Спосіб отримання препарату інсуліну для перорального застосування

Спосіб отримання препарату інсуліну для перорального застосування, який передбачає змішування останнього із водорозчинним полімером, який відрізняється тим, що полімером є поліетиленоксид, заздалегідь активований шляхом опромінювання іонізуючим випромінюванням, із молекулярною масою 0,4-40 кДа і концентрацією 1,050,0 %, причому відношення інсулін : поліетиленоксид дорівнює 1 : (1-500) до кінцевої концентрації інсуліну в суміші 1-10 міліграмів/мл, а поліетиленоксид активують шляхом опромінювання потоком прискорених електронів або гаммавипромінюванням в дозах 1,0-5,0 Мрад. (19) (21) a200900222 (22) 11.09.2007 (24) 25.01.2011 (86) PCT/RU2007/000483, 11.09.2007 (31) 2006132763 (32) 13.09.2006 (33) RU (46) 25.01.2011, Бюл.№ 2, 2011 р. (72) АРТАМОНОВ АНДРЄЙ ВЛАДІМІРОВІЧ, RU, РОДІОНОВ ПЬОТР ІВАНОВІЧ, RU (73) ОБЩЄСТВО С ОГРАНІЧЄННОЙ ОТВЄТСТВЄННОСТЬЮ "КОНЦЕРН 03", RU (56) RU 2066551 C1 20.09.1996 RU 2117488 C1 20.08.1998 3 людини, а як зв'язуючий агент, переважно використовують бромистий ціан, хлористий ціанур або глутаровий діальдегід [Патент РФ №2058788, кл. А 61 К 38/28, оп. 27.04.96]. Перед використанням препарат емульгують у воді. Недоліком відомого способу є висока токсичність зв'язуючих агентів і пов'язана з цим необхідність в дорогому очищенні кінцевого продукту. Відомим є спосіб отримання препарату інсуліну у вигляді гелю для перорального застосування шляхом іммобілізації інсуліну в об'ємі зшитого полімеру, модифікованого інгібітором протеолітичних ферментів [R.Z.Creenley, el.all Polymer Matrices for oral delivery, Polymer Preprits 1990, V.31, N 2, p. 182-183]. Як зшитий полімер використовують акрилову або метакрилову кислоти, зшиті триетиленгліколь-ди(мет)акрилатом, а як інгібітор протеолітичних ферментів використовують апротенін панкреатичний інгібітор трипсину. Недоліком цього способу є невисока стійкість отриманого препарату до дії травних ферментів, наслідком чого с низька активність інсуліну, який проникає в кров. Найбільш близьким до способу, що заявляється, прототипом, є спосіб отримання препарату інсуліну у вигляді гелю шляхом іммобілізації інсуліну в об'ємі зшитого полімеру, модифікованого інгібітором протеолітичних ферментів, яким виступає овомукоїд із яєчного білка в концентрації 0,225мг/г (набряклого у воді гідрогеля). Іммобілізацію проводять шляхом занурення зшитого модифікованого полімеру у водний розчин інсуліну із концентрацією 0,01-5мг/мл на 1-2 години до повного набрякання полімеру. Модифікований полімер використовують в кількості 0,01-1,0г на 1мл розчину інсуліну [Патент РФ № 2066551, кл. А 61 К 38/28, оп. 20.09.96]. Недоліками відомого способу є технологічна складність виділення овомукоїда і отримання зшитого полімеру, ним модифікованого, висока вартість і низька терапевтична ефективність отриманого препарату. Технічним завданням запропонованого винаходу є спрощення і здешевлення способу отримання препарату інсуліну для перорального застосування, а також підвищення його терапевтичної ефективності шляхом іммобілізації інсуліну на водорозчинному полімері. Визначальною відмінністю способу, який заявляється, у порівнянні з прототипом, є те, що інсулін модифікують полімером, активованим іонізуючим випромінюванням, що дозволяє спростити спосіб і підвищити терапевтичну ефективність препарату. При опромінюванні в процесії радіаційно-хімічного окислення в полімері утворюються високоактивні карбонільні групи. Активований у такий спосіб полімер утворює із інсуліном водорозчинний комплекс, який ефективно знижує рівень глюкози при пероральному введенні. Унаслідок високої розчинності у водних розчинах, комплекс інсуліну із полімером повністю всмоктується в кров без дифузійних обмежень. Приклади полімерів включають, але ними не обмежуються, декстрани, полівінілпіролідон, ізопреноли, поліакриламід, поліуретан. Найкращий варіант здійснення винаходу 93254 4 Технічне завдання досягається запропонованим способом, який полягає в наступному. Готують 1-50% водний розчин поліетиленоксиду із молекулярною масою від 0,4 до 4 0кДа. Потім розчин опромінюють високоенергетичним іонізуючим випромінюванням, бажано гаммавипромінюванням або потоком прискорених електронів в дозах, які забезпечують протікання вільнорадикальних реакцій, бажано 1,0-5,0Мрад. Далі до розчину радіаційно-активованого поліетиленоксиду вводять інсулін до кінцевої концентрації (за білком) від 1-10мг/мл (або за активністю інсуліну 10-100МО/мл відповідно), у співвідношенні поліетиленоксид : інсулін, рівному (1-500):1, суміш перемішують протягом 10-30 хвилин до отримання однорідного прозорого або дещо опалесцируючого розчину. Використання овомукоїда як інгібітора протеаз в способі-прототипі дозволяє захистити інсулін від протеолітичних ферментів, а поліакриламідний гель виконує функцію депонування модифікованого інсуліну. При частковому проникненні в кров через стінку кишковика інсулін цілеспрямовано не депонується в печінці, оскільки не має спорідненості до органів ретикулоендотеліальної системи і у зв'язку з цим його дія буде аналогічною до дії інсуліну при парентеральному введенні. Навпаки, інсулін, модифікований радіаційно-активованим полімером проявляє властивості базального інсуліну, тобто його фармакологічний ефект є максимально наближеним до фізіологічного механізму. Цьому сприяє полімер, який має здатність захоплюватися клітинами печінки. Отриманий технічний результат не був очевидним із відомих науково-технічних даних про властивості вказаних полімерів та інсуліну, оскільки в результаті модифікації інсуліну радіаційноактивованим полімером могла б відбутися цілковита втрата специфічної гіпоглікемічної активності інсуліну за рахунок зміни його конформації і взаємодії із інсуліновим рецептором клітин. Проте, заявлений спосіб дозволяє не тільки зберегти специфічну гіпоглікемічну активність препарату інсуліну, але і забезпечує максимально фізіологічний механізм його дії за рахунок того, що активований полімерний носій утворює із інсуліном хімічно лабільні зв'язки і використовується тільки як носій, який транспортує інсулін до клітин печінки, де і відбувається вивільнення нативного інсуліну. Винахід проілюстровано наступними прикладами конкретного отримання препарату інсуліну. Приклад 1 10% водний розчин поліетиленоксиду із молекулярною масою 1,5кДа опромінюють потоком прискорених електронів в дозі 5,0Мрад. У опромінений розчин вносять інсулін до кінцевої концентраті 10 міліграм в 1мл (співвідношення поліетиленоксид : інсулін дорівнює 10:1). Суміш перемішують 10 хвилин і отримують препарат інсуліну у вигляді дещо опалесцируючого розчину. Вихід готового продукту становить 98%. Приклад 2 50,0% водний розчин поліетиленоксиду із молекулярною масою 0,4кДа опромінюють гальмівним гамма-випромінюванням в дозі 1,0Мрад. У 5 93254 опромінений розчин вносять інсулін до кінцевої концентрації 1 міліграм в 1мл (співвідношення поліетиленоксид : інсулін дорівнює 500:1). Суміш перемішують 30 хвилин і отримують препарат інсуліну у вигляді прозорого розчину. Вихід готового продукту становить 97%. Приклад 3 5% водний розчин поліетиленоксиду із молекулярною масою 15кДа опромінюють потоком прискорених електронів в дозі 2,5Мрад. У опромінений розчин вносять інсулін до кінцевої концентрації 10 міліграмів в 1мл (співвідношення полиетиленоксид : інсулін дорівнює 5:1). Суміш перемішують 15 хвилин і отримують препарат ін 6 суліну у вигляді дещо опалесцируючого розчину. Вихід готового продукту складає 99%. У таблиці 1 представлені результати дослідження гіпоглікемічної дії на інтактних пацюках лінії Wistar комплексу інсуліну із радіаційноактивованим поліетиленоксидом. У дослідній групі експериментальним тваринам внутрішньошлунково одноразово введено по 1мл модифікованого поліетиленоксидом свинячого інсуліну (склад: 30МО/мл свинячого інсуліну, 12,5мас.% радіаційно-активованого поліетиленоксиду 1500, співвідношення поліетиленоксид : інсулін дорівнює 125:1). У контрольній групі тваринам одноразово внутрішньошлунково введено по 1мл свинячого інсуліну із активністю 30МО/мл. Таблиця 1 Час вимірювання рівня глюкози в крові, хв 180 240 300 360 420 Концентрація глюкози в крові, ммоль/л 5, 3 5,1 5,1 4,6 3,6 4,8 4,3 4,7 4,9 4,4 5,1 4,7 4,6 4.3 4,3 5,7 4,9 4,6 4,7 4,9 6,0 6,3 6,2 4,7 5,6 № тварини (дослід) 0 60 120 1 2 3 4 5 7,9 5,9 5,2 7,1 6,1 5,1 5,3 5,2 7,1 6, 0 5, 6 5,0 6,3 6,2 6,7 № тварини (контроль) 0 60 120 5,3 6,2 5,8 6,7 6,9 7,3 7,4 5,5 7,7 6,1 5,74 5, 96 5,38 5,06 5,04 4,64 6,18 6, 80 6,14 5,80 5,62 5,82 1 6,5 2 6,8 3 5,3 4 7,5 5 5,9 Середнє значен6,44 ня (дослід) Середнє значен6,40 ня (контроль) 480 540 600 5,4 4,9 5,2 5,9 6,3 5,7 6,1 6,1 4,8 5, 6 5,9 5,9 4,9 4,6 5,1 480 540 600 6,6 5,6 4,8 6,4 6,1 6,1 5,4 5,5 6,0 5,8 5,6 5,1 5,4 5,2 5,8 4,56 5,54 5,66 5,28 5,70 5,90 5,76 5,42 Час вимірювання рівня глюкози в крові, хв 180 240 300 360 420 Концентрація глюкози в крові, ммоль/л 5,6 5, 6 5,4 5,2 5,0 6,4 6,1 5,9 5,9 5,3 5,7 5,1 5,3 6,2 5,4 6, 8 5,5 5,4 6,3 7,6 6,2 6,7 6,1 5,5 5,2 Як видно із результатів, представлених в таблиці 1, модифікований поліетиленоксидом інсулін починає проявляти основну гіпоглікемічну активність через 3 години після внутрішньошлункового введення і зберігає її до 10 годин. Отримані дані свідчать про наближення дії модифікованого інсуліну до базальної секреції інсуліну підшлунковою залозою. У таблиці 2 представлені дані дослідження гіпоглікемічної активності модифікованого поліети леноксидом людського генно-інженерного інсуліну на моделі алоксанового діабету у пацюків. У дослідній групі експериментальним тваринам в/ш одноразово введено по 1мл модифікованого поліетиленоксидом інсуліну (склад: 50МО/мл людського інсуліну, 12,5мас.% радіаційно-активованого поліетиленоксиду 1500, співвідношення поліетиленоксид : інсулін дорівнює 70:1). У контрольній групі тваринам введено по 1мл людського інсуліну із активністю 50МО/мл. Таблиця 2 Серія дослідів Початкове значення Контроль (n = 5) 23,42,8 Дослід (n = 5) 26,23,5 Час вимірювання рівня глюкози в крові, години 4 6 8 10 Зміна концентрації глюкози в крові, ммоль/л -1,12,1 -1,21,7 -5,12,3 -0,44,8 +1,33,8 -5,81,0 -9,11,0 -8,91,5 -4,93,2 -0,52,3 2 Як видно із представлених результатів, модифікований інсулін характеризується вираженою 24 -0,81,8 -4,12,2 гіпоглікемічною активністю при в/ш введенні пацюкам із алоксановою моделлю діабету. 7 93254 У таблиці 3 представлені порівняльні дані щодо впливу модифікованого поліетиленоксидом інсуліну (співвідношення поліетиленоксид : інсулін дорівнює 70:1) на абсолютні значення рівня інсуліну в плазмі крові у пацюків при одноразовому в/ш введенні. У дослідній групі інтактним пацюкам лінії Wistar, масою 200-240г в/ш введений модифікова 8 ний поліетиленоксидом людський інсулін із розрахунку 250МО/кг. У контрольній групі тваринам було введено в/ш еквівалентна кількість немодифікованого інсуліну. Вміст інсуліну в плазмі крові у пацюків (у ОД/мл) визначали імуноферментним методом. Таблиця 3 Серія дослідів Інтактні тварини Контроль Досллд Початкові значення 267 2710 236 Час вимірювання вмісту інсуліну в плазмі крові у пацюків, години 4 5 6 Вміст інсуліну в плазмі крові у пацюків (в ОД/мл) 169 147 168 103 156 1710 236 3510 206 Із даних, приведених в таблиці, видно, що інсулін, модифікований поліетиленоксидом при в/ш введенні або призводить до підвищення рівня інсуліну в плазмі крові, або перешкоджає його зниженню, тобто модифікований інсулін максимально наближається до базального інсуліну, який секретується підшлунковою залозою в рамках фізіологічної норми. Заявлений спосіб отримання препарату інсуліну для перорального застосування, на відміну від способу прототипу, відрізняється простотою і економічністю, його здійснення передбачає всього дві Комп’ютерна верстка А. Крижанівський стадії, в яких використовується полімерний носій, поліетиленоксид, технологічно простий спосіб його активації - дія іонізуючого випромінювання на розчин полімеру, а також простий спосіб модифікації інсуліну активованим полімером за допомогою введення до розчину активованого полімеру інсуліну до необхідної концентрації (активності). Препарат інсуліну отриманий запропонованим способом, характеризується високою терапевтичною активністю, яка визначається як за зниженням концентрації глюкози в крові, так і за прямим визначенням рівня інсуліну в крові. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601