Спосіб біосинтезу тіопептидів

Спосіб біосинтезу тіопептидів, який базується на ферментації продуцента сіоміцинів Streptomyces sioyaensis, який відрізняється тим, що як ферментаційне середовище використовують сіркодефіцитний розчин із додаванням елементарної сірки (400-660 мг/л), або піриту (800-1400 мг/л) або 500±100 мг подрібненої руди, що містить 15-40 мг домішок сірки та піриту, де сіркодефіцитним ферментативним середовищем є розчин, при наступному співвідношенні компонентів мг/л: K2НРO4 500,0 MgCl2x6H2O 500,0 FeCl3 10,0 NaNO3 1280,0 сахароза 20000,0 при рН до стерилізації 7,0. (19) UA (11) (21) a200901520 (22) 23.02.2009 (24) 25.06.2011 (46) 25.06.2011, Бюл.№ 12, 2011 р. (72) ОСТАШ БОГДАН ОМЕЛЯНОВИЧ, ФЕДОРЕНКО ВІКТОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ЛИТВИНОВИЧ ОЛЕКСАНДР РОМАНОВИЧ, ГРОМИКО ОЛЕКСАНДР МИКОЛАЙОВИЧ, ГРУБСЬКИЙ ЯРОСЛАВ ПЕТРОВИЧ (73) ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА (56) US20030195270A1 16.10.2003. ОСТАШ Б.О. ГЕНЕТИЧНИЙ КОНТРОЛЬ ОКРЕМИХ ЕТАПІВ БІОСИНТЕЗУ ЛАНДОМІЦИНУ Е В STREPTOMYCES GLOBISPORUS 1912. Автореф… канд.біол.н. 03.00.15 – генетика. Київ-2003. ОСТАШ І. С. Гени, які контролюють глікозилювання та експорт ландоміцинів у streptomyces globisporus 1912 та STREPTOMYCES cyanogenus S136. Автореф… канд.біол.н. 03.00.22 – молекулярна генетика. Київ-2008. JP63000296 (A) 05.01.1988. JP2007238453 (A) 20.09.2007. Failes TW, Cullinane C, Diakos CI, Yamamoto N, Lyons JG, Hambley TW. Studies of a cobalt(III) C2 2 94958 1 3 птиди. В останній групі сполук молярний вміст сірки є найбільшим, тому розробка способів використання дешевих джерел сірки для біосинтезу тіопептидів становить практичний інтерес. Відомий спосіб використання піриту, що включає вирощування Sulfolobus acidocaldarius на вугіллі та перетворення піриту у біомасу та сірководень [Srivastava R. D., Campbell І. М., Blaustein В. D. Coal bioconversion // Chem. Eng. Prog. - 1989. vol.85. - P.45-52]. Однак цей спосіб не дозволяє отримати тіопептиди як кінцевий продукт біоконверсії, оскільки Sulfolobus acidocaldarius не містить генів біосинтезу тіопептидів. Також не показано можливість використання цим штамом елементарної сірки. Відомий спосіб біосинтезу тіопептидів, що включає ферментацію продуцентів тіопептидів у рідкому середовищі, що містить картопляний крохмаль, екстракт кукурудзи та соєву муку [Nishimura Н., Okamoto S., Mayama М., Ohtsuka H., Tawara К., Shimohira М., Shimaoka N. Siomycin, a new thiostrepton-like antibiotic // J Antibiot-Ser.A14. P.255-263]. Однак цей спосіб не передбачає використання елементарної сірки та сульфідів металів для продукції тіопептидів. Найбільш близьким за технічною суттю - прототипом - є спосіб продукції тіопептидів сіоміцинової родини штамом S. sioyaensis U3-48-37 у рідких середовищах, що містили елементарну сірку [Yagi S., Kitai S., Kimura T. Stimulative effect of elemental sulfur on siomycin production by Streptomyces sioyaensis // Appl. Microbiol. - 1971. - vol.22. - P.153156]. Штам вирощували 9 діб на соєво-цукровому середовищі із додаванням елементарної сірки (0.07 %) та без неї. Біомаси осаджували і сіоміцин екстрагували сумішшю хлороформ-метанол (3:1). Кількість сіоміцину в екстрактах визначали за до0 помогою калібрувальної кривої. У середовищі з S штам накопичував у чотири рази більше сіоміцину ніж у середовищі без сірки, що свідчило про її утилізацію. Проте, цей спосіб заснований на використанні складних компонентів ферментаційного середовища і не демонструє можливості використання сульфідів металів як джерела сірки. В основу винаходу поставлена задача удосконалити спосіб біосинтезу тіопептидів шляхом використання простих джерел сірки, що відкриє нові підходи до утилізації дешевих сірковмісних речовин, продукції цінних органічних сполук та біоремедіації. Поставлена задача вирішується так, що у способі біосинтезу тіопептидів, який базується на ферментації продуцента сіоміцинів Streptomyces sioyaensis, як ферментаційне середовище використовують сіркодефіцитний розчин із додаванням елементарної сірки (400-660 мг/л) або піриту (8001400 мг/л) або 500±100 мг подрібненої руди, що містить 15-40 мг домішок сірки та піриту. Авторами вперше запропоновано використати сіркодефіцитне середовище у поєднанні з піритом для синтезу складних та біологічно активних сполук - тіопептидів. Це середовище характеризується кількома особливостями. По-перше, воно міс 94958 4 тить хлористе залізо (FеСІ3), яке у водному розчині забезпечуватиме розчинення піриту [Rickard D., Luther G. Chemistry of iron sulfides // Chem. Rev. 2007. - vol. 107. - P.514-562.] згідно рівнянь 1 та 2: 3+ 2FeS2 + 6[Fe(H2O)6] + 9Н2O  S2O3 + 2+ + 7[Fe(H2O)6] + 6Н , (1) 3+ 2+ 0 FeS2 + 2Fe  3Fe + 2S . (2) 3+ Подальша спонтанна регенерація Fe за нейтральних значень рН (рівняння 3) та бактерійне окислення сірки за допомогою сульфуроксидази (рівняння 4) відбувається згідно таких реакцій: 2+ + 3+ 4Fe + О2 + 4H  4Fe + 2H2O, (3) 0 2+ 2S + 3O2 + 2H2O  SO4 + 4H . (4) По-друге, цей розчин містить розчин макроелементів, сахарозу та нітрат натрію, що забезпечують накопичення біомаси продуцента сіоміцинів, а дефіцит сірки стимулює використанняштамом усіх можливих сірковмісних речовин. Зазвичай, 0 використання S та сульфідів штамом Streptomyces sioyaensis не відбувається. Саме тому підбір спеціальних умов вирощування, які б сприяли окисленню піриту та сірки є необхідною умовою для досягнення поставленої задачі. Запропонований спосіб є простішим та ширшим порівняно з відомими способами, що засновані на ферментації S. sioyaensis, оскільки базується на простішому середовищі і дозволяє використовувати сульфіди, зокрема пірит, що є дешевим та поширеним у природі. Цінністю запропонованого підходу є те, що для ферментації можна використовувати неочищені сірку та сульфіди, у вигляді подрібнених руд чи низькосортного вугілля, що містять ці сполуки. Отже, крім отримання тіопептидів, іншим потенційно важливим результатом такої ферментації може бути зменшення вмісту сірковмісних сполук у копалинах, що дозволить їхнє раціональніше використання. Фіг. 1 Структурна формула сіоміцину А, основної тіопептидної сполуки, що накопичується у клітинах S. sioyaensis Фіг. 2 Пригнічення росту сіоміцинчутливої культури Sarcina lutea екстрактами з рівних кількостей біомаси штаму S. sioyaensis, що вирощувався 6 діб на різних середовищах, де 1 - розчинник (диметилсульфоксид, 60 мкл); 2 - екстракт із сіркодефіцитного середовища без додавання сірки; 3 - екстракт із сіркодефіцитного середовища з піритом без засіву S. sioyaensis; 4 - екстракт із сіркодефіцитного середовища з низькосортним вугіллям; 5 - екстракт із сіркодефіцитного середовища з піритом; 6 - екстракт із сіркодефіцитного середовища з елементарною сіркою; 7 - екстракт із повноцінного глюкозно-соєвого середовища SG1. Спосіб можна проілюструвати прикладами. Вирощують S. sioyaensis у рідких сіркодефіцитних середовищах із додаванням елементарної сірки (400660 мг/л) або піриту (8001400 мг/л) або 500±100 мг подрібненої руди, що містить 1540 мг домішок сірки та піриту. Для наочності описуємо приклад із використанням елементарної сірки. Спорову суспензію S. sioyaensis (титр спор - 10) 5 засівають у колбу об'ємом 100 мл, що містить 10 мл середовища SG1 (г/л: соєвий триптон - 10, глюкоза - 20, рН до стерилізації - 7,0). Після інкубації на качалці протягом 2 днів при 28 °С ферментаційне середовище центрифугують 7 хв. при 6 тис. об./хв., осаджену біомасу промивають двічі фізіологічним розчином і ресуспендують у 5 мл дистильованої води. 100 мкл промитої біомаси засівають у колби об'ємом 300 мл, що містять 30 мл таких середовищ: SG1, сіркодефіцитне середовище (г/л: К2НРO4 - 0,5, MgCl2x6H2O - 0,5, FeCl3 0,01, NaNO3 - 1,28, сахароза - 20, рН до стерилізації - 7,0), сіркодефіцитне середовище з елементарною сіркою (0,07 %). Інкубують 6 діб при 28 °С на качалці. Екстрагують тіопептиди. Ферментаційні середовища центрифугують 7 хв. при 6 тис. об./хв., біомаси промивають дистилятом. Відбирають по 100 мг біомаси у пробірки і додають 300 мкл диметилсульфоксиду. Перемішують вміст та інкубують 90 хв. при 25 °С з помішуванням кожні 10 хв. Центрифугують пробірки, і супернатант, що містить тіопептиди (основна сполука - сіоміцин А, який зображено на Фіг. 1), використовують у подальших експериментах. 94958 6 Оцінюють продукцію тіопептидів за допомогою дифузії антибіотика в агар. Сіоміцинчутливий штам Sarcina lutea висівають на середовище LA [Гловер Д. Молекулярное клонирование ДНК. Методы. М., Мир - 1989 - т.1 - 374с]. Вирощують 20 год при 30 °С. Готують суспензію клітин із 20годинної культури Sarcina lutea у 4 мл 0.6 % агару і виливають його на чашки з LA. Одночасно на паперові диски Whatman діаметром 12 мм наносять попередньо отримані екстракти тіопептидів у диметилсульфоксиді. Диски з екстрактами підсушують 90 хв. при 37 °С, а потім накладають на щойно засіяний газон S. lutea. Чашки з дисками інкубують при 30 °С протягом 18 год. Як зображено на Фіг. 2, навколо дисків з екстрактами середовищ SG1 та сіркодефіцитного середовища з додаванням сірковмісних сполук помітні чіткі зони пригнічення росту S. lutea, що свідчить про наявність тіопептидів в екстрактах; їхня кількість значно більша у середо0 вищах, де було додано S чи FeS2. Контрольні екстракти не виявляють антибіотичної активності. Застосування запропонованого способу з викорис0 танням S та деяких сульфідів для біосинтезу тіопептидів дає змогу отримати передбачуваний технічний результат, який підтверджено Фіг. 2. 7 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 94958 8 Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601