Спосіб вирощування гетерозисних личинок гігантської устриці crassostrea gigas (th) при культивуванні в розпліднику

Спосіб вирощування гетерозисних личинок гігантської устриці Crassostrea gigas при культивуванні в розпліднику, який включає нерест устриць, схрещування, одержання личинок і їх культивування в розпліднику, який відрізняється тим, що одержують гетерозисних гібридних нащадків шляхом групового схрещування аутбредних устриць з інбредною лінією, при цьому аутбредні устриці можуть походити з будь-якої географічно ізольованої популяції, потім личинок культивують 21 добу при щільності посадки на стадії велігера 30тис. лич./л і на стадіях веліконхи і педівелігера 15тис. лич./л. UA (21) a200805366 (22) 24.04.2008 (24) 27.04.2009 (46) 27.04.2009, Бюл.№ 8, 2009 р. (72) ПІРКОВА ГАННА ВАСИЛІВНА, UA (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ ІМ. О.О. КОВАЛЕВСЬКОГО НАН УКРАЇНИ, UA (56) Hedgecock D., McGoldrick D.J., Hybrid vigor in Pacific oysters: An experimental approach using crosses among inbred lines // Journal of Shellfish Research. -1995. - Vol. 14, No. 1. - P. 229 (Abstract). Kuczer J.- С. Rappor de Stage. C.F.P.P.A. de Coutances session BPAM. - 1993 - 1994. - 79 p. (P.58). UA 76680 C2, 15.08.2006. Иванов В.Н., Пиркова А.В., Ладыгина Л.В., Попов М.А., Щуров С.В. Гигантская устрица Crassostrea gigas - потенциально перспективный объект марикультуры на Черном море. Эволюция морских экосистем под влиянием вселенцев и искусственной смертности фауны: Тезисы докладов Международной конференции, Азов, 15-18 июня, 2003. Ростов н/Д. 2003, с. 86-87, (abstract). Рус.2004-10 BI10 ВИНИТИ[ISSN 1561-7858]. C2 2 (19) 1 3 стосованість, підвищувалась з кожним поколінням і відповідно знижувалась норма реакції генотипів на змінні умови існування. В кожній популяції також зберігається високий рівень гетерозиготності, як результат вільного схрещування. При штучному схрещуванні перлинної устриці Crassostrea nippona із популяцій Японії та Китаю, в гібридах відбулося вирівнювання генетичних відмінностей, які існували між популяціями. Недоліки відомого способу: - Устриці для схрещування відібрані із природних популяцій Японії та Китаю; - Кожна популяція пристосована до місцевих умов існування; - Серед потомків відбувалося розщеплення на пристосованих і слабо пристосованих до нових умов; - Виживання знижувалося за рахунок слабо пристосованих особин. Відомий (див. McGoldrick D.J, Hedgecock, D. Hybrid vigor in Pacific oysters: An experimental approach using crosses among inbred lines // Journal of Shellfish Research. -1995. - Vol.14, No.1. -P.229; Hedgecock D. Hybrid vigor is pervasive in crosses among inbred lines of Pacific oysters // Journal of Shellfish Research. - 1996. - Vol.15, No2. -P. 577) аналог запропонованого Способу одержання гетерозисних личинок гігантської устриці. Личинок одержують при підборі батьківських пар для схрещування. При цьому кожного інбредного самця схрещували з кожною інбредною самкою; тобто при наявності 5 самців і 5 самок проводять 25 схрещувань. Гетерозис спостерігається тільки в 1 із 5 таких схрещувань. Інбредні лінії виводять при самозаплідненні кріозбереженою спермою. Сперму в замороженому вигляді зберігають на протязі року, а також підтримують життєздатність устриць, від яких вона одержана, так як інверсія статі у деяких особин С. gigas відбувається в період між двома нерестами, тобто зміна статі у особин може бути зафіксована через рік. Недоліки відомого способу: - Інбредні лінії виведені в результаті самозапліднення після інверсії статі кріозбереженою спермою; - Біотехнічна складність одержання інбредних ліній привела до засмічення маточного стаду на 60%, що підтверджено застосуванням алозимних маркерних генів; - При підборі батьківських пар гетерозисні нащадки були одержані тільки в 1 із 5 схрещувань; - В деяких випадках розміри гібридів на личинкових та ювенільній стадіях менші, ніж у інбредів на аналогічних стадіях. Найбільш близькими за технічною суттю являються принципи селекції в розпліднику SATMAR, які викладені у звіті [Kuczer J.- С. Rappor de Stage. C.F.P.P.A. de Coutances session BPAM. 1993 -1994. -79p.] На протязі 40 років, починаючи з моменту інтродукції гігантської устриці на Атлантичне побережжя Франції, відбувається її розмноження в природних умовах під контролем природного добору. Для маточного стада розплідника устриць відбирають із різних місць побережжя Франції. Штучний відбір плідників проводять за 86548 4 формою та зовнішнім виглядом раковин. Групове схрещування здійснюють між 15-20 екз. плідників віком 2-4 роки. Загальний принцип запліднення схрещування між маточним стадом розплідника і устрицями, яких кожний рік відбирають із природних поселень. Личинок вирощують при щільності посадки 5 і 2тис. лич./л відповідно на стадіях велігера і веліконхи. Недоліком відомого способу являється те, що аутбредні схрещування, які проводяться в розпліднику, не забезпечують високого рівня виживання і росту при вказаній щільності посадки личинок. В основу винаходу: Спосіб вирощування гетерозисних личинок устриціCrassostrea gigas (Th.) при культивуванні в розпліднику, поставлена задача одержання гібридних нащадків високого рівня виживання та швидкості росту при високій щільності їх вирощування. Поставлена задача досягається тим, що в запропонованому способі проводять групове схрещування аутбредних устриць з інбредною лінією, при цьому аутбредні устриці можуть бути із будьякої географічно ізольованої популяції, потім одержаних личинок культивують 21 добу при щільності посадки на стадії велігера - 30тис. лич./л, а на стадіях веліконхи і педівелігера - 15тис. лич./л. Значна перевага нащадків в рості та виживанні, в порівнянні з батьківськими формами, називається гетерозисом, а гетерозис виникає у гібридів, при схрещуванні генотипічно відмінних плідників. Гібридні нащадки являються гетерозиготними за більшістю локусів. Одна із характерних особливостей гетерозису - найбільш сильне його проявлення у гібридів першого покоління. Для одержання гетерозисних нащадків в якості плідників були використані генетично диференційовані устриці атлантичної і чорноморської когорти. Атлантична когорта устриць була одержана при схрещуванні маточного стада розплідника і устриць, відібраних із природних поселень за критерієм форми та зовнішнього вигляду раковин. Чорноморська когорта інбредних устриць була одержана в результаті багаторічного штучного добору та споріднених схрещувань на протязі пяти років. Коефіцієнт інбридінгу [Дубинин, 1985] склав не менше 0,5. Пригнічуюча дія інбридінгу виявилася в пониженні рівня виживання на личинкових стадіях, особливо на стадії раннього велігеру, а також в період переходу веліконхи в стадію педівелігера. Відзначений аномальний розвиток личинок в період формування раковини (стадія Dвелігера). Позититивний ефект при споріднених схрещуваннях проявлявся в вищепленні летальних генотипів на личинкових стадіях. В зв'язку з цим слабо пристосовані особини не залучалися в подальші схрещування. Результати виживання личинок в 2003 і 2006pp. (відповідно 25 і 21,4%) свідчать про те, що інбредний мінімум досягнутий і подальше зниження виживання в наступних інбредних поколіннях відбуватися не буде. Суть винаходу пояснюється ілюстраціями. Фіг.1 - Плідники устриці Crassostrea gigas: атлантична (зверху) і чорноморська (знизу) когорти. Фіг.2 - Гетерозисні личинки, зібрані на ситі, щільність вирощування 15тис. лич./л. 5 Фіг.3 - Ріст личинок гігантської устриці, одержаних при інбредному (№1), аутбредному (№2) схрещуваннях та гетерозисі (№3). Фіг.4 - Гетерозисні личинки на стадії пізньої веліконхи: мінімальна варіабельність розмірів і максимальний рівень виживання. Фіг.5 - Розподілення педівелігерів за показником H/L раковини. Приклад. Культивування устриць проводили в устричному розпліднику ІнБПМ НАН України в 1999-2006 pp. В 1998 p. із Карадагського відділення ІнБПМ були передані 25 екз. трьохрічних С. gigas в якості плідників, які були приблизно 10-м поколінням устриць, акліматизованих в Чорному морі. В результаті групового схрещування (10♀♀ ´ 1♂) в 1999р. в розпліднику одержали потомство гігантської устриці. Кожний рік, починаючи з 2000 до 2003pp., личинок одержували від схрещувань нащадків одних батьків (сібсів) і (або) при зворотних схрещуваннях (батьки з нащадками). В якості маточного стада використовували до 50 екз. устриць, а для схрещування відбирали біля 30 екз. віком від 1 до 4 років, (див. Фіг.1). В березні 2004p. із розплідника SATMAR (Франція) був одержаний спат С. gigas висотою раковини біля 15мм. До статевої зрілості його дорощували у виросному садку на мідійно-устричній фермі в бухті Карантинна (м. Севастополь). В 2006р. провели три типи схрещувань: №1 - між устрицями чорноморської когорти (інбридінг); №2 - між устрицями атлантичної когорти (аутбридінг); №3 - перехресне схрещування, проведене за схемою: ♀♀ чорноморська когорта ´ ♂♂атлантична когорта; ♀♀ атлантична когорта ´ ♂♂ чорноморська когорта. Кондиціонування плідників і стимуляцію їх нересту проводили згідно П. №76680 UA. Нерест кожного плідника проходив в окремій посудині з профільтрованою морською водою і аерацією. Для схрещування відбирали однакову кількість яйцеклітин від кожної самки і сперматозоїдів - від самців. Наприклад, при необхідності одержання 1млн. яйцеклітин від 20 самок, від кожної самки відбирали по 50тис. Запліднення проводили в 10л посудині, добавляючи до яйцеклітин суспензію сперматозоїдів. Через 15 хвилин після запліднення яйцеклітини збирали на ситі з діаметром вічка 32мкм, промивали фільтрованою (через 1мкм) морською водою і переносили в 100л бак з профільтрованою морською водою і аерацією. Весь процес вирощування личинок здійснювали згідно П. №76680 UA. Личинок від схрещувань №1 і №2 на протязі двох діб від моменту запліднення вирощували при щільності посадки 50тис. лич./л; на стадії велигера - при 10тис. лич./л; на стадіях веліконхи-педівелигера - 5тис. лич./л. В схрещуванні №3 щільність посадки личинок на стадії велигера 86548 6 склала 30тис. лич./л, а на стадіях веліконхипедівелігера - 15тис. лич./л (див.Фіг.2). Личинки, одержані при схрещуванні чорноморської когорти інбредних устриць з атлантичною, за темпом росту і особливо виживанням на личинкових стадіях, значно перевершували личинок від схрещувань атлантичних або чорноморських. Тривалість вирощування личинок, від моменту запліднення до осідання на субстрат, в схрещуваннях чорноморських (№1) і атлантичних устриць (№2) склала 25 діб, а в перехресному (№3) - 21 добу (Фіг.3). Середньодобовий приріст гібридних личинок за період вирощування в 1,2 рази перевищував приріст личинок від двох інших схрещувань і склав 13мкм/добу. На стадії велігера (вік 2-10 діб) темп росту личинок у всіх схрещуваннях був аналогічним. На стадіях пізньої веліконхи і педівелігера гібридні личинки перевершували в рості на 4,7мкм/добу не тільки інбредних, але й аутбредних личинок (див. Фіг.4). В цей період у всіх схрещуваннях було відзначено максимальне варіювання їх розмірів. Наприклад, коефіцієнт варіації розмірів гібридних личинок склав 11,5%; в схрещуваннях №1 і №2 - відповідно в 2,2 і 1,5 рази вище. Показник відношення висоти раковини до довжини H/L у педівелігерів характеризує форму раковини. У личинок, які готові до осідання, він змінювався в границях від 1,0 до 1,4. При значеннях, близьких до 1, личинки за формою нагадували коло; при значеннях, близьких до 1,4 - еліпс. За цим показником личинки в схрещуванні №3 займали проміжне положення (Фіг.5). В схрещуванні №1 у 70% личинок значення H/L знаходилося в границях 1,16-1,30; в схрещуванні №2 у 68% - в границях 1,06-1,15, a y 76% гібридних нащадків даний показник змінювався від 1,11 до 1,30. На протязі всього періоду вирощування виживання гібридних личинок була максимальною. Якщо в схрещуваннях №1 і №2 максимальний відхід (30 і 16,6% відповідно) відзначали на протязі 7 діб від моменту запліднення, а на 14 добу культивування в інбредному схрещуванні залишилося 52,6%; в аутбредному -72,6%, то в схрещуванні №3 нараховувалося 93,8% личинок від початкової кількості. Через три тижні доля личинок в схрещуваннях №1 і №2 склала відповідно 32,3%, і 56,3%, а в третьому схрещуванні - 86,4%. В цей період всі гібридні личинки були готові до осідання. В двох інших схрещуваннях до осідання личинок дорощували ще 4 доби. Таким чином, ефективність запропонованого способу вирощування гетерозисних личинок гігантської устриці Crassostrea gigas в розпліднику переважає в 6,7-8,2 рази ефективність відомого способу. Ефективність в даному випадку - це сумарне значення показників переважання гетерозисних личинок за швидкістю росту (в 1,2 рази) та за виживанням (в 2,5 і 4 рази) при щільності посадки личинок, яка перевищувала в три рази оптимальні значення, при яких вирощували личинок від інших схрещувань. 7 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 86548 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601