Штам соматичних структур їстівного базидіоміцета flammulina velutipes (curt.: fr.) sing. f – vv – продуцента плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями

Винахід відноситься до мікології і біотехнології та може бути використаний у грибівництві, на підприємствах харчової, переробної та інших галузей промисловості. Однією з найактуальніших проблем в Україні є розробка способів отримання екологічно чистих харчови х продуктів і лікувально-профілактичних медпрепаратів на основі використання природних запасів лікарської рослинної сировини з імуностимулюючою, онкостатичною, радіопротекторною та загально зміцнюючою дією та інтродукції продуцентів лікарських речовин в культур у. Потреба розв'язання цієї проблеми обумовлена погіршенням стану здоров'я більшої частини населення України в наслідок загальної екологічної кризи [2,7,17]. Встановлено, що дереворуйнівні гриби здатні до синтезу різноманітних речовин, в тому числі сполук з лікарськими властивостями, придатних до вживання у різних галузях промисловості [8,12-14,18,19]. Відомий штам Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. - 48 IBHP ВТ. Плодове тіло 6-11см висотою, 3-6см шириною, шляпка яйцеподібна. Ніжка 3-9см довжиною, 2-3см товщиною, колоподібна, білувата. Спори 18-20х1012мкм, циліндричні, гладкі, одноклітинні. рН культивування близька до нейтральної, оптимальна температура вирощування 24-26°С. Недоліками штаму є необхідність холодового стресу, висока світлочутли вість. Ці недоліки підвищують енергоємність технології виробництва. Для здійснення холодового циклу в культиваційній споруді необхідно встановити холодильні агрегати великої мощі, що перманентно вмикаються. Це технічно важко виконати та економічно не виправдано. Для ініціації плодоношення потребується освітлення в межах 7-8 тисяч люкс, таким чином, штам потребує стільки ж світла, як і овочеві культури закритого ґрунту. Не повідомляється про антиокисні властивості міцелію і плодових тіл [1]. Запатентовано штам макроміцету Pleurotus ostreatus ВКМГ-2465Д - продуцент плодових тіл їстівних грибів на відходах лісової та лісопереробної промисловості. Штам ВКМГ-2465Д у інтенсивному виробництві не використовується. Він не плодоносить без холодового шоку. Цей штам чутливий до недоліку освітлення. В якості субстрату для цього штаму використовують деревину - коштовн у сировину. Не вивчена антиокисна активність штаму [1]. Найбільш близький за технічною суттю і досяжності результату є штам гливи звичайної штам Р-01 Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm., здатний до утилізації лушпиння соняшника - відходу харчової промисловості. Штам Р-01 має вміст антиокисних речовин як у міцелії, що дорівнює 32,11±1,69%; так і в плодових тілах, що дорівнює 32,15±3,61%. Культура Р-01 Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. є стійкою і конкурентоздатною до мікроміцетів. За рахунок цього може бути використаним у грибівництві і різних галузях харчової промисловості, як лікувальнопрофілактичний засіб. В основу винаходу поставлено завдання отримання нового штаму соматичних структур нового базидіального дереворуйнівного гриба - зимового опенька Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. - F-vv - який відрізняється від прототипу підвищеною здатністю до синтезу антиокисних речовин. Поставлене завдання вирішується тим, що інтродукований штам F-vv макроскопічного гриба Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. добре плодоносить і виявляє значний рівень вмісту антиокисних речовин у міцелії і плодових тілах на живильних середовищах, які складаються з дешевих та доступних компонентів (наприклад, зволожене лушпиння соняшника, глюкозо-пептонне середовище). Отриманий штам F-vv макроскопічного гриба Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing.. має наступні характеристики. Штам зимового опенька Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. - F-vv виділено за методом виділення чистих культур базидіоміцетів [3-5] з природної популяції, з плодових тіл, які росли на пні робінії (Robinia pseudoacacia L.) біля автомобільної траси у екологічно небезпечному районі м.Донецька. Культурально-морфологічні ознаки. Штам F-vv досліджували на сусло-агарі, глюкозокартопляному агарі (ГКА), лушпинні соняшника, та рідких глюкозо-пептонному і сусло-пептонному живильних середовищах. На сусло-агарі і ГКА у ча шках Петрі, міцелій розповсюджується рівномірно. З початку розвиваються субстратні, а потім - повітряні гіфи. Краще розвинуті субстратні гіфи. Колонія гриба має круглу форму, більш щільна в центрі. Останнє пов'язане з нерівномірним ростом гіф гриба на протязі доби, який не є наслідком температурних чи світлови х умов культивування. Колір колонії сніжно-білий, з віком, на 10-25 добу, забарвлюється від світло-жовтого до світло іржавого. Субстрат не забарвлює. Текстура міцелію бавовняна, вовняна, висота повітряних гіф становить близько 1мм. На застосованих для культивування живильних середовищах, колонія має специфічний грибний запах. По мірі появи багаточисельних пряжок і тяжів, починають формуватися примордії. Утворює плодові тіла як у пробірках, так і в ча шках Петрі по всій поверхні колонії. Мікроскопічні дослідження свідчать, що гі фи гриба гілчасті, звивисті, з початку їх розгалуження дихотомічне, тісно сплітаються між собою. Добре спостерігаються стінки і багаточисельні перегородки гіф. Перегородки утворюються як в місцях з'яви пряжок, так і між клітинами без пряжок. Стінки незабарвлені, їх апекси характеризуються гомогенною структурою протоплазми. З часом, на 5 добу і більше, в клітинах міцелію з'являються вакуолі та жирові включення. Формування примордіїв супроводжується появою жовтуватого забарвлення міцелію, особливо повітряних гіф. Ширина гіф дорівнює 3-8мкм, а довжина клітин - від 15 до 70 і більше мкм. Для визначення ростового коефіцієнту та лінійної швидкості росту [5,10], штами, що культивують для отримання плодових тіл у грибівництві, гливи флоридської P-fl і гливи звичайної Р-20, НК-35 та новий штам зимового опенька F-vv вирощували на агаризованому глюкозо-пептонному середовищі. Культивування грибів проводили в пробірках та чашках Петрі при оптимальній температурі для росту ци х штамів - 24°С. З даних таблиці 1, бачимо, що найвищу лінійну швидкість росту у пробірках мав штам НК-35. Найменша швидкість росту при цих умовах зафіксована для штаму F-vv. Ріст штамів грибів спостерігали і в чашках Петрі. Так, найвищу лінійну швидкість росту у ча шках Петрі теж мав штам Р-01. Найнижча швидкість росту при цій температурі була у штаму F-vv. Взагалі, за лінійною швидкістю росту у пробірках, штами достовірно не відрізнялися. За лінійною швидкістю росту у чашках Петрі, штам F-vv мав достовірно найнижчі значення. У таблиці 1, також, представлено дані розрахунку ростового коефіцієнту досліджених штамів [5,6]. Цікаво відмітити, що найвищій РК-135±4ум.од. мав штам Р-20, який не виявив високої лінійної швидкості росту. Це пояснюється більш повним врахуванням показників росту колонії грибів при застосуванні цього методу визначення росту міцелію. Низький ростовий коефіцієнт відмічено у штамів Р-01 і P-fl. Це пояснюється тим, що у культурі на агаризованому суслі у ча шках Петрі ці штами мали низькі значення висоти і щільності колонії. Найнижчий РК виявив штам зимового опенька. На відміну від лінійної швидкості росту, штами, крім Р-01 і P-fl, за ростовим коефіцієнтом достовірно відрізняються між собою. Таблиця 1 Лінійна швидкість росту і ростовий коефіцієнт досліджених штамів Штам F-vv Р-01 Р-20 НК-35 P-fl Лінійна швидкість росту, мм/добу у чашках у пробірках Петрі 5,24±0,73 5,18±1,03 6,08±2,93 7,54±3,00 6,21±3,18 6,50±3,21 7,43±2,98 7,38±1,20 7,04±3,04 7,21±2,47 РК 56±1 63±2 135±4 100±4 62±2 Для визначення впливу температури на ріст штамів, культури вирощували у пробірках на скошеному суслоагарі при температурах від 20 до 35°С з інтервалом 2,5°С, дані лінійної швидкості росту штамів грибів представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Вплив температури культивування на лінійну швидкість росту досліджених штамів Температура росту, °С 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,535,0 P-fl 6,38±0,58 7,25±0,33 7,50±0,23 9,63±1,09 7,50±0,18 6,69±1,21 1,06±0,10 Штам Р-01 Р-20 Лінійна швидкість росту, мм/добу 6,25±1,07 6,31±0,74 8,13±0,49 7,81±0,47 9,13±0,43 7,81±1,88 7,94±2,05 9,31±0,56 9,00±0,85 6,38±1,51 7,13±0,30 6,13±0,31 0,13±0,08 1,09±0,15 НК-35 5,13±0,28 7,69±0,42 7,88±0,25 9,06±0,47 7,38±0,30 3,63±0,50 0,94±0,14 F-vv 4,43±0,79 5,69±0,37 6,12±0,41 4,10±0,50 3,36±0,33 2,12±0,30 0,73±0,21 Таким чином дослід показує суттєвий вплив температури на лінійну швидкість росту штамів. Температурний оптимум росту запропонованого штаму F-vv знаходиться в межах від 22,5 до 25,0°С. Ріст міцелію штаму Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing.-F-vv відмічали в інтервалі температур від 1° до 38°С. Температурний оптимум росту штаму F-vv на агаризованих середовищах знаходиться в межах 22,5-25,0°С; на рідких живильних середовищах - 24,0-27,5°С. На рідких сусло-пептонному і глюкозо-пептонному живильних середовищах, штам Fvv, при поверхневому способі культивування, утворює рівно розвинуті всі типи міцелію. Культуральний фільтрат не забарвлює. Фізіолого-біохімічні ознаки. Відношення до джерел вуглецевого живлення. Вивчався вплив різних джерел вуглецю на ріст і біосинтез антиокисних речовин штамом F-vv Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. Встановлено, що утилізація моно-, ді- та полісахарідів протікає з різною швидкістю. Найвище накопичення біомаси спостерігається при вирощуванні гриба на рідкому живильному середовищі, яке містило лактозу, мальтозу, манніт, глюкозу чи галактозу, дуже слабке рамнозу, яблуневу кислоту, дульцит чи рафінозу. Ан тиокисна активність (АОА) міцелію не пов'язана з рівнем накопичення штамом вегетативноїмаси. Високий рівень АОА міцелію відмічається в віці 20 діб при культивуванні штаму на живильному середовищі, яке містило мальтозу, крохмаль, ксилозу, та фр уктозу. Не зареєстровано антиокисну активність міцелію штаму F-vv Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. - в віці 20 діб, що вирощували на середовищах з сорбітом, інозитом та яблуневою кислотою. Відношення до джерел азотного живлення. Вивчення придатності неорганічного (амонійного і нітратного) та органічного (ферментативний пептон, сечовина, амінокислоти) азоту для живлення штаму F-vv засвідчило, що тільки на середовищі з пептоном йде швидке накопичення біомаси і сполук з анти окисною дією. Штам F-vv Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. на рідкому глюкозо-пептонному середовищі на 20-25 добу культивування має найвищий рівень накопичення біомаси, яка дорівнює 6,38±1,'824г/л. Оптимум рН для накопичення біомаси штамом F-vv знаходиться в межах 5,10-5,37 одиниць. Приклад конкретного виконання 1. Штам F-vv Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. - отримано за методами, які звичайно застосовуються для одержання чистих культур макроміцетів, а саме вилученням "тканинних" ізолятів з свіже зібраних плодових тіл [3-5]. Плодові тіла гриба зібрані на пні робінії (Robinia pseudoacacia L.) біля автомобільної траси у екологічно небезпечному районі м.Донецька. Чисту міцеліальну культур у штаму підтримують шляхом пересівів через 5-6 місяців на агаризоване знехмілене пивне сусло (4° по Баллінгу), чи інші агаризовані живильні середовища. Для вивчення АОА, штам F-vv Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. вирощують на рідкому глюкозопептонному середовищі або знехміленому пивному суслі (4° по Баллінгу), яке містить 3г/л ферментативного пептону. Кислотність середовища після стерилізації становить 5,3-5,5рН. Культуру вирощують в колбах Ерленмейера місткістю 250мл з об'ємом середовища - 50мл. Культивують поверхнево, при температурі 27,5±0,5°С. Посівним матеріалом є 10-15 денна культура гриба, яка зростала на агаризованому живильному середовищу. Термін культивування - 20 діб. Для отримання плодових тіл, штам вирощують за інтенсивною технологією. Визначають АОА к ультурального фільтрату, вегета тивного міцелію або плодових тіл штаму F-vv Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. за методом [15], який базується на оцінці інтенсивності гальмування нагромадження продуктів перекисного окисления жовткових ліпопротеїдів (ЖЛП), що реагують з тіобарбітуровою кислотою з утворенням забарвленого продукту. Далі на спектрофотометрі в водній фазі вимірюють оптичну густин у контрольної та дослідних проб проти нульової проби при довжині хвилі 532нм. Антиокисну активність мікологічного матеріалу розраховували за модифікованою формулою [15]: DDK - DDКФ (МГ ) AOA = × p × 100% DDK 0 де, DDK = Dt - D0 , DDКФ(МГ ) = Dt (МГ ) - D0 ( МГ ) ; DK , D0 (МГ ) - оптична густина, виміряна в суспензії ЖЛП K K КФ КФ КФ (контрольній пробі) і в суспензії ЖЛП з культуральним фільтратом (міцеліальним гомогенатом) до інкубації; DtK, DtКФ(МГ) - оптична густина, виміряна в тих же зразках в момент часу t ( після 15 хвилин інкубації); р - коефіцієнт розведення. Визначення DDK , DDКФ - потрібно для того, щоб врахувати вихідний рівень окислення суспензії ЖЛП та культурального фільтрату чи міцеліального гомогенату. При визначенні та розрахунку АОА мікологічного матеріалу можливі як позитивні так і негативні значення. Від'ємна АОА співпадає за абсолютним значенням з позитивною окисною активністю. Данні досліду з антиокисної активності міцелію штамів зимового опенька і гливи звичайної, що вирощували в колбах Ерленмейєра на штучному глюкозо-пептонному середовищі представлені в таблиці 3. Найвища АОА близько 76% виявлена в міцелії штаму F-vv зимового опенька і висока для штаму Р-01 гливи звичайної, що були виділені з природних джерел. Найменше значення АОА - близько 5% спостерігали у міцелії штаму Р-20. Штами НК-35 і P-fl не відрізняються за величиною АОА міцелію. Таблиця 3 Антиокисна активність міцелію дослідних штамів Штам F-vv Р-01 Р-20 НК-35 P-fl Біомаса, г/л 6,38±1,82 7,24±0,18 5,06±0,18 7,13±0,42 3,66±0,22 АОА, % 76,47±3,56 24,70±1,45 5,04±1,17 12,49±3,27 12,17±4,56 Приклад конкретного виконання 2. Промислова, інтенсивна технологія вирощування міцелію їстівних грибів з метою отримання плодових тіл потребує можливості використання не коштовних субстратів, високопродуктивних та стійких до несприятливих факторів штамів, якісного посівного міцелію. У якості субстрату застосовували свіже, не заражене сторонньою мікрофлорою, лушпиння соняшника - відхід переробки насіння соняшника у харчовій промисловості. Підготовка субстрату, його інокуляція. Лушпиння соняшника заливають водою. Від температури води залежить час зволоження субстрату. При температурі води 15-25°С, субстрат витримують 12 годин. При підвищенні температури до 50-60°С, час витримки становить 3-4 години. Вологість субстрату після замочування становить 65-70%. Потім субстрат по 100г вміщують у колби і стерилізують при 0,15-0,18МПа (1,5-1,8кгс/см 2), температурі пару 126,8-130,6°С протягом 90-120хв. Після стерилізації і повітряного охолодження до 23-25°С, субстрат інокулюють міцелієм штаму F-vv Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. Заростання субстрату міцелієм при температурі приміщення 20-22°С йде близько 20 діб. Внутрішня температура субстрату, при заростанні міцелієм, підвищується на 2-4°С, що співпадає з оптимумом росту. Ініціація плодоношення наступає на 25 добу культивування. Освітлення культиваційних приміщень. Перші тижні росту міцелію і плодових тіл майже не потребують освітлення. З моменту масової появи плодових тіл, забезпечують оптимальну силу світла 700-800лк на годину. Визначали АОА штучно отриманих подових тіл штаму F-vv. Плодові тіла штаму F-vv, вирощені на лушпинні соняшника мають антиокисну активність, що дорівнює 58,54±4,21% в ніжках і 78,33±6,69% в шляпках. Приклад конкретного виконання 3. Мікроміцети родів Aspergillus, Penicillum та Trichoderma виявляють сильний антагонізм до різних культур їстівни х грибів. Вивчали взаємодію штаму F-vv зимового опенька {Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing.) і мікроміцетів в змішаній культурі у чашках Петрі на ГКА. Культури вирощували у сухоповітряному термостаті ТС-80-М-2 при температурі 25,0°C. Встановлено, що дослідний штам зимового опенька є стійким і конкурентноздатним до мікроміцетів. Таким чином, запропонований штам F-vv зимового опенька (Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing.) здатний до утилізації лушпиння соняшника - відходу харчової промисловості. Штам F-vv має вміст антиокисних речовин як у міцелії, що дорівнює 76,47±3,56%; так і в плодових тілах, що дорівнює 58,54±4,21% в ніжках і 78,33±6,69% в шляпках. Культура F-vv зимового опенька (Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing.) є стійкою і конкурентоздатною до мікроміцетів. За рахунок цього може бути використаним у грибівництві і різних галузях харчової промисловості, як лікувально-профілактичний засіб. Джерела інформації, які використані при укладанні заявки. 1. Патент 461 А України. Штам соматичних структур їстівного базидіоміцета Pleurotus ostreatus (Jacg.: Fr.) Kumm. Р-ОГ - продуцента плодових тіл і міцелію з антиокисними властивостями /Федотов О.В., Вовк Н.В. Заявка №2001075193, від 20.07.01, кл. 7C12N1/14, A01G1/04, Бюл. №5, від 15.05.02. (прототип) 2. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из высших грибов - объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. - 1992. -26, вып.4. -С.321-324. 3. Бисько Н.А., Дудка И.А. Биология и культивирование съедобных грибов рода вешенка. - К.: Наук. думка, 1987. - 148с. 4. Бисько Н.А., Бухало А.С., Вассер С.П. и др. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. - Киев: Наук. думка, 1988. - 144с. 5. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. -Киев: Наук. думка, 1988.-144с. 6. Бухало А.С. С учасні тенденції культивування грибів з роду Pleurotus (Fr.) Quel. II Укр. ботан. журн. - 1990, т.47, №2. - С.101-103. 7. Бухало А.С., Соломко Е.Ф., Ми тропольская Н.Ю. Базидіальні макроміцети з лікарськими властивостями // Укр. ботан." журн. - 1996. - 53, №3. - С.192-201. 8. Дорофеев А.Н., Акимов Ю.А., Русина И.Ф. Природные антиоксид анты: поиски перспективы применения // Тез. докл. III Всесоюз. конф. "Биоантиоксидант" - М. - 1989.-С.252. 9. Дудка И.А., Вассер С.П., Бухало А.С. и др. Промышленное культивирование съедобных грибов. - Киев: Наук. думка, 1978. - 264с. 10.Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. - Киев: Наук. думка, 1982. - 550 с.14. 11.Дудка И.А., Бисько Н.А., Билай В.Г. Культивирование съедобных грибов. - Киев: Урожай, 1992. - 160с. 12.Капич А.Н. Биосинтетическая активность дереворазрушающи х базидиомицетов при глубинном культивировании // Микол, и фитопатол.- 1990.- 24, №5.- С.377-384. 13. Капич А.Н., Шишкина Л.Н. Антиоксидантные свойства дереворазрушающи х базидиомицетов // Микол., и фитопатол.- 1992.- 26, №6.- С.486-492. М.Капич А.Н. Антиокислительная активность экстрактов мицелия ксилотрофных базидиомицетов // Микол, и фитопатол.- 1,995. - 29, №5-6. С.35-40. 15-Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О., Комаров О.С., Владимиров Ю.А. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб. дело. - 1988, №5.- С.59-62. 16.Соломко Э.Ф., Дудка И.А.Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности// ВНИСЭТИ: Обзорная информация, сер.3.-М.,1985.-48с. 17.Аоуа та Т., Nakakita I., Nakagawa M., Sakai H. Screening for antioxidants of microbial origin // Agric. Biol. Chem. - 1982. - 46, №9. - P.2369-2371. 18.Eriksson K.-E., Blanchette R.A., Ander P. Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components. Berlin, Heidelberg: Springier-Verlag, 1990.