ШАРИКІНА НАДІЯ ІВАНІВНА, UA, ГЕТЬМАН КАТЕРИНА ІЛЛІВНА, UA (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО Н АН УКРАЇНИ, UA (56) UA C2 42865, 15.11.2001 RU C1 2185185, 20.07.2002 UA C2 68373, 15.08.2004 RU C1 2171684, 10.08.2001 RU C1 2223781, 20.02.2004 3 84928 чого, вірус не може розмножуватися. Недоліками цього препарату є те, що він достатньо токсичний, діє тільки на інфіковану клітину, до нього швидко виникає резистентність, вартість препарату дуже велика. В основу винаходу поставлено задачу створення ефективного лікарського засобу з принципово новим механізмом дії на основі бактерійного лектину для лікування хворих, уражених герпесом 1 і 2 типів, який би не втрачав своєї активності протягом тривалого часу. Поставлену задачу вирішують тим, що в якості продуцента позаклітинного лектину використовується сапрофітний штам Bacillus subtilis В-7014 з Української колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Бактерійний лектин одержують з культуральної рідини осадженням сульфатом амонію, очищенням діалізом, пастерізацією та ліофілізацією, як описано раніше [4]. Лектин являє собою глікопротеїн з мМ 25кДа, стійкий до дії різних факторів зовнішнього середовища (рН, температури, детергентів, йонів металів), тривало зберігається (термін спостереження 10 років). Він є нетоксичною речовиною та має високу специфічну активність: гемаглютинуюча активність лектину коливається в межах 512-51200 гемаглютинуючих одиниць/мл; найбільшу спорідненість він проявляє до сіалових кислот та сіаловмісних глікокон'югатів, які мають a 2,3/6 зв'язки. Задачу вирішують тим, що лікарський засіб на основі бактерійного лектину для лікування хворих, уражених герпесом 1 і 2 типів, згідно з винаходом містить активну речовину в дозі 2,0-1,0мкг/мл. Лікарський засіб може бути виконано у пероральній або ін'єкційній формах. 4 Лікарський засіб на основі бактерійного лектину для лікування хворих, уражених на герпес 1 і 2 типів, що заявляється, є нетоксичним та ефективнішим у порівнянні з прототипом, має принципово новий механізм дії і не втрачає своєї активності протягом тривалого часу. Вивчення антигерпетичної активності бактерійного лектину в дослідах in vitro Для вивчення антивірусної активності лектину використовували добові культури клітин RK13 (перещеплювані клітини нирки кроля) із суцільним моношаром клітин. Середовище росту зливали, на моношар клітин додавали лектин у різних концентраціях або віруси герпесу (інфекційний титр ВПГ 1 дорівнював 5,5 lg ТЦД50, ВПГ -2 - 6,0 lg ТЦД50) в залежності від модифікації експерименту. Через 1 годину контакту вірус герпесу, що не адсорбувався, видаляли, в лунки вносили підтримуюче середовище (живильне середовище без сироватки) Наступного дня в лунки плашок, що інкубувалися із різними розведеннями лектину вносили вірус герпесу в дозі 100ТЦД50 (профілактична дія), а в лунки, що були інфіковані вірусом герпесу, вносили різні розведення досліджуваного лектину (лікувальна дія). Культури інкубували в термостаті з подачею СО2 протягом 5 діб, щодня контролюючи за допомогою мікроскопу і відмічаючи репродукцію вірусу по цитопатичній дії ВПГ на клітини RK13 у порівнянні з контрольними культурами, де моношар не піддавався ніяким впливам. Через 5 діб збирали культуральне середовище з лунок плашок, в ньому визначали інфекційний титр у кожній пробі при профілактичній і лікувальній дії лектину. Результати репродукції ВПГ 1 та ВПГ - 2 при профілактичному і лікувальному введенні лектину подані в Таблицях 1-4. Таблиця 1 Профілактична дія бактерійного лектину на репродукцію ВПГ - 1 в культурі клітин RK13 Концентрація лектину, мкг/мл 12,5 6,2 3,1 1,55 0,77 Контроль вірусу Інфекційний титр, lg ТЦД50 2,0 2,0 2,5 3,0 5,0 5,0 Інгібування інфекційного титру, lg ТЦД 50 3,0 3,0 2,5 2,0 0 Таблиця 2 Профілактична дія бактерійного лектину на репродукцію ВПГ - 2 в культурі клітин RK13 Концентрація лектину, мкг/мл 12,5 6,2 3,1 1,55 0,77 Контроль вірусу Інфекційний титр, lg ТЦД50 3,0 3,0 3,5 3,0 5,0 6,0 Інгібування інфекційного титру, lg ТЦД 50 3,0 3,0 2,5 3,0 1,0 5 84928 6 Таблиця 3 Лікувальна дія бактерійного лектину на репродукцію ВПГ - 1 в культурі клітин RK13 Концентрація лектину, мкг/мл 12,5 6,2 3,1 1,55 0,77 Контроль вірусу Інфекційний титр, lg ТЦД50 3,0 3,0 2,0 2,0 5,0 5,0 Інгібування інфекційного титру, lg ТЦД 50 2,0 2,0 3,0 3,0 0 Таблиця 4 Лікувальна дія бактерійного лектину на репродукцію ВПГ - 2 в культурі клітин RK13 Концентрація лектину, мкг/мл 12,5 6,2 3,1 1,55 0,77 Контроль вірусу Інфекційний титр, lg ТЦД50 4,0 3,5 4,0 4,0 5,5 6,0 Аналізуючи результати, подані в Таблицях 1-4, слід зазначити, що при профілактичному і лікувальному впливі різноманітних концентрацій лектину - від 12,5 до 1,55мкг/мл - відзначалася виражена протигерпетична активність. Вивчення антигерпетичної активності бактерійного лектину в експериментах in vivo Антигерпетичну активність лектину вивчали на моделі герпесвірусного менінгоенцефаліту на білих безпорідних мишах. Препарати вводили по 0,2мл внутрішньочеревно; 0,1мл інтраназально; 0,2мл перорально за такими схемами: - за 24 години до інфікування - профілактична схема введення - через 24 години після зараження вірусом герпесу - лікувальна схема. Інгібування інфекційного титру, lg ТЦД 50 2,0 2,5 2,0 2,0 0,5 Кожний дослід складався із п'яти груп тварин: 1 - миші, яким внутрішньочеревно вводили лектин у концентрації 2,0мг/кг + вірус герпесу; 2 - миші, яким інтраназально вводили лектин у концентрації 1мг/кг + вірус герпесу; 3 - миші, яким перорально вводили лектин у концентрації 2мг/кг + вірус герпесу; 4 - миші, яким вводили внутрішньочеревно Віролекс у концентрації 2мк/кг + вірус герпесу; 5 - миші, яким вводили фізіологічний розчин + вірус герпесу. Перша схема дослідження антигерпетичної активності бактерійного лектину включала вивчення дії субстанції при профілактичному введенні. Результати наведені в Таблиці 5. Таблиця 5 Захисна дія бактерійного лектину при профілактичному введені мишам, заражених вірусом герпеса 1 і 2 типів Препарат лектин віролекс плацебо Із них загинуло Доза, мкг/кг Кількість мишей всього % 2,0-1,0 100,0 8 10 10 0 6 10 0 60,0 100,0 На підставі даних, наведених в Таблиці 5, можна зробити висновок, що субстанція бактерійного лектину характеризується вираженою профілактичною дією в дозі 2,0-1,0мкг/кг та повністю захищає мишей від герпетичної інфекції. КЗ IE 8,0 1,55 100,0 48,0 Інгібуючий інфекційний титр в тканині мозку мишей, lg ID 50 3,0 2,5 В наступній серії дослідів субстанцію бактерійного лектину і Віролекс вводили мишам через 24 години після їх зараження вірусом герпесу лікувальна схема. Результати наведені в Таблиці 6. 7 84928 8 Таблица 6 Захисна дія бактерійного лектину при лікувальній схемі введення мишам, зараженим вірусом герпеса 1 і 2 типів лектин віролекс плацебо Із них загинуло Доза, мкг/кг Кількість мишей всього % 2,0-1,0 100,0 Препарат 8 12 10 2 7 10 25,0 58,3 100,0 Приведені в Таблиці 6 дані свідчать про те, що досліджувана субстанція лектину проявляє виражену лікувальну дію, у зв'язку з тим, що IE=75,0, є показником антигерпетичної активності in vivo на моделі менінгоенцефаліту. Таким чином, бактерійний лектин ефективно інгібує репродукцію вірусів герпесу 1 і 2 типів, повністю захищає мишей від даної інфекції при профілактичному введенні і проявляє виражену лікувальну дію. Ме ханізм дії бактерійного лектину полягає у блокуванні поверхневих стр уктур глікопротеїнів вірусів герпесу 1 і 2 типів, в яких термінальна N ацетилнейрамінова кислота зв'язана з субтермінальною D - галактозою a 2,3-або a 2,6 - зв'язками, що запобігає подальшому інфікуванню клітинмішеней та репродукції вірусів. Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін КЗ IE 3,0 1,7 75,0 41,1 Інгібуючий інфекційний титр в тканині мозку мишей, lg ID 50 3,0 2,5 Список літератури: 1. Баринский И.Ф., Каспаров А.А., Лазаренко А.А. и др. -Инактивированная специфическая вакцина как средство иммунопрофилактики при хронических вирусных инфекциях //Биопрепараты. 2002. - №2(6). -С.18-21. 2. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К. Этиология хронических вирусных нейроинфекций. - М.: Мед., 1984. - 51с. 3. Каримова И.М. Герпесвирусная инфекция (диагностика, клиника, лечение).- М., 2004. 4. Подгорский B.C., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Лектины бактерий. - К: Наукова думка, 1992. - 2003с. 5. Сборник «Актуальные проблемы герпесвирусных инфекций». - М., 2004.-С.3-130. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601