Спосіб детекції dirofilaria imitis та dirofilaria repens у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Способ детекції Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції включає проведення ПЛР, підготовку буферу, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК. Використовують гени-мішені 12S рРНК, що містить такі послідовності пар праймерів: 5 '-tttttgaccgggtttagtacc-3' 5 '-tgtgccaataaaattcaccaa-3' Розмір продукту 152 п.н. для Dirofilaria repens UA 98472 U (12) UA 98472 U 5' -tggcgcatgtatgattgttt-3' 5' -tgacggatggtttgtaccac-3' Розмір продукту 472 п.н. для Dirofilaria imitis UA 98472 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до молекулярної медицини та ветеринарної мікробіології, а саме до способу детекції ДНК гельмінтів роду Dirofilaria. Існують способи для діагностики наявності личинок збудника Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens у крові за допомогою мікроскопії. Одним із найпростіших методів виявлення мікрофілярій є метод прямого дослідження мазка крові при малому збільшенні мікроскопа (Kelly J.D. Detection and differentiation of microfilariae in canine blood //Austral. Vet. J. 1973. - V. 49, № 1. - P. 23-27.). Рухливі личинки добре помітні у полі зору мікроскопа. Інколи личинок важко помітити із-за еритроцитів. Але при низькій інтенсивності інвазії та скритій формі дирофіляріозу, цей метод не має сенсу, крім того важко провести ідентифікацію личинок мікрофілярій за видами. Також недоліком мікроскопічного методу є те, що необхідно відбирати периферичну кров від тварини вранці або ввечері, що пов'язано з циклом розвитку дирофілярій. Дорослі форми Dirofilaria imitis паразитують у серці та легеневій артерії, a Dirofilaria repens - у підшкірній клітковині. Личинки обох збудників циркулюють у крові протягом 2-3 років. Існують імунологічні методи за використання яких у крові тварин виявляють антитіла проти мікрофілярій та дорослих дирофілярій. Це такі методи як IFA та ELISA (Wilkins R.J., Ciurea D. Dirofilariasis survey of diagnostic tests //Vet. Med. - 1985. - V. 80, № 6. - P. 42-45.)· Недоліком цих тестів є те, що використання сероантигенів при діагностиці дирофіляріозу є неефективним при слабкому ступені інвазії, коли в організмі собак паразитують дирофілярії однієї статі. Також при використанні імунологічних методів діагностики можлива перехресна реакція до антигенів інших паразитів, таких як Dipetolonema recurvatum, Toxocara canis, Trichuris vulpis, T. nutria. Найбільш близьким за технічною суттю до способу, що заявляється, є ("Спосіб детекції Babesia canis у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції", патент України № 48336 Заявл. 16.10.2009. Опубл. 10.03.2010 Бюл. № 5). За цим способом проводять полімеразну ланцюгову реакцію, підготовку буферу, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК. Це рішення може бути прототипом. Недоліком є те, що цей спосіб використовують тільки для детекції Babesia canis, а також специфічність праймерів детекції Babesia canis. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб детекції Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає проведення ПЛР, підготовку буферу, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК шляхом використання гена-мішені 12S рРНК, для виявлення ДНК Dirofllaria imitis та Dirofilaria repens, що складається з таких послідовностей пар праймерів: 5' -tttttgaccgggtttagtacc-3' 5 '-tgtgccaataaaattcaccaa-3' Розмір продукту 152 п.н. для Dirofilaria repens 5' -tggcgcatgtatgattgttt-3' 5' -tgacggatggtttgtaccac-3' Розмір продукту 472 п.н. для Dirofilaria imitis, щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз прототипу і запропонованого способу дозволяє зробити висновок, що використання гена мішені 12S рРНК, який складається з певних послідовностей пар праймерів дає можливість одночасно виявляти збудників D. imitis та D. repens у біологічних зразках навіть за умови низької інтенсивності інвазії, що відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. Приклад 1. Проведення полімеразної ланцюгової реакції. 1. ДНК праймери до гена-мішені 12S рРНК, були підібрані з використанням програми GeneRunner v.3.0 і синтезовані фірмою "Літех" (Росія). Послідовності пар праймерів для гена-мішені 12S рРНК: 5 '-tttttgaccgggtttagtacc-3' 5' -tgtgccaataaaattcaccaa-3' Розмір продукту 152 п.н. 5' -tggcgcatgtatgattgttt-3' 5 '-tgacggatggtttgtaccac-3' Розмір продукту 472 п.н. 2. Виділення ДНК із зразків здійснювали за допомогою набору для виділення ДНК фірми "Мініпреп" (Сілекс М, Росія). 3. Буфер для ампліфікації містив 10 мМ Трис НСl (р 8,3), 50 мМ KСl, 0,01 % альбуміну і по 200 мкМ дезоксинуклеозид трифосфатів (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) MgCl2 2,5 мМ. На 50 мкл реакційної суміші додавали 50 пмоль кожного праймера і 1 од. Tag-полімерази. Виділену із 1 UA 98472 U 5 10 15 20 25 30 досліджуваних проб ДНК додавали в кількості 5 мкл. Для запобігання випару реакційної суміші зверху нашаровували 50 мкл мінерального олії. 4. Ампліфікацію проводили з використанням наступних програм: 94 °C-3 хв (1 цикл) 94 °C-10 сек 56 °C-10 сек 72 °C-10сек 5. Детекцію ампліфіційної ДНК здійснювали з використанням електрофорезу в 1,5 % агарозному гелі в ТБЕ-буфері. Для цього 10 мкл ампліфіційного зразка наносили в лунку агарозного гелю і витримували при 20 мвт/см протягом 15 хв. Забарвлення гелю здійснювали 0,1 % розчином эти дія броміду протягом 5 хв. Приклад 2. Порівняльна оцінка чутливості розробленого способу для виявлення ДНК Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens. Аналіз чутливості розробленого способу, при дослідженні ДНК виділеної із біологічних зразків, проводили в порівнянні з методом мікроскопії шляхом паралельного тестування 130 зразків. Збіг результатів тестування методу мікроскопії та розробленого нами способу було відзначено в 91 (70,0 %) випадках. Також нашим способом було виявлено позитивних проб на 28 більше, що свідчить про вищу чутливість даного способу виявлення збудника. Наявність позитивних результатів методом мікроскопії у 8,46 % досліджених зразків на відміну від способу ПЛР, може свідчити про хибний діагноз, в результаті неможливості провести диференціацію личинок дирофілярій від личинок діпеталонем. Таким чином, "Спосіб детекції Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції" дозволяє: проводити одночасне виявлення специфічної ДНК Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens у біологічних зразках навіть за умови низької інтенсивності інвазії, є простим високочутливим і високоспецифічним способом для діагностики дирофіляріозу на різних стадіях захворювання, дає можливість досліджувати проби крові, відібрані у любий час доби, досліджувати комарів – проміжних хазяїв дирофіляріозу. Використання в нашій тест-системі одночасного виявлення Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens та визначення виду збудника у досліджуваному зразку праймерів до гена-мішені 12 рРНК, дозволяє підвищити чутливість виявлення ДНК Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens. Таблиця Спосіб детекції Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції Представлений спосіб "+" "-" 75 28 Мікроскопія "+" n=86 "-" n=44 * "+" - позитивні, "-" - негативні зразки 11 16 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 45 Спосіб детекції Dirofilaria imitis та Dirofilaria repens у біологічних зразках за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що включає проведення ПЛР, підготовку буферу, ампліфікацію, детекцію ампліфікаційної ДНК, який відрізняється тим, що використовують генимішені 12S рРНК, що містить такі послідовності пар праймерів: 5 '-tttttgaccgggtttagtacc-3', 5 '-tgtgccaataaaattcaccaa-3', розмір продукту 152 п. н. для Dirofilaria repens, 5' -tggcgcatgtatgattgttt-3', 5' -tgacggatggtttgtaccac-3', розмір продукту 472 п. н. для Dirofilaria imitis. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2