Штам f-203 соматичних структур їстівного базидіоміцету flammulina velutipes (curt.: fr.) sing.-продуцент плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями та екзо- і ендопероксидаз

Штам F-203 соматичних структур їстівного базидіоміцету Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. - продуцент плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями та екзо- і ендопероксидаз. (19) (21) 2004032388 (22) 31.03.2004 (24) 15.12.2004 (46) 15.12.2004, Бюл. № 12, 2004 р. (72) Федотов Олег Валерійович 3 3863 4 Поставлене завдання вирішується тим, що Інживильних середовищах. Плодові тіла утворює як тродукований штам F-203 макроскопічного гриба у пробірках, так і в чашках Петрі по всій поверхні Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. добре росте і колонії. плодоносить та виявляє значний рівень вмісту Мікроскопічні дослідження свідчать, що гі фи антиокисних речовин у міцелії і плодових тілах та гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження активно синтезує екзо- і ендопероксидази на жидихотомічне, тісно сплітаються між собою. Добре вильних середовищах, які складаються з дешевих спостерігаються стінки і багаточисельні перегорота доступних компонентів (наприклад, зволожене дки гіф. Перегородки утворюються як в місцях лушпиння соняшника, глюкозо-пептонне середоз'яви пряжок, так і між клітинами без пряжок. Стінвище, тощо). ки незабарвлені, їх апекси характеризуються гомоОтриманий штам F-203 макроскопічного гриба генною структурою протоплазми. Ширина гіф доріFlammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. має наступні внює 3-8 мкм, а довжина клітин - від 15 до 70 і характеристики. більше мкм. З часом, в віці 5 діб і більше, в клітиШтам F-203 Flammulina velutipes отримано за нах міцелію з'являються вакуолі та жирові вклюметодом виділення чистих культур базидіоміцетів чення. Формування примордіїв коричневого кольоз плодових тіл [4, 6]. Гриб мешкав на деревині ру супроводжується забарвленням міцелію від ушкодженого листяного дерева Acer hyrcanum жовтуватого до коричневого відтінків, особливо Fisch. et Mey. - клен гірканський в дендрарії Донеповітряних гі ф. цького ботанічного саду НАН України. Для визначення лінійної швидкості росту та Культурально-морфологічні ознаки. ростового коефіцієнту (РК) [4, 7], штами Р-01, F-vv, Штам F-203 досліджували на сусло-агарі, глюF-203 вирощували на агаризованому глюкозокозо-картопляному агарі (ГКА), лушпинні соняшнипептонному середовищі. Культивування проводика, та рідких глюкозо-пептонному і суслоли в пробірках та чашках Петрі при оптимальній пептонному живильних середовищах. температурі росту цих штамів - 25°С. З даних табНа сусло-агарі і ГКА у ча шках Петрі, міцелій лиці 1, бачимо, що найвищу лінійну швидкість росрозповсюджується рівномірно. Субстратні і повітту у пробірках мав штам F-203. Найменша швидряні гіфи розвиваються одночасно. Краще розвикість росту при цих умовах зафіксована для штаму нуті субстратні гі фи. Колонія гриба має круглу фоF-vv. Ріст штамів грибів спостерігали і в чашках рму, більш щільна в центрі. Останнє пов'язане з Петрі. Так, найвищу лінійну швидкість росту у чашдодатковим розгалуженням і ростом гіф близько ках Петрі виявив штам Р-01. Найбільш повільно місця інокуляції, і не є наслідком температурних чи ріс при цій температурі штам F-vv. Взагалі, за лісвітлових умов культивування. Колір колонії сніжнійною швидкістю росту у пробірках, штами вірогіно - білий, з віком, на 10-25 добу, забарвлюється дно не відрізнялися. За лінійною швидкістю росту від світло-жовтого до світло іржавого, починаючи з у чашках Петрі, штам F-vv мав вірогідно найнижчі центра колонії. Субстрат не забарвлює. Текстура значення. У таблиці 1, також, представлено дані міцелію бавовняна, вовняна, висота повітряних гіф розрахунку РК досліджених штамів. Штам F-203 становить близько 1 мм. На застосованих для має найнижчий РК. Це пояснюється більш повним культивування живильних середовищах, колонія врахуванням показників росту колонії грибів при має специфічний грибний запах. По мірі появи застосуванні цього методу: штам мав низькі знабагаточисельних пряжок і тяжів, починають форчення висоти і щільності колонії. На відміну від муватися примордії. Спостерігали утворення прилінійної швидкості росту, штами за РК вірогідно мордій без подальшого плодоношення і на рідких відрізняються між собою. Таблиця 1 Лінійна швидкість росту і ростові коефіцієнти досліджених штамів Штам F-203 F-vv Р-01 Лінійна швидкість росту, мм/добу у пробірках у чашках Нетрі 7,80±0,50 7,15±0,89 5,24±0,73 5,18±1,03 6,08±2,93 7,54±3,00 Ріст міцелію штаму F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. відмічали в інтервалі температур від 1° до 38°С. Для визначення впливу температури на ріст штамів, культури вирощували у пробір РК 31±1 56±1 63±2 ках на скошеному сусло-агарі при температурах від 20 до 35°С з інтервалом 2,5°С. Дані лінійної швидкості росту штамів грибів представлені в таблиці 2. 5 3863 6 Таблиця 2Вплив температури культивування на лінійну швидкість росту досліджених штамів Температура росту, °С F-203 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 4,96±0,63 5,89±0,50 7,34±0,27 5,06±0,78 4,15±0,33 2,50±0,61 0,87±0,31 Штам F-vv Лінійна швидкість росту, мм/ добу 4,43±0,79 5,69±0,37 6,12±0,41 4,10±0,50 3,36±0,33 2,12±0,30 0,73±0,21 Отже, дослід показав суттєвий вплив температури на лінійну швидкість росту досліджених штамів. Температурний оптимум росту запропонованого штаму F-203 на агаризованому середовищі знаходиться в межах від 22,5 до 27,5°С; на рідких живильних середовищах - від 24,0 до 27,5°С. На рідких сусло-пептонному і глюкозо-пептонному живильних середовищах, штам F-203 при поверхневому способі культивування утворює рівно розвинуті всі типи міцелію. Культуральний фільтрат (КФ) не забарвлює. Колонія гриба у 3-7 денному віці складається з окремих міцеліальних кульок, переважно занурених у середовище. При подальшому культивуванні, міцелій зростається. На 15-20 добу росту, на поверхні міцеліальної плівки утворюються примордії коричневого кольору. Утворення плодових тіл на рідкому живильному середовищі не спостерігали. Фізіолого-біохімічні ознаки. Відношення до джерел вуглецевого живлення. Вивчався вплив різних джерел вуглецю на ріст і біосинтез біологічно активних речовин штамом F203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. Встановлено, що утилізація моно-, ді- та полісахаридів протікає з різною швидкістю. Найвище накопичення біомаси спостерігається при вирощуванні гриба на рідкому глюкозо-пептонному середовищі, яке в якості вуглецевого живлення містило лактозу, мальтозу, манніт, глюкозу або галактозу, дуже повільний ріст та біосинтез - рамнозу, яблуневу кислоту, дульцит або рафінозу. Високий рівень антиокисної активності (АОА) міцелію, пероксидазної активності (ПА) відмічається в віці 20 діб при культивуванні штаму на живильному середовищі, яке містило мальтозу, крохмаль, ксилозу, або фруктозу. Не зареєстровано АОА міцелію, ПА штаму F-203 Flammulina velutipes в віці 20 діб, що вирощували на середовищах з сорбітом, інозитом або Р-01 6,25±1,07 8,13±0,49 9,13±0,43 7,94±2,05 9,00±0,85 7,13±0,30 0,13±0,08 яблуневою кислотою. АОА, біосинтез пероксидаз вірогідно не пов'язані з рівнем накопичення штамом вегетативної маси. Відношення до джерел азотного живлення. Вивчення придатності неорганічного (амонійного і нітратного) та органічного (ферментативний пептон, сечовина, амінокислоти) азоту для живлення штаму F-203 засвідчило, що тільки на середовищі з пептоном йде швидке накопичення біомаси, синтез пероксидаз і сполук з антиокисною дією. За рівнем АОА міцелію і плодових тіл штами F-vv та F-203 вірогідно не відрізняються. Вплив температури культивування на ПА штамів Flammulina velutipes. Враховуючи попередньо отримані експериментальні дані, штами F-vv і F-203 культивували в колбах Ерленмейєра на рідкому глюкозо-пептонному середовищі при 22,5; 25,0; 27,5 та 30,0°С протягом 20 діб. ПА міцелію визначали із застосуванням фотоелектроколориметра (табл. 3) [7]. Найбільш придатними для росту є 25,0°С. ПА штаму F-203 з підвищенням температури зростає, а штаму F-vv - підвищується до температури культивування 27,5°С і при 30,0°С зменшується до початкового рівня. Накопичення біомаси, зміна рН та ПА міцелію в залежності від температури культивування мають максимуми, які не співпадають. Динаміка росту та П А штаму F-203. Враховуючи вірогідно високу ПА міцелію штаму F-203, визначали динаміку росту та ПА цього штаму під час культивування на рідкому глюкозо-пептонному середовищі протягом 20 діб при 27,5 та 30,0°С. Це пояснюється тим, що для вирощування штамів в промислових умовах біотехнологічного виробництва важливо точно знати вік та умови культивування штаму, при яких він набуває корисних властивостей в залежності від мети культивування. Таблиця 3 Вплив температури культивування на динаміку росту, рН живильного середовища та пероксидазну активність штамів Flammulina velutipes Штам Температура, °С Біомаса,г/л рН F-203 22,5 25,0 2,86±0,12 4,16±0,02 5,88 6,50 ПА міцелію, × 10-2 ум. од. 20,3±2,3 47,8±1,5 7 Штам 3863 8 Продовження таблиці 3 Температура, °С рН 27,5 30,0 22,5 25,0 27,5 30,0 F-vv Біомаса,г/л 3,84±0,12 2,54±0,12 2,82±0,16 4,18±0,10 3,38±0,08 1,94±0,02 6,01 6,73 5,83 6,19 6,26 6,34 Дані з накопичення біомаси, зміни кислотності живильного середовища та ПА екзо- і ендогенної природи штаму F-203 надані в таблиці 4. За накопиченням біомаси найбільш придатною температурою є 30,0°С в віці культури 20 діб, де вона вище в 1,36 рази, ніж в тому ж віці при 27,5°С. Зміна рН КФ також має свої від'ємності при культивуванні на різних температурах. При 27,5°С вона поступово підвищується до 15-добового віку культури і повільно зменшується при 20- добовому. Культи ПА міцелію, × 10-2 ум. од. 75,0±2,7 76,6±2,5 20,3±2,1 26,3±3,1 35,0±2,8 20,3±1,7вування штаму при 30°С веде до поступового зниження рН КФ у 15-добового віці, та незначне підвищення в 20-ти денному. Встановлена активність екзогенної пероксидази у КФ. Найбільш високий її рівень - 31,3 × 10-2 ум. од. було зафіксовано при 27,5°С на 10-ту добу культивування. Ферментація при 30°С характеризується незначним, в межах 3 - 4,4 × 10-2 ум. од., рівнем активності позаклітинної пероксидази. Таблиця 4 Вік культури, доба Вплив температури культивування на динаміку росту, рН живильного середовища та пероксидазну активність штаму F-203 Flammulina velutipes 5 10 15 20 Біомаса, г/л 27,5 0,14±0,12 1,40±0,50 3,24±0,10 4,82±0,16 30,0 0,18±0,06 0,92±0,24 1,89±0,12 6,54±0,68 ПА міцелію, × 10-2 ум. од. Температура, °С 27,5 30,0 27,5 30,0 5.52 6,46 5,2 3,3 5,96 6,38 31,3 25,0 6,14 5,85 7,8 4,7 6,04 5,96 75,2 72,3 ПА міцелію, як показали досліди, має два максимуми в віці 10-ти та 20-ти діб. Цікаво відмітити, що др угий максимум вищий за перший. Максимум ПА міцелію в 10-ти добовому віці співпадає з такою активністю КФ. За рівнем ПА в 10-ти добовому віці на першому місці стоїть міцелій, що ріс при 27,5°С, а у 20-ти добовому віці - міцелій, що ріс при 30°С. Приклад конкретного виконання 1. Штам F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. - отримано за методами, які звичайно застосовуються для одержання чистих культур макроміцетів, а саме вилученням "тканинних" ізолятів з свіже зібраних плодових тіл [4, 6]. Плодові тіла гриба зібрано на деревині ушкодженого листяного дерева Acer hyrcanum Fisch. et Me y. в дендрарії Донецького ботанічного саду ПАН України. Чисту міцеліальну культуру штаму підтримують шляхом пересівів через 5-6 місяців на агаризоване знехмілене пивне сусло (4° по Баллінгу), чи інші агаризовані живильні середовища [4, 8]. Для вивчення АОА, ПА штам F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. вирощують на рідкому глюкозо-пептонному середовищі або знехміленому пивному суслі (4° по Баллінгу), яке містить 3 г/л ферментативного пептону. Кислотність середовища після стерилізації становить 5,5 - 5,8 рН. Культуру вирощують в колбах Ерленмейера місткістю 250 мл з об'ємом середовища - 50 мл. Культиву рН ПАКФ, × 10-2 ум. од. 27,5 2,8 31,3 7,8 3,8 30,0 3,6 3,3 4,4 3,0 ють поверхнево, при температурі 27,5±0,5°С. Посівним матеріалом є 10-15 денна культура гриба, яка зростала на агаризованому живильному середовищу. Термін культивування - 20 діб. Для отримання плодових тіл, штам вирощують за інтенсивною технологією [8]. Визначають АОА культурального фільтрату, вегетативного міцелію або плодових тіл штаму F203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. за методом [2], який базується на оцінці інтенсивності гальмування нагромадження продуктів перекисного окислення жовткових ліпопротеїдів (ЖЛП), що реагують з тіобарбітуровою кислотою з утворенням забарвленого продукту. Далі на спектрофотометрі в водній фазі вимірюють оптичну густину контрольної та дослідних проб проти нульової проби при довжині хвилі 532 нм. Антиокисну активність мікологічного матеріалу розраховують за модифікованою формулою [2]: DDK - DDКФ( КГ ) . . AOA = p 100% , DDK де, DDK = Dt - D0 , DDКФ (МГ ) = Dt КФ( МГ ) - D0 КФ(МГ ); K K D0 , D0 ( МГ ) K КФ - оптична густина, виміряна в суспензії ЖЛП (контрольній пробі) і в суспензії ЖЛП з культуральним 9 3863 10 фільтратом (міцеліальним гомогенатом) до інкухвилину в оптимальних умовах. Розрахунки проводять за формулою [7]: бації; Dt , Dt - оптична густина, виміряна в тих K КФ(МГ ) же зразках в момент часу t (після 15 хвилин інкубації); р - коефіцієнт розведення. Визначення DDK , D DКФ - потрібно для того, щоб врахува ти вихідний рівень окислення суспензії ЖЛП та культурального фільтрату чи міцеліального гомогенату. При визначенні та розрахунку АОА мікологічного матеріалу можливі як позитивні так і негативні значення. Від'ємна АОА співпадає за абсолютним значенням з позитивною окисною активністю. Визначають ПА культурального фільтрату, вегетативного міцелію або плодових тіл штаму F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. за методом, який базується на визначенні за допомогою фотоелектроколориметра інтенсивності забарвлення продукту окислення о-діанізидину перекисом водню, який утворився при дії пероксидази. Одиниця пероксидази відповідає кількості ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоля Н 2О2 за одну X= E. V1 .p , E1.K . V2 .t де, Х - активність ферменту пероксидази; Е екстинкція; V1 - об'єм забарвленої проби; V2 - об'єм КФ або міцелію; Е1 - коефіцієнт мікромолярної екстинкції (0,0128); К - коефіцієнт для перерахунку з міліметрів у літри (1000); t - час інкубації (5 хв); р - розведення. Данні досліду з АОА і П А міцелію штамів зимового опенька і гливи звичайної, що вирощували в колбах Ерленмейєра на штучному глюкозопептонному середовищі представлені в таблиці 5. Найвища АОА - близько 76% виявлена в міцелії штамів F-203 та F-vv зимового опенька, різниця не є вірогідною. АОА штаму Р-01 гливи звичайної більше ніж в 3 рази нижча. ПА штаму F-203 вірогідно вища. Таблиця 5 Антиокисна та пероксидазна активність міцелію дослідних штамів Штам F-203 F-vv Р-01 Біомаса, г/ л 5,94±0,67 6,38±1,82 7,24±0,18 Приклад конкретного виконання 2. Промислова, інтенсивна технологія вирощування міцелію їстівних грибів з метою отримання плодових тіл потребує можливості використання некоштовних субстратів, високопродуктивних та стійких до несприятливих факторів штамів, якісного посівного міцелію. У якості субстрату застосовували свіже, не заражене сторонньою мікрофлорою, лушпиння соняшника - відхід переробки насіння соняшника у харчовій промисловості, або суміш лушпиння соняшника і тирси листяних порід у співвідношенні 1:1. Підготовка субстрату, його інокуляція. Субстрат заливають водою. Від температури води залежить час зволоження субстрату. При температурі води 15 - 25°С, субстрат ви тримують 12 годин; при 50 - 60°С - 3-4 години. Вологість субстрату після замочування становить 65 - 70%. Потім субстрат по 100 г вміщують у колби і стерилізують при 0,15 - 0,18 МПа (1,5 - 1,8 кгс/ см 2), температурі пару 126,8 - 130,6°С протягом 90 - 120 хв. Після стерилізації і повітряного охолодження до 23-25°С, субстрат інокулюють міцелієм штаму F-203. Заростання субстрату міцелієм при температурі приміщення 20 - 22°С йде близько 20 діб. Внутрішня температура субстрату, при заростанні міцелієм, підвищується на 2-4°С, що співпадає з оптимумом росту. Ініціація плодоношення наступає на 25 добу культивування. Освітлення культиваційних приміщень. Перші тижні росту міцелію і плодових тіл майже не потребують освітлення. З моменту масової появи плодових тіл, забезпечують оптимальну силу світла 700 - 800 лк на годину. Визначали АОА штучно отриманих подових тіл АОА, % 75,9±2,3 76,5±3,6 24,7±1,5 ПА міцелію, × 10-2 ум. од. 75,0±2,7 31,7±1,3 не визначали штаму F-203. Плодові тіла штаму F-203 мають АОА, що дорівнює 60,5 ± 4,5% в ніжках і 72,0 ± 5,6% в шляпках. Приклад конкретного виконання 3. Мікроміцети родів Aspergillus, Penicillum та Trichoderma виявляють сильний антагонізм до різних культур їстівних грибів. Вивчали взаємодію штаму F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing.) - зимового опенька і мікроміцетів в змішаній культурі у чашках Петрі на ГКА. Культури вирощували у сухоповітряному термостаті ТС-80-М-2 при температурі 25,0°С. Встановлено, що дослідний штам зимового опенька є стійким і конкурентноздатним до мікроміцетів. Таким чином, запропонований штам F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing.) здатний до плодоношення та утилізації лушпиння соняшника відходу харчової промисловості та тирси листяних порід дерев - відходу деревопереробної промисловості. Штам F-203 має вміст антиокисних речовин як у міцелії, що дорівнює 75,9±2,3%; так і в плодових тілах, що дорівнює 60,5±4,5% в ніжках і 72,0±5,6% в шляпках. Штам F-203 Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. стійкий і конкурентоздатний до мікроміцетів. За рахунок цього може бути використаним у грибівництві і різних галузях харчової, переробної, фармацевтичної промисловості як лікувально-профілактичний засіб. Джерела інформації, які використані при укладанні заявки: 1. Патент 46461 А України. Штам соматичних структур їстівного базидіоміцета Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm. P-01 - продуцента пло 11 3863 12 дових тіл і міцелію з антиокисними властивостями 7. Дудка И.А., Вассер СП., Элланская И.А. Ме/Федотов О.В., Вовк Н.В. Заявка №2001075193, від тоды экспериментальной микологии. Справочник. 20.07.01, кл. 7C12N1/14, A01G1/04, Бюл. №5, від - Киев: Наук, думка, 1982. - 550 с. 15.05.02. 8. Дудка И.А., Бисько Н.А., Билай В.Г. Культи2. Патент 64129 А України. Штам соматичних вирование съедобных грибов. - Киев: Урожай, структур їстівного базидіоміцета Flammulina 1992. - 160 с. velutipes (Curt.: Fr.) Sing. F-vv - продуцента плодо9. Капич А.Н. Биосинтетическая активность вих тіл і міцелію з антиокисними властивостями/ дереворазрушающи х базидиомицетов при глубинФедотов О.В., Горяшник Ю.В. Заявка ном культивировании // Микол, и фитопатол. №2003020945, від 04.02.2003, кл. 7C12N1/14, 1990. - 24, №5. - С 377- 384. A01G1/04, Бюл. №2, від 16.02.04. (прототип). 10. Капич А.Н., Шишкина Л.Н. Ан тиоксидант3. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из ные свойства дереворазрушающи х базидиомицевысших грибов - объект патентно-правовой охратов // Микол, и фитопатол. - 1992. - 26, №6. - С. ны // Микология и фитопатология. - 1992. - 26, вып. 486-492. 4. - С. 321-324. 11. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы ис4. Бисько Н.А., Бухало А.С., Вассер СП. и др. пользования высших базидиомицетов в микробиВысшие съедобные базидиомицеты в чистой ологической промышленности// ВНИСЭТИ: Обзокультуре. - Киев: Наук, думка, 1988. - 144 с. рная информация, сер.3. - М., 1985. - 48с. 5. Бухало А.С., Соломко Е.Ф., Митропольская 12. Eriksson К.-Е., Blanchette R.A., Ander P. Н.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими власMicrobial and enzymatic degradation of wood and тивостями // Укр. ботан. журн. - 1996. - 53, №3. - С wood components. Berlin, Heidelberg: Springler192-201. Verlag, 1990. 6. Дудка И.А., Вассер СП., Бухало А.С и др. 13. Tardif A. La Mycotherapie où Les propriétés Промышленное культивирование съедобных гриMedicinales des Champignons. - Paris, 2000. - 167 p. бов. - Киев: На ук, думка, 1978. - 264 с. Комп’ютерна в ерстка А. Крулевский Підписне Тираж 37 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститупромислов ої в ласності”, вул. Глазунов а, 1, м. Київ – 42, 01601