Модифікація мананази
Формула / Реферат
1. Модифікація мананази, що демонструє активність мананази та має амінокислотну послідовність, що варіює від амінокислотної послідовності материнського/немутантного типу Trichoderma reesei мананази (SEQ ID NO:1), в якій амінокислотна послідовність модифікації мананази включає варіації 201S, 207F та 274L, та варіації 66P, 215T та 259R, і має ідентичність послідовності щонайменше 90 % до SEQ ID NO:1.
2. Модифікація мананази за пунктом 1, де модифікація мананази додатково включає варіацію 3R.
3. Модифікація мананази за пунктом 1 або 2, де модифікація мананази додатково включає варіацію 181А/Н.
4. Модифікація мананази за будь-яким з пунктів 1-3, де модифікація мананази додатково включає одну або більше додаткових варіацій, де положення варіації є 31, 97, 113, 146, 149, 173, 181, 280, 282, 331 або 344.
5. Модифікація мананази за пунктом 4, де варіаціями є 31Y, 97R, 113Y, 146Q, 149K, 173Н/Т, 181Н/А, 280S/L/R, 282D, 331S або 344D.
6. Модифікація мананази, що демонструє активність мананази та має амінокислотну послідовність, яка варіює від амінокислотної послідовності материнського/немутантного типу Trichoderma reesei мананази (SEQ ID NO:1), де амінокислота модифікації мананази включає варіації 201S, 207F та 274L та щонайменше варіації, вибрані з групи, що складається з:
1) 
2) 
3) 
4) 
5) 
6) 
7) 
8) 
9) 
10) 
11) 
12) 
13) 
14) 
15) 
16) 
17) 
18) 
19) 
20) 
21) 
22) 
23) 
24) 
25) 
26) 
27) 
28) 
29) 
30) 
31) 
32) 
33) 
34) 
35) 
36) 
37) 
38) 
39) 
40) 
41) 
42) 
43) 
44) 
45) 
46) 
47) 
48) 
49) 
50) 
51) 
52) 
53) 
54) 
55) 
56) 
57) 
58) 
59) 
60) 
61) 
62) 
63) 
та має ідентичність послідовності щонайменше 90 % до SEQ ID NO:1.
7. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує мананазу за будь-яким з пп. 1-6.
8. Молекула нуклеїнової кислоти SEQ ID NO:5, що кодує мананазу за будь-яким з пп. 1-6.
9. Ферментна композиція для комерційного застосування, що містить модифіковану мананазу за будь-яким з пп. 1-6.
10. Композиція за п. 9, яка є прийнятною для обробки харчових продуктів та кормів, як добавки до харчових продуктів та кормів, для відбілювання паперової маси за допомогою ферментів, для стимуляції гідравлічного розриву пласта на нафтових та газових свердловинах, як миючий засіб, для видалення біоплівок або в системах доставки.
Текст
Реферат: Винахід належить до модифікації мананази, що демонструє активність мананази та має амінокислотну послідовність, що варіює від амінокислотної послідовності материнського/немутантного типу Trichoderma reesei мананази (SEQ ID NO:1), в якій амінокислотна послідовність модифікації мананази включає варіації 201S, 207F та 274L, та варіації 66P, 215T та 259R, і має ідентичність послідовності щонайменше 90 % до SEQ ID NO:1. UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ ТЕХНОЛОГІЯ, ПЕРЕДБАЧЕНА В ДАНОМУ ДОКУМЕНТІ, СТОСУЄТЬСЯ ПОКРАЩЕНИХ МОДИФІКАЦІЙ МІКРОБІОЛОГІЧНИХ МАНАНАЗ, БІЛЬШ КОНКРЕТНО МІКРОБНИХ ФЕРМЕНТІВ, ЩО ДЕМОНСТРУЮТЬ АКТИВНІСТЬ МАНАНАЗИ, ЯК ЇХ ОСНОВНУ ФЕРМЕНТНУ АКТИВНІСТЬ; МОЛЕКУЛ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ, ЩО КОДУЮТЬ ЗГАДАНІ МАНАНАЗИ, ВЕКТОРИ, КЛІТИНИ-ГОСПОДАРІ, ЩО МІСТЯТЬ НУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ ТА СПОСОБИ ПРОДУКУВАННЯ МАНАНАЗ; КОМПОЗИЦІЙ, ЩО МІСТЯТЬ ЗГАДАНІ МАНАНАЗИ; СПОСОБИ ОДЕРЖАННЯ ТА ПРОДУКУВАННЯ ТАКИХ ФЕРМЕНТІВ; ТА СПОСОБІВ ЗАСТОСУВАННЯ ТАКИХ ФЕРМЕНТІВ ДЛЯ ПЕРЕРОБКИ ХАРЧОВИХ ПРОДУКТІВ ТА КОРМІВ, ДЛЯ ЕКСТРАКЦІЇ КАВИ ТА ПЕРЕРОБКИ КАВОВИХ ВІДХОДІВ, ЯК ДОБАВКИ ДО ПРОДУКТІВ ХАРЧУВАННЯ ТА КОРМІВ, ДЛЯ ДОПОМІЖНОГО ФЕРМЕНТНОГО ВІДБІЛЮВАННЯ ПАПЕРОВОЇ МАСИ, ЯК ВІДБІЛЮЮЧИЙ ТА/АБО РОЗШЛІХТОВУЮЧИЙ АГЕНТ В ТЕКСТИЛЬНОМУ ВИРОБНИЦТВІ, ДЛЯ СТИМУЛЯЦІЇ ГІДРАВЛІЧНОГО РОЗРИВУ ПЛАСТА НА НАФТОВИХ ТА ГАЗОВИХ СВЕРДЛОВИНАХ, ЯК МИЮЧИЙ ЗАСІБ, ЯК ІНГРЕДІЄНТИ ДЛЯ ВИПІЧКИ, ДЛЯ ВИДАЛЕННЯ БІОПЛІВОК ТА В СИСТЕМАХ ДОСТАВКИ, ДЛЯ ОБРОБКИ ЗЕРНА АБО ДЛЯ ПЕРЕРОБКИ ВІДНОВЛЮВАЛЬНИХ РЕСУРСІВ, ПРИЗНАЧЕНИХ ДЛЯ ВИРОБНИЦТВА БІОЛОГІЧНИХ ВИДІВ ПАЛИВА, ТА В ТЕКСТИЛЬНІЙ, НАФТОДОБУВНІЙ ПРОМИСЛОВОСТІ, ВИРОБНИЦТВІ ОЧИЩАЮЧИХ, ВІДБІЛЮЮЧИХ, МИЮЧИХ ЗАСОБІВ, ТА ПЕРЕРОБНІЙ ПРОМИСЛОВОСТІ ЦЕЛЮЛОЗНОГО ВОЛОКНА. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Ендо-β-1,4-D-мананаза (β-мананаза; EC 3.2.1.78) каталізує рандомізований гідроліз маноглікозидних зв'язків в манан-основних полісахаридах. Більшість β-мананаз розщеплюють олігосахариди до DP4 (Biely and Tenkanen (1998) Enzymology of hemicellulose degradation, pages 25-47. In Harman and Kubiceck (ed) Trichoderma and Gliocladium, vol.2, Taylor and Francis Ltd. London), однак, залишкова активність була продемонстрована на манотріозі, виявляючи, щонайменше, чотири субсайти зв'язування манози з протеїном. Основними кінцевими продукту гідролізу часто є манобіоза та манотріоза, не зважаючи на те, що, крім того, утворюються значні кількості манози. Деякі β-мананази мають здатність розкладати кристалічний манан. На додаток до гідролізу декілька β-мананаз, в тому числі β-мананаза з Trichoderma reesei, продемонстрували утворення продуктів трансглікозилювання або з манози, або манобіози як акцептору глікозидного зв'язку. β-мананази були виділеними з широкого ряду організмів, включаючи бактерії, гриби, рослини та тварини. Не зважаючи на те, що головним чином виникають позаклітинні, деякі βмананази є клітинно-асоційованими. Їх експресії часто індукуються ростом на манані або галактоманані, однак, β-мананаза з T. reesei експресії, крім того, може бути індукованою целюлозою, тоді як його експресія супресується глюкозою та іншими моносахаридами. Часто різноманітні мананази з різними ізоелектричними точками є знайденими в одному й тому ж організмі, представляючи продукти з різних генів або різних продуктів з одного й того ж гену, відповідно. Загалом, β-мананази мають помірну оптимальну температуру між 40 °C та 70 °C, за виключенням декількох β-мананаз з термофілів (Politz et al. (2000) A highly thermostable endo1,4-β-mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus; Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:715-721). Оптимальний pH знаходиться в нейтральному та кислому діапазоні, наприклад, pH 5,0 для β-мананази з T. reesei (Arisan-Atac et al. (1993) Purification and characterisation of a βmannanase of Trichoderma reesei C-30; Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:58-62). Молекулярні маси ферментів знаходяться в діапазоні між 30 кДа та 80 кДа. WO 002008009673 розкриває модифікації Trichoderma reesei мананаз з покращеною термічною стабільністю та низькою резистентністю pH/пепсин для застосування в гідролізі галактоманану, що міститься в рослинному матеріалі, наприклад, макусі кокосового ядра (PKE), та для застосування в кормах для тварин. Наприклад, термостабільність є необхідною для кормових добавок, що вводять в кормові суміші перед проведенням процедури гранулювання, яка високі температури. До того ж, мананази, що застосовують як кормові добавки, повинні бути стійкими до низького рН та пепсину та повинні бути активними при низьких рН для того, щоб бути здатними ефективно працювати в шлунку, наприклад, тварин з однокамерним шлунком. Однак, загальною спрямованістю в промисловості комбікормів є підвищення температури гранулювання все далі та далі. На даний момент стабільність ферменту при температурі гранулювання близько 90 °C до 95 °C є спрямованою на можливість застосування ферментів в усіх промислово відповідних виробництвах кормів з рослин. Тому наявність мананаз з покращеною термічною стабільністю була б дуже корисною, оскільки це дозволило б використовувати фермент також і для рослин з високою температурою обробки. Короткий опис винаходу В першому аспекті втілення винаходу передбачають модифікації мананази, які мають амінокислотну послідовність, що варіює від такої з материнського/не мутантного типу 1 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Trichoderma reesei мананази (SEQ ID NO: 1), та має одну або більше покращену властивість. Такі властивості можуть включати, але не обмежуються цим, прийнятні: термічну стабільність; профіль температура/активність; профіль pH/активність; специфічну активність; та чутливість pH/протеаза. В наступному аспекті втілення даного винаходу стосуються модифікації мананази, в тому числі мананази, що містить заміщення при одному або більше положеннях, вибраних з групи, що складається з: 66, 215 або 259, де кожне положення відповідає положенню амінокислотної послідовності з материнського/не мутантного типу Trichoderma reesei мананази (SEQ ID NO: 1). В наступному аспекті втілення даного винаходу стосуються модифікацій мананази, які мають амінокислотну послідовність, що варіюють від такої з материнського/не мутантного типу Trichoderma reesei мананази (SEQ ID NO: 1), що включає варіацію 201S, 207F та 274L, та, щонайменше, варіацію при одному або більше положеннях, що відповідають положенню 66, 215 або 259, в порівнянні з амінокислотною послідовністю в SEQ. ID NO: 1. В ще іншому аспекті втілення даного винаходу стосуються нуклеїнових кислот, що кодують модифікації мананази як розкрито в даному документі, а також векторів та клітин-господарів, що містять такі нуклеїнові кислоти. В ще інших втіленнях послідовності використовують в процесах, що в результаті дають модифікації мананаз. Крім того, втілення даного винаходу в основному стосуються застосування модифікацій мананази для розщеплювання галактоманану, а саме каталізує рандомізований гідроліз маноглікозидних зв'язків в манан-основних полісахаридах. Переважно, модифікації мананази за даним винаходом можуть бути використанні в промислових застосуваннях, в тому числі, наприклад, способах розрідження крохмалю та для підвищення розщеплювання галактоманану в харчових продуктах та кормах для тварин. Переважно, модифікації мананази, відповідно до втілень представленого винаходу, є придатними та застосовуються в процесах спиртового бродіння та/або виробництв, для екстракції кави та переробки кавових відходів, як добавки до продуктів харчування та кормів, для допоміжного ферментного відбілювання паперової маси, як відбілюючий та/або розшліхтовуючий агент в текстильному виробництві, для стимуляції гідравлічного розриву пласта на нафтових та газових свердловинах, як миючий засіб, як інгредієнти для випічки, для видалення біоплівок та в системах доставки, для обробки зерна або для переробки відновлювальних ресурсів, призначених для виробництва біологічних видів палива, та в текстильній, нафтодобувній промисловості, виробництві очищаючих, відбілюючих, миючих засобів, та переробній промисловості целюлозного волокна. В інших аспектах даний винахід стосується ферментних композицій, що містять модифікацію мананази, як описано в даному документі, де ферментна композиція є придатною для або використовується в комерційних застосуваннях. В одному втіленні ферментна композиція може бути кормовою композицією для тварин. В іншому втіленні ферментна композиція може бути використана в процесах гідролізу крохмалю (наприклад, розрідження). В переважному втіленні модифікації та/або ферментна композиція можуть бути використаними в процесах спиртового бродіння. В наступних втіленнях ферментна композиція, що містить мананазу, охоплену даним винаходом, включатиме додаткові ферменти, такі як фітази, глюкоамілази, альфа-амілази, протеази, целюлази, гемицелюлази та їх комбінації. В наступному аспекті втілення даного винаходу стосуються способів продукування модифікацій мананази в клітині-господарі шляхом трансформування клітини-господаря з ДНК конструкцією, переважно включаючи промотор, що демонструє транскрипційну активність в клітині-господарі, культивуючи трансформовану клітину-господаря в прийнятному культуральному, щоб дозволити експресію згаданої мананази та продукування мананази. Крім того, спосіб може включати відновлення продукованої мананази. В одному втіленніклітиноюгосподарем є грибоподібна Trichoderma, така як T. reesei, дріжджова, бактеріальна або рослинна клітина. В переважному втіленні даного винаходу модифікація мананази має послідовність SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 або SEQ ID NO: 9 або їх модифікацій, модифікованих форм, гомологів, злитих протеїнів, функціональних еквівалентів або фрагментів. До того як детально описувати розкриття винаходу, слід розуміти, що дане розкриття винаходу не обмежується конкретними складовими частинами описаних пристроїв або стадіями процесу описаних способів, як такі процеси та способи можуть змінюватися. До того ж, слід розуміти, що термінологія, що використовують в даному документі, використана з метою тільки описування конкретного втілення, та не призначена для обмеження. Необхідно зазначити, що, як використано в описі та формулі винаходу, що додається, форми однини включають однину та/або множину позначеного, якщо з контексту явно випливає інше. Більш того, слід розуміти, 2 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що у випадку, якщо надані діапазони параметру, які визначаються числовими значеннями, то вважається, що діапазони включають ці обмеження величин. Для забезпечення повного розкриття винаходу без надмірного подовження опису, заявник таким чином включає посилання кожного з патентів та патентних заявок, зазначених вище, зокрема розкриття WO 2008/009673. Короткий опис креслень ФІГ. 1 демонструє амінокислотну послідовність немутантного типу Trichoderma reesei мананази, (SEQ ID NO: 1). ФІГ. 2 демонструє амінокислотну послідовність модифікації Trichoderma reesei мананази V31, яка розкрита в WO 2008/009673 (SEQ ID NO: 2). ФІГ. 3 демонструє амінокислотну послідовність наступної модифікації Trichoderma reesei мананази V-31/S3R, яка розкрита в WO 2008/009673 (SEQ ID NO: 3). ФІГ. 4 демонструє амінокислотну послідовність придатної модифікації мананази TM-1 відповідно до представленого розкриття винаходу (SEQ ID NO: 4). ФІГ. 5 демонструє нуклеїнову послідовність модифікації мананази TM-1 (SEQ ID NO: 4) відповідно до представленого розкриття винаходу (SEQ ID NO: 5). ФІГ. 6 демонструє амінокислотну послідовність наступної придатної модифікації мананази TM-100 відповідно до представленого розкриття винаходу (SEQ ID NO: 6). ФІГ. 7 демонструє амінокислотну послідовність наступної придатної модифікації мананази TM-108 відповідно до представленого розкриття винаходу (SEQ ID NO: 7). ФІГ. 8 демонструє амінокислотну послідовність наступної придатної модифікації мананази TM-CBD-148 відповідно до представленого розкриття винаходу (SEQ ID NO: 8). ФІГ. 9 демонструє амінокислотну послідовність наступної придатної модифікації мананази TM-144 відповідно до представленого розкриття винаходу (SEQ ID NO: 9). ФІГ. 10 демонструє порівняння материнського/немутантного типу Trichoderma reesei мананази та S3R-модифікації стосовно термічної стабільності та активності. ФІГ. 11 демонструє амінокислотну послідовність целюлозного домену зв'язування (CBD). Детальний опис даного винаходу В даному документі розкритими є модифікації Trichoderma reesei мананаз (EC 3.2.1.78) та нуклеїнова кислота, що кодує мананази, які можуть бути використаними в промислових застосуваннях, в тому числі способах гідролізу протеїну, розщеплення біомаси та для підвищення розщеплення галактоманану, які містяться в продуктах харчування та кормах для тварин. Зокрема, модифікації мананази відповідно до представленого винаходу, що демонструють покращену термічну стабільність, pH/пепсинову стабільність та, в той же час, покращені або залишкові специфічні активності в порівнянні з материнською мананазою застосованого ферменту. Дані характеристики роблять їх специфічно прийнятними в основному для промислового застосування в кормах для тварин, продуктах харчування та для розщеплення галактоманану в рослинному матеріалі. Представлений винахід розкриває ферменти з амінокислотною послідовністю, яка одержана з амінокислотної послідовності, показаної на SEQ ID NO:1, або її модифікації, модифіковані форми, гомологи, злиті протеїни, функціональні еквіваленти або фрагменти, або, які містять одне або більше включень, делецій або мутацій, або будь-яку їх комбінацію. Гомологічна мананаза, відповідно до представленого розкриття винаходу, включає будь-який фермент з послідовністю ідентичною, щонайменше, на 70 % або переважно щонайменше, на 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % або 99 %, переважно SEQ ID NO:1, більш переважно до SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 або SEQ ID NO: 9. Модифікації мананази за даним винаходом демонструють активність мананази та мають амінокислотну послідовність, що відрізняється від амінокислотної послідовності материнського/немутантного типу Trichoderma reesei мананази (SEQ ID NO: 1), тим що містить одну або більше варіацій (включаючи заміщення, включення та делеції). В переважному втіленні амінокислотна послідовність модифікації мананази містить, щонайменше, варіацію 201S, 207F та 274L, та, щонайменше, в одному або більше положеннях, що відповідають положенню 66, 215 або 259 в порівнянні з амінокислотною послідовністю SEQ. ID NO: 1. Наприклад, краща варіація в модифікації мананази може бути вибрана з групи, що складається з: 66P, 215T та 259R. Переважним втіленням розкриття винаходу є модифікація мананази відповідно до SEQ ID NO: 4 або її модифікації, модифіковані форми, гомологи, злиті протеїни, функціональні еквіваленти або фрагменти, або, які містять одне або більше включень, делецій або мутацій, або будь-яку їх комбінацію, та мананаза, яка має, щонайменше, мінімальний відсоток 3 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 ідентичності послідовності та/або відсоток гомологічності до мананази SEQ ID NO: 4, де мінімальний відсоток ідентичності та/або гомологічності становить, щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 93 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. В наступному переважному втіленні модифікації мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, містять на додаток до варіацій 201S, 207F і 274L та варіації в одному або більше положень, що відповідають положенню 66, 215 або 259, варіацію в положенні 3 та/або 181, що відповідає положенню амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 1. Наприклад, варіацією в положенні 3 є 3R, варіацією в положенні 181 є 181A або 181H (181/A/H). В наступному переважному втіленні модифікації мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, містять варіації 201S, 207F і 274L та, щонайменше, варіації в положенні 66, 215 та 259 в порівнянні з амінокислотною послідовністю SEQ. ID NO: 1. В кращими прикладами варіацій в положеннях 66, 215 та 259, відповідно, є 66P, 215T та 259R. В наступному втіленні модифікації мананази містять, на додаток до варіацій 201S, 207F та 274L та в положенні 66, 215 та 259, варіацію в положенні, переважно, 181A/H у порівнянні з амінокислотною послідовністю SEQ. ID NO: 1. В переважному втіленні модифікації мананази, крім того, містять варіацію в положенні 3, аналогічну 3R. В переважному втіленні амінокислотна послідовність модифікації мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, містить, щонайменше, варіацію 201S, 207F та 274L, та щонайменше варіацію в одному або більше положеннях, що відповідають положенню 66, 215 або 259 та одну або більше додаткових варіацій, де положеннями варіацій є 31, 97, 113, 146, 149, 173, 181, 280, 282, 331 або 344 у порівнянні з амінокислотною послідовністю SEQ. ID NO: 1. Наприклад, варіаціями є 31Y, 97R, 113Y, 146Q, 149K, 173H/T, 181H/A, 280S/L/R, 282D, 331S або 344D. Переважними втіленнями розкриття винаходу є модифікації мананази, які мають, щонайменше, мінімальний відсоток ідентичності послідовності та/або відсоток гомологічності до мананаз відповідно до представленого розкриття винаходу, де мінімальний відсоток ідентичності та/або гомологічності становить щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 93 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Переважними втіленнями, крім того, є модифікації мананази, що демонструють активність мананази та мають амінокислотну послідовність, яка змінює амінокислотну послідовність материнського/немутантного типу Trichoderma reesei мананази (SEQ ID NO:1), де амінокислота модифікації мананази містить варіації 201S, 207F та 274L, та, щонайменше, варіації вибрані з групи, що складається з: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) 14) 15) 16) 17) 18) 19) 20) 21) 22) 23) F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331 S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D F31Y/S66P/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D 4 UA 107212 C2 24) 25) 26) 27) 28) 29) 30) 31) 32) 33) 34) 35) 36) 37) 38) 39) 40) 41) 42) 43) 44) 45) 46) 47) 48) 49) 50) 51) 52) 53) 54) 55) 56) 57) 58) 59) 60) 61) 62) 63) 5 10 15 S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181A/A215T/Q259R F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L F31Y/S66P/Q97R/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/V181H/A215T/Q259R/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S S66P/V181H/A215T/Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N331S S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D S66P/V181H/A215T/Q259R S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/N173T/V181H/A215T/Q259R/N282D F31Y/S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N344D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S S66P/A215T/ Q259R S3R/S66P/A215T/ Q259R Втілення даного винаходу, крім того, включають модифікації будь-якої з мананаз, викладені в послідовностях з 1) до 63), які демонструють активність мананази та містять амінокислотну послідовність, що мають відсоток ідентичності послідовності та/або відсоток гомологічності щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 93 %, щонайменше 95 %, щонайменше 96 %, щонайменше 97 %, щонайменше 98 %, та щонайменше 99 % в порівнянні до кожної з модифікацій мананази, викладених в послідовностях з 1) до 63). Наступними втіленнями винаходу є молекули нуклеїнових кислот, вибраних з групи, що складається з: a) молекула нуклеїнової кислоти, що кодує модифікації мананази відповідно до представленого розкриття винаходу; b) молекула нуклеїнової кислоти, що кодує похідні модифікації мананази відповідно до представленого розкриття винаходу, переважно, в яких похідні одного або більше амінокислотних залишків є традиційно заміщеними; c) молекула нуклеїнової кислоти, що є фракцією, модифікацією, гомологом, похідною або фрагментом молекули нуклеїнової кислоти, представленої як SEQ ID NO: 5; d) молекула нуклеїнової кислоти, що є здатною до гібридизації з будь-якими молекулами нуклеїнової кислоти a) – c) за жорстких умов; 5 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 e) молекула нуклеїнової кислоти, що є здатною до гібридизації з комплементом будь-яких молекул нуклеїнової кислоти a) – c) за жорстких умов; f) молекула нуклеїнової кислоти, що має ідентичність послідовності, щонайменше, 95 % з будь-якими молекулами нуклеїнової кислоти a) – e), та, що кодує мананазу; g) молекула нуклеїнової кислоти, що має ідентичність послідовності, щонайменше, 70 % з будь-якими молекулами нуклеїнової кислоти a) – e), та, що кодує мананазу; h) або комплемент будь-яких молекул нуклеїнової кислоти a) – g). Наступними втіленнями винаходу є вектори та клітини-господарі, які містять молекули нуклеїнових кислот, що кодують модифікації мананази відповідно до представленого розкриття винаходу. Крім того, втіленнями є способи одержання модифікацій мананази відповідно до розкриття винаходу, які включають культивування трансформованої клітини-господаря та виділення модифікованої мананази з культури. Якщо не зазначено інше в даному документі, всі технічні та наукові терміни, використані в даному документі мають таке саме значення як загально зрозуміле будь-якому кваліфікованому фахівцю в тій галузі, до якої належить розкриття винаходу. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), та Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) забезпечують будь-якого кваліфікованого спеціаліста загальним словником багатьох термінів, що використовують в даному винаході. Дане розкриття винаходу не обмежується ілюстративними способами та речовинами, розкритими в даному документі, та будь-які способи та речовини подібні або еквівалентні тим, що розкриті в даному документі, можуть бути застосовані на практиці або в дослідженнях втілень за даним винаходом. Числові діапазони є такими, що включають чисельність, яка визначає діапазон. Якщо не зазначено інше, послідовності нуклеїнових кислот записують з ліва на право в орієнтації 5' до 3'; амінокислотні послідовності записують з ліва на право в орієнтації від аміно до карбокси, відповідно. Заголовки, зазначені в даному документі, не є обмеженнями для різних аспектів або втілень даного винаходу, які можуть бути одержані за допомогою посилань на опис в цілому. Відповідно, терміни, визначені безпосередньо нижче, є більш повно визначеними шляхом посилання на опис в цілому. В одному втіленні представленого винаходу ферменти мананази демонструють особливо покращену термічну стабільність та, в той же час, покращену або збережену специфічну активність порівняно з ферментами мананази, розкритими в WO 2008/009673. Дані характеристики роблять їх особливо придатними для промислового застосування загалом в кормах для тварин, продуктах харчування та для розщеплення галактоманану в рослинних матеріалах. Тому, представлене розкриття винаходу, крім того, спрямоване на спосіб продукування мананаз в Trichoderma reesei, активних при низьких значеннях pH, як ті, що присутні в шлунку та верхній частині кишечнику тварин та зобі, шлунку та верхній частині кишечнику у птахів. Передбачається, що ще іншим об'єктом за представленим винаходом є мананаза, яку можуть додавати в корм тварин до гранулювання, для того щоб зробити можливим точне та відтворюване дозування ферменту, та уникнути додаткової стадії розпилювання у виготовленні кормів. Термін „мананаза" стосується будь-якого ферменту здатного гідролізувати полісахаридні ланцюги, що складаються з манозних одиниць (манополімери або поліманози). "Мананаза", таким чином, містить як ендомананази так і екзомананази, які розщеплюють мано полімери всередині або з термінальних кінців полімеру, відповідно. Термін "функціональний еквівалент мананази" або "її функціональний еквівалент" означає, що фермент повинен мати майже такі ж самі характеристики, як і той що з Trichoderma reesei мананази. Термін "модифікована форма" або "модифікація" означає, що фермент був модифікованим з його вихідної форми (материнського/немутантного типу, нт), але зберігає ті ж самі функціональні характеристики, як і в того, що з Trichoderma reesei мананази. Термін "злиті протеїни" включає всі протеїни, що походять з материнської мананази або будь-якої її модифікації шляхом ковалентного злиття додаткової амінокислотної послідовності на C- та/або N-кінцях. Джерело та композиція додаткової амінокислотної послідовності є або природними з будь-яких живих організмів або вірусів, або неприродними. 6 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "функціональний фрагмент" або "ефективний фрагмент" означає фрагмент або частину Trichoderma reesei мананази або її похідної, що зберігає майже ті самі ферментну функцію або ефект. Термін "гомолог мананази" відповідно до представленого розкриття винаходу включає будьякий фермент з ідентичністю послідовності щонайменше 70 % або, переважно, щонайменш 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % або 99 % до материнської мананази. Термін "полінуклеотид" відповідає будь-якому генетичному матеріалу будь-якої довжини та будь-якої послідовності, що містять молекули одноланцюгової та дволанцюгової ДНК та РНК, в тому числі регуляторні елементи, структурні гени, групи генів, плазміди, цілі геноми та їх фрагменти. Термін "положення" в полінуклеотиді або поліпептиді стосується конкретних одинарних основ або амінокислот в послідовності полінуклеотиду або поліпептиду, відповідно. Термін "поліпептид" включає протеїни, такі як ферменти, антитіла, тощо, середньої довжини поліпептиди, такі як пептидні інгібітори, цитокіни, тощо, а також короткі пептиди зі зниженою амінокислотною послідовністю, довжина якої становить нижче десяти, такі як пептидні ліганди рецепторів, пептидні гормони, тощо. Термін "модифікації мананази" означає будь-яку молекулу мананази, одержану шляхом сайт-спрямованого або рандомізованого мутагенезу, включення, делеції, рекомбінації та/або будь-яким іншим способом протеїнового інженерінгу, який призводить в результаті до мананаз, що відрізняються своєю амінокислотною послідовністю від материнської мананази. Терміни "немутантного типу мананаза", "немутантного типу фермент" або "немутантний тип" у відповідності до розкриття винаходу описують фермент мананази з амінокислотною послідовністю, знайденою в природі або її фрагмент. "Материнською мананазою" може бути: або виділена немутантного типу мананаза, або її фрагмент, або одна або більше модифікацій мананази, вибрана з бібліотеки мананаз. Термін "бібліотека мананаз" описує, щонайменше, одну модифікацію мананази або суміш мананаз, в яких кожна одинична мананаза, відповідно, кожна модифікація мананази, кодується різною полінуклеотидною послідовністю. Термін "бібліотека генів" означає бібліотеку полінуклеотидів, яка кодує бібліотеку мананаз. Термін "виділений" описує будь-яку молекулу відокремлену від її природного джерела. Термін "мутація" стосується заміщення або заміни одного або різних нуклеотидних триплетів, включення або делеції одного або більше кодонів, гомологічна або гетерологічна рекомбінація між різними генами, злиття додаткових кодуючих послідовностей з кожним кінцем кодуючої послідовності, або введення додаткових кодуючих послідовностей або будь-які комбінації цих способів, які в результаті призводять до послідовності полінуклеїнової кислоти, що кодує бажаний протеїн. Таким чином, термін "мутації", крім того, стосується всіх змін в поліпептидній послідовності, кодованій послідовністю полінуклеїнової кислоти, яка модифікована шляхом однієї або більше змін, описаних вище. Амінокислотні залишки скорочують відповідно до наступної таблиці 1 або в одно- або в трьох-літерний код. Термін "молекула нуклеїнової кислоти" або "нуклеїнова кислота" призначений, щоб продемонструвати будь-яку молекулу одно- або дволанцюгової нуклеїнової кислоти цДНК, геномної ДНК, синтетичної ДНК або РНК, ПНК або ЗНК. Термін "жорсткі умови" стосується умов, за яких зразок гібридизуватимуть до його підпослідовності мішені, але не до інших послідовностей. Жорсткі умови є послідовністьзалежними та будуть різними за різних обставин. Довші послідовності гібридизуються особливо при більш високих температурах. Загалом, жорсткі умови вибирають такими, щоб температура була на близько 5 °C нижче, ніж термічна температура плавлення (Tm) для конкретної послідовності при визначеній іонній силі та pH. Tm є температурою (при визначеній іонній силі, pH та концентрації нуклеїнової кислоти), при якій 50 % зразків комплементарних до послідовності мішені гібридизують до послідовності мішені при рівновазі. (Тоді як послідовності мішені, як правило, є присутніми в надлишку, при Tm, 50 % зразків є зайнятими при рівновазі). Як правило, жорсткі умови будуть такими, при яких концентрація солі є меншою, ніж близько 1,0 M іонів Na, як правило, близько від 0,01 до 1,0 M іонів Na (або інші солі) при від pH 7,0 до 8,3 та температура становить, щонайменше, близько 30 °C для коротких зразків (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) та, щонайменше, близько 60 °C для більш довгих зразків. Жорсткі умови також можуть бути досягнуті шляхом додавання дестабілізуючих агентів, таких як формамід, тощо. Термін "фрагмент молекули нуклеїнової кислоти" призначений, щоб продемонструвати нуклеїнову кислоту, що містить напів-комплект молекули нуклеїнової кислоти, відповідно до однієї із заявлених послідовностей. Теж саме підходить для терміну "частина молекули нуклеїнової кислоти". 7 UA 107212 C2 5 10 Термін "модифікація молекули нуклеїнової кислоти" стосується, в даному документі, молекули нуклеїнової кислоти, яка є в значній мірі подібною за структурою та біологічною активністю до молекули нуклеїнової кислоти відповідно до однієї із заявлених послідовностей. Термін "гомолог молекули нуклеїнової кислоти" стосується молекули нуклеїнової кислоти, послідовність якої має один або більше нуклеотидів, що є доданими, видаленими, заміщеними, або іншим чином хімічно модифікована в порівнянні з молекулою нуклеїнової кислоти відповідно до однієї із заявлених послідовностей, за умови, що гомолог зберігає в значній мірі ті ж самі властивості зв'язування, як і у останнього. Термін "похідна", як використано в даному документі, стосується молекули нуклеїнової кислоти, що має подібні характеристики зв'язування з мішенню-послідовністю нуклеїнової кислоти, як молекули нуклеїнової кислоти, відповідно до однієї із заявлених послідовностей. Таблиця 1 Амінокислотні послідовності Скорочення A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y 15 20 25 30 Амінокислота Аланін Цистеїн Аспарагінова кислота Глутамінова кислота Фенілаланін Гліцин Гістидин Ізолейцин Лізин Лейцин Метіонін Аспарагін Пролін Глутамін Аргінін Серин Треонін Валін Триптофан Тирозин Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Мутації або варіації описані за допомогою використання наступної номенклатури: положення, заміщеного(их) залишку(ів) амінокислоти. Відповідно до даної номенклатури, заміщення, наприклад, аланінового залишку на гліциновий залишок в положенні 20 показано як 20G. Коли амінокислотний залишок в заданому положенні є заміщеним двома або більше альтернативними амінокислотними залишками, ці залишки розділяють комою або косою рискою. Наприклад, заміщення аланіну в положенні 30 або гліцином, або глутаміновою кислотою показують 20G/E, або 20G, 20E. Більш того, наступна номенклатура також може бути використана: амінокислотний залишок в протеїновому скефолді; положення; заміщений(і) залишок(ки) амінокислоти. Відповідно до даної номенклатури, заміщення, наприклад, аланінового залишку на гліциновий залишок в положенні 20 показують як Ala20Gly або A20G, або 20G. Видалення аланіну в тому ж самому положенні показують як Ala20* або A20*. Включення додаткового амінокислотного залишку (наприклад, гліцину) показують як Ala20AlaGly або A20AG. Видалення послідовного фрагменту секвенування амінокислотних залишків (наприклад, між аланіном в положенні 20 та гліцину в положенні 21) показують як Δ(Ala20-Gly21) або Δ(A20-G21). Коли послідовність включає делецію в порівнянні з материнським протеїном, використану для нумерації, включення в такому положенні (наприклад, аланін у видаленому положенні 20) показують як *20Ala або *20A. Багаторазові мутації розділяють знаком плюс або косою рискою. Наприклад, дві мутації в положеннях 20 та 21за яких відбувається заміщення аланіну та глютамінової кислоти на гліцин та серин, відповідно, позначають як A20G+E21S або A20G/E21S. Коли амінокислотний залишок в заданій позиції замінюється на два або більше альтернативних амінокислотних залишки, ці 8 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 залишки розділяють комою або косою рискою. Наприклад, заміщення аланіну в положенні 30 або на гліцин, або на глютамінову кислоту зображується як A20G, E, або A20G/E, або A20G, A20E. Коли прийнятне для модифікації положення визначають в даному документі, без якоїнебудь конкретної модифікації, що є запропонованою, слід розуміти, що будь-який амінокислотний залишок може бути заміщений на амінокислотний залишок, присутній в даному положенні. Так, наприклад, коли говориться, але конкретно не визначається, про модифікацію аланіну в положенні 20, то слід розуміти, що аланін, може бути видалений або заміщений на будь-який інший амінокислотний залишок (тобто, будь-який один з R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y або V). Терміни "консервативна мутація" або "консервативне заміщення", відповідно, стосується амінокислотної мутації, яку кваліфікований фахівець в даній галузі вважав би консервативною до першої мутації. "Консервативний" в даному контексті означає подібну амінокислоту в перекладі на амінокислотні характеристики. Якщо, наприклад, мутація в конкретному положенні призводить до заміщення неаліфатичного амінокислотного залишку (наприклад, Ser) на аліфатичний амінокислотний залишок (наприклад, Leu), то заміщення в тому ж самому положенні на іншу аліфатичну амінокислоту (наприклад, Ile або Val) відносять до консервативної мутації. Наступні амінокислотні характеристики включають розмір залишку, гідрофобність, полярність, заряд, значення pK, та інші амінокислотні характеристики, відомі з рівня техніки. Відповідно, консервативна мутація може включати заміщення, таке як основне на основне, кислотне на кислотне, полярне на полярне, тощо. Аналогічно, таким чином, набори амінокислот зберігаються через структурні причини. Дані набори можуть бути описані у вигляді діаграми Венна (Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756; Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218). Консервативні заміщення можуть бути зроблені, наприклад, відповідно до таблиці, наведеної нижче, яка описує загально розповсюджену діаграму Венна, що групує амінокислоти. Таблиця 2 Діаграма Венна, що групує амінокислоти Набір Гідрофобні FWYHKMILVAGC Полярні WYHKREDCSTNQ Малі 30 35 40 45 VCAGSPTND Піднабір Ароматичні FWYH Аліфатичні ILV Заряджені HKRED Позитивно HKR заряджені Негативно ED заряджені Дуже маленькі AGS Термін "каталітична активність" або "активність" кількісно описує перетворення заданого субстрату за визначених умов реакції. Термін "залишкова активність" визначається як співвідношення каталітичної активності ферменту за певним набором умов до каталітичної активності за іншим набором умов. Внаслідок цього залишкова активність a i виражається як: ai=vi/v0, де v означає будь-яку міру каталітичної активності та ai*100 є відносною активністю у відсотках. Термін "специфічна активність" кількісно описує каталітичну активність на кількість ферменту за певних умов реакції. Термін "термостабільність", "температурна стабільність" або "термічна стабільність" описує властивість протеїну витримувати обмежену дію нагріванням, не втрачаючи свою активність при більш низьких температурах, наприклад, при температурі, при якій можуть вимірювати його активність. Термін "pH-стабільність" описує властивість протеїну витримувати обмежену дію значень pH, які значно відхиляються від pH, при якому його стабільність є оптимальною, наприклад, більш ніж на одну pH-одиницю вище або нижче оптимального значення pH, не втрачаючи свою активність за умов, за яких можуть вимірювати його активність. Термін "протеолітична стабільність" описує властивість протеїну витримувати обмежену дію протеаз за умов, за яких протеази є активними, не втрачаючи свою активність за умов, за яких можуть вимірювати його активність. 9 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "плазмід", "векторна система" або "вектор експресії" означає конструкт здатний до in vivo або in vitro експресії. В контексті представленого розкриття винаходу дані конструкти можуть застосовувати для введення генів, що кодують ферменти в клітинах-господарях. Термін "клітина-господар", що стосується представленого розкриття винаходу, включає будь-яку клітину, що містить або молекулу нуклеїнової кислоти, або вектор експресії, як описано вище, та який використовують в рекомбінантному продукуванні ферменту, що має специфічні властивості, як визначено в даному документі, або в способах за представленим винаходом. "Температуру інактивації" визначають як температуру, при якій залишкова активність ферменту мананази після інкубування протягом певного періоду часу та наступного охолодження до кімнатної температури становить 50 % від залишкової активності такого ж самого ферменту мананази, інкубованого протягом такого ж періоду часу за тих самих умов при кімнатній температурі. Термін "поновлювальні ресурси" стосується субстратів біомаси, які вирощують та збирають, такі як зернові, солома, деревина та дерево продукти. Термін "біологічні види палива" стосується твердих, рідких або газоподібних видів палива, що складаються з або є похідними біомас, такі як біодизель, біогаз, рослинні олії, біоетанол, біо-водень, біо-диметиловий ефір, біометанол, BTL ("біомасу в рідину")-паливо, GTL ("газ в рідину")-паливо, тощо. Термін "їх функціональний еквівалент" означає, що фермент повинен мати приблизно такі ж функціональні характеристики, як і той що з Trichoderma reesei мананази. Термін "модифікована форма" або "модифікація" означає, що фермент повинен бути модифікованим з своєї природної форми, але залишати такі ж ферментні функціональні характеристики, як і той що з Trichoderma reesei мананази. Зокрема, терміни "модифікація" або "модифікована форма" охоплюють ферменти мананази з амінокислотною послідовністю, яка походить від амінокислотної послідовності з материнської/немутантної мананази та, яка має одне або більше амінокислотні заміщення, включення, делецій або будь-яку їх комбінацію, які разом згадуються як мутації. "Злиті протеїни" включають всі протеїни, що походять від материнської мананази або будьякої її модифікації, за рахунок ковалентного злиття додаткової амінокислотної послідовності з C- та/або N-кінцем материнської мананази. "Відсоток ідентичності послідовності", по відношенню між двома амінокислотними або полінуклеотидними послідовностями, стосується відсотку залишків, що є ідентичними в двох послідовностях, коли послідовності є оптимально встановленими в певному положенні. Таким чином, 80 % ідентичності амінокислотної послідовності означає, що 80 % амінокислот в двох оптимально встановлених в певному порядку поліпептидних послідовностях є ідентичними. Відсоток ідентичності можуть визначати, наприклад, шляхом прямого порівняння інформації про послідовності між двома молекулами за допомогою вирівнювання в певному порядку послідовностей, підраховуючи точну кількість пар між двома вирівняними послідовностями, розділяючи на довжину більш короткої послідовності, та помножуючи результат на 100. Для допомоги в аналізі можуть бути використані загально доступні комп'ютерні програми, такі як ALIGN, Dayhoff, M.O. в "Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff et., Suppl. 3:353358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, які адаптують локальний алгоритм гомології для пептидного аналізу Smith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489. Програми для визначення ідентичності нуклеотидної послідовності є доступними в Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (доступна від Genetics Computer Group, Madison, WI) наприклад, програми BESTFIT, FASTA та GAP, які також ґрунтуються на алгоритмі Smith та Waterman. Дані програми легко використовують 5 параметрів за замовчуванням, що є рекомендованими виробником та описаними в Wisconsin Sequence Analysis Package, згаданому вище. Приклад алгоритму, що є прийнятним для визначення подібності послідовності, є BLAST алгоритм, який є описаним в Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Програмне забезпечення для виконання BLAST аналізів є загально доступним через Національний центр біотехнологічної інформації (National Centre for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Крім того, комп'ютерні програми для визначення відсотку гомології є також легко доступними. "Корм" та "харчовий продукт", відповідно, означає будь-яке природне або штучне харчування, їжу, тощо, або компоненти такого харчування, які призначені або придатні для поїдання, поглинання, перетравлювання твариною та людиною, відповідно. "Харчова або кормова добавка" є сполукою або багатокомпонентною композицією, призначеною для або прийнятною для додавання у продукти харчування або корм. Вона може, але не є обов'язковим, включати одну або більше сполук, таких як вітаміни, мінерали або кормові підсилювачі ферментів та прийнятні носії та/або наповнювачі, та, як правило, надаються у формі, придатній для додавання в корм для тварин. 10 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Модифіковані форми або модифікації можуть демонструвати змінені ферментні характеристики в порівнянні з материнським ферментом. Переважно, модифіковані форми або модифікації мають один або більше з наступних покращених фенотипів: підвищену термостабільність; та/або підвищену протеолітичну (наприклад, проти пепсину) стабільність; та/або підвищену специфічну активність та/або покращену стабільність при низьких pH. Термін "функціональний" або "ефективний" фрагмент означає фрагмент або частину Trichoderma reesei мананази, що зберігає приблизно ту ж саму ферментну функцію або дію. Крім того, слід розуміти, що представлений винахід включає всі молекули, що є похідними від материнської мананази та всі їх модифікації, описані в даній заявці, шляхом посттрансляційної обробки в порівнянні з генетично кодованою амінокислотною послідовністю. Дані посттрансляційні модифікування включають, але не обмежуються цим, протеолітичне розщеплення N-термінальних послідовностей, таких як лідерна, та/або пропослідовностей, протеолітичне видалення C-термінальних видовжень, N- та/або O-глікозилювання, ліпідизування, ацилювання, деамідування, утворення піроглутамату, фосфорилювання та/або інші, або будь-яку їх комбінацію, так як вони здійснюють під час продукування/експресії за допомогою нативного господаря або будь-якого прийнятного господаря експресії. Дані посттрансляційні модифікування можуть мати або можуть не мати вплив на фізичні та ферментативні властивості ферментів як розглянуто в даному документі. Переважно, згадані зміни призводять до покращених властивостей ферменту, таких як 1. вища термостабільність та/або 2. вища специфічна активність та/або 3. покращена стабільність при низьких pH та/або 4. вища резистентність до протеолітичного розщеплення за допомогою протеаз, таких як пепсин; та/або 5. висока залишкова активність при низьких pH. В переважних втіленнях представленого винаходу, модифікована мананаза має заміщення в одному або більше положеннях 201, 207, 274, 66, 215, 259, 31, 97, 113, 146, 149, 173, 181, 280, 282, 331 або 344, відносно нумерації материнського/немутантного типу мананаза, представленої в SEQ ID NO:1. Дані положення характеризуються тим, що мутагенез ферменту в даних положеннях призводить до покращення характеристик бажаного ферменту. Не зважаючи на те, що, в основному, декілька амінокислотних заміщень у відповідності до материнського/немутантного типу мананази виявилися корисними з точки зору термостабільності, як самі по собі, так і/або в комбінації з іншими. Дані заміщення показані в Таблиці 3. Більш того, також виявилося, що декілька амінокислотних заміщень є дійсно корисними з точки зору pH стабільності, стабільності до протеаз (зокрема пепсину) та/або специфічної активності. Дані заміщення показані в Таблиці 4. В ще наступному аспекті винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти та застосування молекули нуклеїнової кислоти, вибраної з групи, що складається з: (a) молекула нуклеїнової кислоти, що кодує модифіковану мананазу відповідно до опису, наведеного вище; (b) молекула нуклеїнової кислоти, що кодує похідну модифікованої мананази відповідно до опису, наведеного вище, де в похідних один або більше амінокислотних залишків є консервативно заміщеними; (c) молекула нуклеїнової кислоти, представлена як SEQ ID NO:5; (d) молекула нуклеїнової кислоти, що є модифікацією, гомологом, похідною або фрагментом молекули нуклеїнової кислоти, представленої як SEQ ID NO:5; (e) молекула нуклеїнової кислоти, що є комплементом молекули нуклеїнової кислоти, наведеної в SEQ ID NO:5; (f) молекула нуклеїнової кислоти, що є комплементом модифікації, гомологу, похідної або фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, представленої як SEQ ID NO:5; (g) молекула нуклеїнової кислоти, що є здатною до гібридизації з молекулою нуклеїнової кислоти, наведеною в SEQ ID NO:5; (h) молекула нуклеїнової кислоти, що є здатною до гібридизації з модифікацією, гомологом, похідною або фрагментом молекули нуклеїнової кислоти, представленої як SEQ ID NO:5; (i) молекула нуклеїнової кислоти, що є комплементом молекули нуклеїнової кислоти, що є здатною до гібридизації з молекулою нуклеїнової кислоти, наведеною в SEQ ID NO:5; (j) молекула нуклеїнової кислоти, що є комплементом молекули нуклеїнової кислоти, що є здатною до гібридизації з модифікацією, гомологом, похідною або фрагментом молекули нуклеїнової кислоти, представленої як SEQ ID NO:5; 11 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (k) молекула нуклеїнової кислоти, що є здатною до гібридизації з комплементом молекули нуклеїнової кислоти, наведеної в SEQ ID NO:5; (l) молекула нуклеїнової кислоти, що є здатною до гібридизації з комплементом модифікації, гомологу, похідної або фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, представленої як SEQ ID NO:5. (m) молекула нуклеїнової кислоти, яка має ідентичність послідовності, щонайменше, 95 % з будь-якими молекулами нуклеїнової кислоти a) – l), та яка є кодуючою для мананази, (n) молекула нуклеїнової кислоти, яка має ідентичність послідовності, щонайменше, 70 % з будь-якими молекулами нуклеїнової кислоти a) – b), та яка є кодуючою для мананази, та/або (o) фракція або комплемент будь-яких молекул нуклеїнової кислоти a) – n). Вважається, що нуклеотид або нуклеїнова кислота гібридизують з одним зі згаданих вище нуклеотидів, якщо він/вона є здатним до гібридизації за умов сильного середовища, більш переважно – високої жорсткості, ще більш переважно за дуже високо жорстких умов. Для приготування блоту гібридизації можуть використовувати стандартні протоколи з молекулярної біології для блотингу (наприклад, саузерн-блоттінг для ДНК гібридизацій). Кількість мішених ДНК залежить від відносної розповсюдженості послідовності мішені. Якщо для використання повинна бути чиста послідовність-мішень, то переважним є від 1 до 5 пікограм ДНК на тисячу гетероциклічних основ полінуклеотидів. Як правило, обмеження детектування 9 становить близько 0,5 пг ДНК для радіоактивної проби зі специфічною активністю 10 (число розпадів за хвилину)/мг, яка є еквівалентною одиничній копії гену 500 пар основ в довжину, 3,3 мг геномної ДНК складного геному (наприклад, людини). На практиці використовується приблизно 10 мг геномної ДНК – наприклад, для скринінгу організмів, таких як мікроорганізми, які містять мананазу, що кодує полінуклеотид за розкриттям винаходу. Якщо ДНК-мішень є бактеріальною або плазмі дою, вона повинна буде розбавляти ДНК, таким чином, щоб уникнути надмірної дії. ДНК-мішень є блотованою, наприклад, за допомогою дот-блоттінгу або за рахунок блоттінгу з гелю електрофорезу. Переважні умови описані в "Membrane Transfer and Detection Methods", Amersham International plc, UK.- PI/162/85/1). Переважно застосовують Hybond N+ – позитивно заряджену нейлонову мембрану (Amersham Life Science). Пробу переважно готують TM відповідно до Pharmacia's "Ready to Go DNA labeling kit", щоб підготувати пробу > 1 × 109 (число розпадів за хвилину)/мікрограм. Пробу використовують в гібридизаційному буфері в концентрації 1 × 106 число розпадів за хвилину на мілілітр гібридизаційного буферу. Блоти переважно попередньо гібридизують в гібридизаційному буфері (6 х SSC, 5 х розчин Рейнхардта та 0,5 % SDS, та денатурованої ДНК сперми лосося до 100 мг/мл буфера) протягом години при 65° C, після чого проводять гібридизацію в гібридизаційному буфері, що містить денатуровану мічену пробу, зі струшуванням протягом 12 годин при температурі 65 °C. Потім блот(и) промивають прийнятним об'ємом промивного буферу (як правило 50 мл) в 2xSSC, 0,1 % SDS протягом 30 хвилин при 65 °C, з наступним другим промиванням в прийнятному об'ємі промивного буферу (як правило 50 мл) в або такому ж промивному буфері (2xSSC, 0.1 % SDS) для жорсткого середовища промивання, або 0,1 % x SSC, 0,1 % SDS протягом 10 хвилин при 65 °C (висока жорсткість), друге промивання можуть повторювати при 70 °C для кожного промивання високої жорсткості. Молекула нуклеїнової кислоти за представленим винаходом може містити нуклеотидні послідовності, які кодують SEQ ID NO:1 або їх ефективний фрагмент, або їх модифікацію, модифіковану форму, гомолог, або похідну. Зокрема, розкриття винаходу передбачає плазмід або векторну систему, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує мананазу, як описано в даному документі, або їх гомолог, або похідну. Переважно, плазмід або векторна система містить послідовність нуклеїнової кислоти, що є кодуючою для амінокислоти SEQ ID NO:4 або послідовність, що становить, щонайменше, 75 % гомологічності до цієї або їх ефективний фрагмент, або будь-які похідні SEQ ID NO:1, описані в даному документі. Відповідним чином, плазмід або векторна система є вектором експресії для експресії будь-яких ферментів, кодованих послідовністю нуклеїнової кислоти, як викладено в будь-якій з SEQ ID NO:4 або послідовності, що є, щонайменше, на 75 % гомологічною (ідентичною) до цієї в мікроорганізмі. Прийнятні вектори експресії є описаними в даному документі. До того ж, розкриття винаходу передбачає плазмід або векторну систему для експресії будь-якого з модифікованих ферментів або модифікацій, або функціональних фрагментів, описаних в даному документі. Прийнятні вектори експресії є описаними в даному документі. Вдосконалення в характеристиках мананази відповідно до представленого винаходу є спрямованими на застосування в різних технічних процесах, таких як, але не обмежуючись цим, застосування як добавок до продуктів харчування та кормових продуктів, для обробки продуктів 12 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 харчування та корму, целюлозне та паперове виробництво, а також для стимуляції гідравлічного розриву пласта на нафтових та газових свердловинах, створення складів лікарських засобів з уповільненим вивільненням або в миючих засобах, зокрема, для видалення бактеріальних біоплівок. Зокрема, вдосконалення є спрямованими на стабільність ферментів при умовах таких або інших застосувань та/або на стабільність підчас проходження їжі через шлунок у випадку харчових або кормових добавок та/або на активність або стабільність в шлунку та/або кишковому тракті у людини або тварини в кислотних умовах верхніх відділів шлунково-кишкового тракту. Такі вдосконалення включають, серед інших параметрів, підвищення стабільності при підвищених температурах, переважно при температурах вище 60 °C, та/або підвищення стабільності до протеолітичного розщеплення, переважно до протеаз шлунково-кишкового тракту, та/або підвищення стабільності при низьких pH, та/або активність при низьких значеннях pH, та/або загальну ефективність вивільнення манози та/або олігоманоз із великих поліманози, що містять вуглеводи. Зростання стабільності при підвищених температурах вимірюють шляхом температурної інактивації ферменту. Температуру інактивацію визначають як температуру, при якій залишкова активність ферменту мананази після інкубування протягом певного періоду часу та наступного охолодження до кімнатної температури становить 50 % від залишкової активності такого ж самого ферменту мананази, інкубованого протягом того ж самого періоду часу за тих же умов при кімнатній температурі. Різниці в термічній стабільності є різницями в°C між температурами інактивації двох ферментів. В переважному втіленні розкриття винаходу модифікації мананази застосовують в процесах при підвищених температурах, проводячи модифікації мананази з більш високою бажаною температурою інактивації. В порівнянні з немутантним типом мананази, мананази за винаходом характеризуються більш високою залишковою активністю після термічної інкубації при температурах вищих за температуру інактивації немутантного типу мананази, забезпечуючи більш високу стабільність процесу. Клонування T. reesei mannanase: До того ж мананаза з Trichoderma reesei як показано в SEQ ID NO:1 наступна мананаза Trichoderma reesei була клонована, маючи послідовність SEQ ID NO:1 із заміщенням серину на аргінін в положенні 3 (мутація S3R). Дану модифікацію мананази порівнювали з Trichoderma reesei мананазою, відповідно до SEQ ID NO:1 щодо термічної стабільності та каталітичної активності манози, яка вивільняється з поліманози, що включає субстрат. Результати, представлені на фігурі 10, демонструють, що заміщення S3R не мало впливу на властивості, що стосуються винаходу, та, тому, є природною мутацією (дивись також WO 2008/009673). Внаслідок цього, в контексті даного винаходу слід розуміти, що термін "нт", або "нт мананаза", або "немутантного типу мананаза", або "Trichoderma reesei мананаза" включає мананази відповідно до SEQ ID NO:1 та мананазу відповідно до SEQ ID NO: 1, що має на додаток природну мутацію S3R. Термічна стабільність в буфері: В переважному втіленні розкриття винаходу модифікації мананази мають підвищену залишкову активність та/або температуру інактивації, коли інкубували при температурах >60 °C протягом >30 хв. В більш переважному втіленні підвищену залишкову активність та/або температуру інактивації одержують після інкубування в ацетатному буфері протягом 45 хв. Переважно, температура інактивації модифікації мананази становить >68 °C, більш переважно >70 °C або >72 °C або >74 °C, або найбільш переважно >84 °C. Конкретні температури інактивації надані в таблиці 3 разом з їх відповідними мутаціями. Злиті протеїни: Крім того, слід розуміти, що амінокислотна послідовність наведена в SEQ ID NO:1 та її похідні, описані в даному документі, для застосування відповідно до представленого винаходу можуть бути одержані як N- та/або C-термінальний злитий протеїн, наприклад для допомоги в екстракції, виявленні та/або очищенні, та/або для додавання функціональних властивостей молекулі мананази. Злитий протеїн-партнер може бути будь-яким протеїном або пептидом, в тому числі будь-якою поліпептидною послідовністю, яка походить від нативного господаря, будь-якою іншою, що зустрічається в природі, амінокислотною послідовністю, а також синтетичними послідовностями. Приклади злитих протеїнів-партнерів включають, але не обмежуються цим, глутатіон-S-трансферазу (GST), 6xHis, GAL4 (ДНК зв'язування та/або транскрипційні домени активації), FLAG-, MYC-маркери або інші маркери, добре відомі будьякому кваліфікованому фахівцю в даній галузі з рівня техніки. Крім того, може бути зручно включити сайт протеолітичного розщеплення між злитим протеїном-партнером та протеїновою послідовністю, що викликає інтерес, що дозволить видалення злитих протеїнових послідовностей. Переважно, злитий протеїн не буде перешкоджати активності протеїнової послідовності, що викликає інтерес. 13 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В переважному втіленні розкриття винаходу модифікації мананази є злитими з функціональними доменами, в тому числі з лідерними пептидами, пропептидами, доменами зв'язування або каталітичними доменами. Домени зв'язуванні можуть включати, але не обмежуються цим, домени зв'язування вуглеводу різної специфічності, що забезпечує підвищену афінність до вуглеводних компонентів, присутніх під час застосування мананази. Крім тог, передбачається, що домен злитого партнера може містити ферментативно активні домени, такі як активності, що підтримують дію мананази в продукуванні бажаного продукту шляхом забезпечення активності одного або більше компонентів субстрату та/або будь-якого продукту каталітичної реакції мананаза. Необмежуючі приклади каталітичних доменів включають: целюлази, геміцелюлози, такі як ксиланаза, ексо-мананазі, глюканази, арабінази, галактозідази, пектінази, та/або інші активні, такі як протеази, ліпази, кислотні фосфатази та/або їх інші або функціональні фрагменти. Лінкери: Злиті протеїни необов'язково можуть бути зв'язаними з мананазою через лінкерну послідовність, що містить, переважно, менше ніж 100 амінокислот, більш переважно, менше ніж 50 амінокислот, менше ніж 30 амінокислот або менше ніж 20 амінокислот. Лінкер може просто приєднуватися до мананази та злитого домену без істотного впливу на властивості будь-якого компоненту, або він може, необов'язково, мати функціональне значення для передбачуваного застосування завдяки своїй амінокислотній композиції, структурі та/або пост трансляційному модифікуванню, яке відбувається під час експресії в нативному господарі або будь-якому прийнятному гетерологічному господарі. Джерело послідовності лінкеру може бути з амінокислотної послідовності від будь-якого організму або будь-якої синтетичної пептидної послідовності. Додаткові протеїни: Мананази, описані в даному документі, для застосування за представленим описом, крім того, можуть бути застосовані в поєднанні з одним або більше додатковими протеїнами, що викликають інтерес (POI), або нуклеотидними послідовностями, що викликають інтерес (NOI). Необмежуючі приклади POI включають: фітази, геміцелюлази, альфа-галактозидази, бета-галактозидази, лактази, бета-глюканази, ендо-бета-1,4-глюканаза, целюлази, ксилозидази, ксиланази, ксилоглюканази, ксилан ацетил-естерази, галактанази, екзо-мананази, пектінази, пектинліази, пектинестерази, полігалактуронази, арабінази, рамногалактуронази, лаккази, редуктази, оксидази, фенолоксидази, лігнінази, протеази, амілази, фосфатази, ліполітичні ферменти, кутінази та/або інші. Вони включають ферменти, що, наприклад, модулюють в'язкість розчину/суспензії субстрату або підвищують доступність та/або розчинність субстрату поліманози. NOI може навіть бути антисмисловою послідовністю для будь-яких таких послідовностей. Як описано вище, POI може навіть бути злитим протеїном. POI може навіть бути злитий з послідовністю секреції. В переважному втіленні модифікацію мананази відповідно до представленого розкриття винаходу застосовують в поєднанні з, щонайменше, фітазами. Інші послідовності також можуть сприяти секреції або збільшенню виходу секретованого POI. Такі послідовності могли кодувати білки теплового шоку, як наприклад, продукт гена Aspergillus niger cyp B, описаний заявці на патент UK 9821198.0. NOI, що кодують POI можуть бути сконструйовані для того, що змінити їх активність з багатьох причин, включаючи, але не обмежуючись цим, зміни, які модифікують процес обробки та/або експресію його продукту експресії. У вигляді наступного прикладу NOI також може бути модифікованим, щоб оптимізувати експресію в конкретній клітині-господарі. Інші зміни послідовності можуть бути бажаними для того, щоб ввести сайти розпізнавання ферментів рестрикції. NOI, що є кодуючою для POI може включати свої синтетичні або модифіковані нуклеотиди – такі як метилфосфонат та фосфоротіоат скелету. NOI, що є кодуючою для POI може бути модифікована для підвищення внутрішньоклітинної стабільності та періоду напів-життя. Можливі модифікування включають, але не обмежуються цим, додавання фланкуючих послідовностей до 5' та/або 3' кінців молекули, або застосування фосфоротіоату, або 2' O-метилу замість фосфодискладноефірних зв'язків зі скелетом молекули. Експресія генів мананази: З метою продукування ферменту мананази, ДНК, що кодує фермент, може бути хімічно синтезованою з опублікованих послідовностей або одержану безпосередньо з клітин-господарів, що утримують ген (наприклад, шляхом скринінгу цДНК бібліотеки або PCR ампліфікації). Ген мананази може бути включеним в касету експресії та/або клонованим в прийнятний вектор експресії за допомогою стандартних молекулярних методик клонування. Такі касети експресії або вектори часто містять послідовності, які сприяють ініціації 14 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та термінації транскрипції (наприклад, промотори та термінатори), та можуть містити маркери, що вибираються. Крім того, касети можуть бути у складі плюс або мінус одинарної нитки мРНК, та їх експресія може або не може включати стадію ампліфікації перед трансляцією мРНК. Ген мананази, що експресує, може містити або не містити певні домени протеїну, такі як полімерні домени зв'язування (наприклад, вуглеводневі домени зв'язування) різних специфічностей. Касета експресії або вектор можуть бути введені в прийнятну клітину-господар експресії, яка потім буде експресу вати відповідний ген мананаза. Особливо прийнятними господарями експресії є господар експресії бактеріального виду, в тому числі Escherichia (наприклад, Escherichia coli), Pseudomonas (наприклад, P. fluorescens або P. stutzerei), Proteus (наприклад, Proteus mirabilis), Ralstonia (наприклад, Ralstonia eutropha), Streptomyces, Staphylococcus (наприклад, S. carnosus), Lactococcus (наприклад, L. lactis), молочнокислі бактерії або Bacillus (subtilis, megaterium, licheniformis, тощо.). Крім того, особливо прийнятними є дріжджові господарі експресії, такі як Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis або Pichia pastoris. Особливо придатними є грибкові господарі експресії, такі як Aspergillus niger, Chrysosporium lucknowense, Aspergillus (наприклад, A. oryzae, A. niger, A. nidulans, etc.) або Trichoderma reesei. Крім того, придатними є ссавцеві господарі експресії, такі як клітини ліній миші (наприклад, NS0), яєчника китайського хом'яка (CHO) або нирки новонародженого хом'яка (BHK), трансгенні ссавцеві системи, такі як кролики, кози або велика рогата худоба, інші еукаріотичні господарі, такі як клітини комах або вірусні системи експресії, такі як бактеріофаги подібно M13, T7 фаг або лямбда, або віруси, такі як системи експресії бакуловірусу, або рослини. Гени мананази вводять в клітини-господарі експресії шляхом цілого ряду трансформаційних способів, включаючи, але не обмежуючись цим, електропорацію, трансформацію, що асистується ліпідами, або трансфекцію ("ліпофекція"), хімічно опосередковану трансфекцію (наприклад, CaCl та/або CaP), трансформацію опосередковану літієм ацетатом (наприклад, з протопластів клітини-господаря), трансформацію біолістичної "генетичної пушки", ПЕГопосередковану трансформацію (наприклад, з протопластів клітини-господаря), злиття протопластів (наприклад, використовуючи бактеріальні або еукаріотичні протопласти), ліпосомо-опосередковану трансформацію, Agrobacterium tumefaciens, трансформацію або трансдукцію аденовірусу, або вірусу, або фагу. Альтернативно, модифікації ферменту експресують внутрішньоклітинно. Необов'язково, після внутрішньоклітинної експресії модифікацій ферменту, секреції в періплазматичному просторі, використовуючи сигнальні послідовності, такі як ті, що згадані вище, можуть використовувати стадію пермеабілізації або лізису для вивільнення ферменту мананази в супернатант. Дезинтеграція мембранного бар'єру може бути ефективною шляхом застосування механічних засобів, таких як обробка ультразвуковими хвилями, тиском (французький прес), кавітація або застосування мембрано-дезинтегруючих ферментів, таких як лізозими або суміш ферментів. Як наступна альтернатива, гени, що кодують фермент мананази, експресують безклітинно шляхом застосування прийнятної системи безклітинної експресії. Наприклад, S30 екстракт з клітин Escherichia coli застосовували для даної мети або комерційно доступні системи (наприклад, CECF технологія від Roche Applied Science, Inc.). В безклітинних системах, гени, що викликають зацікавленість, як правило, був транскрибований за допомогою промотору, але лігування для утворення кругового вектору експресії є необов'язковим. Крім того, РНК можуть бути екзогенно додані або генеровані без транскрипції та трансльовані в безклітинні системи. Конфігурації конструктів експресії для експресії in vitro та виконання всіх зазначених вище систем експресії знаходяться в межах можливостей кваліфікованого фахівця в даній галузі. Згадані вище способи клонування та експресії гену мананази Trichoderma reesei є прийнятними як для експресії в промислових масштабах та для застосування скрінінгу з високою пропускною здатністю для оцінки мутованих модифікацій. Очистка: Як описано вище, протеїни мананази можуть бути експресованими в різноманітних системах експресії та, відповідно, повинні бути вибрані відповідний в напрямку протікання процес та методики очистки. Протеїн, що викликає зацікавленість, може бути секретований в позаклітинному або периплазмічному просторі, або експресована внутрішньоклітинно. В переважному втіленні розкриття винаходу модифікацію мананази експресують в мікробному господарі та протеїн секретується в периплазмічному або позаклітинному просторі. Клітини, що експресують модифікації мананази, зберігають, використовуючи способи добре відомі будьякому кваліфікованому фахівцю з рівня техніки, такі як, не обмежуючись цим, кріо-збереження. Культури експресуючого організму одержують у відповідному об'ємі стандартними способами ферментації. В переважному втіленні культури для експресії протеїну інокулюють з кріо 15 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 збереженими та об'єм культури збільшився у відповідних контейнерах. В переважному втіленні клітини вирощують в ферментері та необов'язково контролюють умови росту клітини, такі як pH, температуру, вміст кисню та/або поживних речовин. Перша стадія очистки включає відокремлення клітин від супернатанту, використовуючи одну або більше різних методик, таких як седиментація, мікрофільтрація, центрифугування, флокуляція або інші. В переважному втіленні способом, що застосовують, є мікрофільтрація. У випадку внутрішньоклітинної експресії клітини піддають обробкам, які в результаті призводять до вивільнення протеїну з внутрішньоклітинного простору. Такі обробки можуть включати, наприклад, обробку тиском, ферментну обробку, осмотичний шок, заморожування, ультразвукову або інші обробки, щоб одержати клітинний екстракт, який можуть або не можуть піддавати подальшій очистці. В переважному втіленні розкриття винаходу протеїн секретується в супернатанті та необов'язкова стадія очистки включає концентрування супернатанту шляхом ультрафільтрації. Подальшу очистку протеїну з супернатанту або концентрованого супернатанту можуть виконувати одним або більше різними способами, які включають екстракцію або способи фракціонування, такі як осадження сульфатом амонію, або етанолом, або кислотою, або хроматографічні способи, у тому числі, але не обмежуючись цим, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії, гідроксилапатитна хроматографія, фракціонування за розміром шляхом гель-фільтрації, фосфоцелюлозна або лектинова хроматографія та афінна хроматографія або будь-яка їх комбінація. В більш переважному способі афінно-маркований протеїн очищують шляхом метал-хелатної афінної хроматографії, одержуючи високо чистий протеїн. Переважний спосіб очищення дає чистоту протеїну >30 %, в більш переважному способі чистота становить >50 %, >60 %, >70 %, або >80 %. В ще більш переважному способі чистота становить >90 %, в ще більш переважному способі чистота становить >95 % та в найбільш переважному способі чистота становить >98 %. В іншому переважному втіленні розкриття винаходу супернатанту або частково очищений супернатант шляхом ультрафільтрації, або концентрований та/або діафільтрований супернатант сушать за допомогою будь-якого одного з різних технічних способів, таких як, але не обмежуючись цим, сушка розпиленням, ліофілізація, випаровування низхідним потоком повітря, випаровування з тонкого шару, відцентрове випаровування, конвеєрне сушіння або будь-яка їх комбінація. В наступному переважному втіленні розкриття винаходу ферментовану суспензію клітин, включаючи експресовані модифікації мананази сушать як одне ціле, використовуючи процеси, такі як, але не обмежуючись цим, сушіння в псевдозрідженому шарі, конвеєрне сушіння, сушка розпиленням або сушіння в барабанній сушці або будь-яка їх комбінація. Формуляції: В основному, композиції мананази або будь-якої похідної, описаної в даному документі, можуть бути або рідкими, або сухими. Рідкі композиції можуть містити тільки одну мананазу або мананазу в комбінації з іншими протеїнами або ферментами та можуть включати додаткові компоненти, що сприяють стабільності та/або активності мананази або інших протеїнів або ферментів в композиції. Вони включають, але не обмежуються цим, гліцерин, сорбіт, пропіленгліколь, солі, цукри, консерванти, pH-буфери та вуглеводи. Як правило, рідкі композиції є водними або емульсіями на основі олії, суспензією або розчином. Сухі композиції можуть бути створені з будь-якої рідкої композиції, в тому числі з ферментативного супернатанту, або клітинної суспензії, або клітинного екстракту шляхом висушування розпиленням, ліофілізації, випаровування низхідним потоком повітря, випаровування з тонкого шару, відцентрового випаровування, конвеєрного сушіння або будьякої їх комбінації. Сухі композиції можуть бути гранулятами відповідного розміру, щоб бути сумісними з подальших застосуваннях у переробці, таких як обробка продуктів харчування та кормів, або готовими як компонент для продуктів харчування або корму для тварин. Перед висушуванням до рідкої композиції можуть додавати об'ємоутворюючий агент, який після висушування, ефективно посилює властивості сухої композиції, таким чином як, забезпечуючи більш високу термічну стабільність, завдяки захисту ферменту від факторів навколишнього середовища за допомогою об'ємоутворюючого реагенту, кращих технічних властивостей обробки, тощо. Одержують одне сухе приготування, агломераційні грануляти можуть бути приготовлені, використовуючи методики агломерації, наприклад, в мішалці, що забезпечує високі напруги зсуву, під час чого речовина-наповнювач та фермент спільно агломерують з утворенням гранул. Абсорбційні грануляти готують за допомогою ядер речовини носія, що є в наявності, щоб абсорбувати на них або покрити їх ферментом. Типові речовини-наповнювачі включають динатрію сульфат, каолін, тальк, магнію алюмінію силікат та целюлозні волокна. Крім того, 16 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 агломераційні грануляти необов'язково включають зв'язуючі речовини, такі як декстрини. Типові речовини-носії включають крохмаль, наприклад, у формі маніоку, кукурудзи, картоплі, рису та пшениці, або можуть використовувати їх солі. Грануляти необов'язково покривають сумішшю для покриття. Така суміш містить агенти для покриття, переважно гідрофобні агенти для покриття, такі як гідрогенізована пальмова олія та яловичий жир, та, якщо необхідно, інші добавки, такі як кальцію карбонат та каолін. В особливо переважному втіленні композиції, що містять мананази за винаходом, призначенні для застосування в переробці продуктів харчування та кормів або як добавки до продуктів харчування та кормів. В даному випадку, композиції мананази можуть додатково включати інші замісники, такі як барвники, ароматичні сполуки, стабілізатори, вітаміни, мінерали, інші кормові та харчові добавки, що підвищують рівень ферментів, тощо. Це стосується, зокрема, так званих преміксів. Харчові добавки, відповідно до даного представленого розкриття винаходу, можуть бути поєднаними з іншими харчовими компонентами для виробництва оброблених харчових продуктів. Такі інші харчові компоненти включають одну або більше інших, переважно термічно стабільних, ферментних добавок, вітамінних харчових добавок та мінеральних харчових добавок. Одержана в результаті комбінована харчова добавка, в тому числі, можливо, декілька різних типів сполук, потім, можуть бути змішані у відповідній кількості з іншими компонентами їжі, такими як зернові або рослинні білки, що утворюють оброблені продукти харчування. Обробку таких компонентів до харчового продукту можуть виконувати, використовуючи будь-який з доступних на даний час способів. В переважному втіленні розкриття винаходу композиція мананази додатково містить ефективну кількість одного або більше харчових продуктів або кормів, що підвищують рівень ферментів, а саме, вибраних з групи, що складаються з, але не обмежуються цим, фітаз, геміцелюлаз, альфа-галактозидаз, бета-галактозидаз, лактаз, бета-глюканаз, ендо-бета-1,4глюканаз, целюлаз, ксилозидаз, ксиланаз, ксилоглюканаз, ксилан ацетил-естераз, галактаназ, екзо-мананаз, пектіназ, пектинліаз, пектинестераз, полігалактуроназ, арабіназ, рамногалактуроназ, лакказ, редуктаз, оксидаз, фенолоксидаз, лігніназ, протеаз, амілаз, фосфатаз, ліполітичних ферментів, кутіназ та/або інших. Формуляції мананаз за винаходом застосовують для переробки та/або виробництва харчових продуктів або кормів для тварин. Технічні застосування: Передбаченим є використання похідних мананази як харчових добавок або засобів, що допомагають травленню, які сприяють розщепленню харчових речовин, що містять олігоманозу, таким чином, вивільняючи потенційно корисні олігоманози або їх похідні. Іншим застосуванням в галузі переробки харчових продуктів та кормів є виробництво маноолігосахаридів, як важливих пребіотиків, з PKE для кормів та продуктів харчування. За допомогою обробки PKE або іншого галактоманану, що містить компоненти з мананази, одержують мано-олігосахариди та D-манозу. Мано-олігосахариди застосовують як пребіотики для кормів та продуктів харчування: мано-олігосахариди сприяють росту пребіотиків (наприклад, Bifidobacteria та Lactobacillus sp), інгібують ріст ентеробактерії Salmonella, нейтралізують непоживні властивості лектинів та знаходять застосування в фармацевтичній промисловості. Більш того, передбачається, що мано-олігосахариди, та особливо маноза, будуть імуностимулюючими компонентами в кормових продуктах. Ще іншим застосуванням в галузі обробки харчових продуктів та кормів є розщеплення компонентів, що містять манан в клітинній стінці фруктів для покращення відновлення соку, наприклад, шляхом додавання згаданих ферментів до ананасів, лимонів, апельсинів, лаймів, грейпфрутів, перед процесом видавлювання. Переважним застосуванням є використання модифікацій мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, в процесах випікання, наприклад, печива, хліба, тощо. Іншим застосуванням в галузі обробки харчових продуктів та кормів є використання мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, для покращення виходу при екстракції олії з ядра кокосового горіха. Вміст олії, що залишається в макусі ядра кокосового горіха становить близько 5-12 % після видавлювання. Цей залишок може бути надалі зменшений шляхом хімічної екстракції до близько 3 %. Шляхом застосування мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, вивільнення жиру могло б бути швидко збільшене, таким чином, забезпечуючи вдосконалення процесу. Крім того, в результаті одержували б макуху ядра кокосового горіха більш високої якості, завдяки зменшеному вмісту волокон галактоманану, які, як відомо, є непоживними компонентами корму. 17 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ще іншим застосуванням в галузі обробки харчових продуктів та кормів є доставка D-манози з PKE або інших компонентів, що містять галактоманан. Харчові ядра кокосового горіха містять близько 20 % манози, зв'язаної як галактомананові волокна. Обробка PKE, копри або ряду інших речовин з мананазами, що містять галактоманану, спричиняє вивільнення D-манози. Маноза та її похідні є інгредієнтами, які використовують в продуктах харчування (наприклад, низько калорійні дієтичні продукти харчування), фармацевтичних засобах (маноза лікує більш ніж 90 % від всіх інфекцій сечовивідних шляхів), косметичних засобів, текстильному виробництві та виробництві полімерів. Через обмежені поставки маноза є дуже дорогою на даний час в порівнянні з іншими більш поширеними гексозами-цурками, та її поставка є дуже малою. Крім того, D-манозу можуть застосовувати як сировину для одержання маніту. Маніт, сам по собі, є похідним манози шляхом відновлення з набагато більш високим виходом та зменшенням побічних продуктів, ніж при перетворенні з фруктози. Маніт є поліолом, який широко використовують в харчовій та фармацевтичній промисловості завдяки своїм унікальним функціональним властивостям: маніт використовують як підсолоджував для фармацевтичних препаратів (жувальних таблеток та гранульованих порошків), у виробництві жувальної гумки, як загужчуючий, текстуруючий та протиспікаючий агент для харчових продуктів, як осмоактивний фармацевтичний та діабетичний компонент продуктів харчування. Більш того, в контексті, зазначеному вище, обробки продуктів харчування та кормів застосування мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, передбачається для часткового гідролізу галактомананів шляхом інкубування з гуарової смоли або камеді ріжкового дерева. Одержаний в результаті гідролізат використовують в харчовій та пивоварній промисловості як текстуруючі компоненти та для фармацевтичного застосування. Виробництво цукрів: Ферменти мананази, описані в представленому винаході є зокрема корисними для виробництва цукрі або олігосахаридів з рослинної сировини, що містить поліманози, такої як ядро кокосового горіха, кокосовий горіх, конжек, смола ріжкового дерева, гуарова камедь та соєві боби. Переважною є рослинна сировина, така яку мука з ядер кокосового горіха, експеллєри ядер кокосового горіха, мука з копри, драже з копри та стручки соєвих бобів. В особливо переважному втіленні ферменти мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, застосовують для виробництва манози та мано полімерів, таких як манобіоза, манотріоза, манотетраоза, манопентаоза, маногексаоза, маногептаоза, манооктаоза, манононаоза та вищі полімери манози та/або їх похідні. Крім того, переважними є галактозил їх маноолігосахаридів з різними співвідношеннями між галактозою та манозою в межах від 1 до 0.05. В наступному переважному втіленні за представленим винаходом цукри складаються з манози та глюкози та є такими, що відносяться до галактомананаз. Дані поліоли можуть складатися з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше мономерів манози та/або глюкози з вмістом манози 1/15, 1/14, 1/13, 1/12, 1/11, 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3, 1/2, 1, 2/3, 3/4, 3/5, 4/5, 5/6, 2/7, 3/7, 4/7, 5/7, 6/7, 3/8, 5/8, 7/8, 2/9, 4/9, 3/10, 2/11, 4/11, 3/12, 2/13 або 1/14. Крім того, зокрема, переважними є галактозил їх глюкоманоолігосахаридів з різними співвідношеннями між галактозою та манозою в діапазоні від 1 до 0,05. В наступному переважному втіленні за представленим винаходом мананазу застосовують в поєднанні з іншими вуглеводами, такими як глюканаза, та/або ксиланаза, та/або альфагалактозидаза, та/або целюлаза, для гідролізу рослинної сировини з метою утворення цукрів. В більш переважному втіленні за представленим винаходом гідроліз поліманози, що міститься в рослинній сировині, призводить до утворення цукрів, що демонструють пребіотичну функціональність. Дані цукри утворюються для сприяння росту пробіотиків, бактерій, що є відомими для підтримки здорової імунної системи. Прикладами таких бактерій є біфідобактерії. Відомими біфідобактеріями є B. adolescensis, B. angulatum, B. animalis, B. asteroides, B. bifidum, B. bifidum, B. boum, B. breve, B. catenulatum, B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. infantis, B. longum, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. scardovii, B. subtile, B. thermacidophilum та B. thermophilum. Екстракція кави: Ферменти мананази, описані відповідно до представленого розкриття винаходу, є корисними для гідролізу галактоманану, який є присутнім в рідких екстрактах кави. В переважному втіленні за винаходом мананазу застосовують для інгібування утворення гелів, так як це відбувається під час сушки при заморожуванні рідких екстрактів кави. Зниження в'язкості екстракту знижує споживання енергії протягом сушіння. В ще більш переважному втіленні за винаходом ферменти мананази застосовують в імобілізованій формі, яка знижує споживання ферменту та попереджує контамінацію кавового екстракту. 18 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В даному контексті, інше застосування, що викликало зацікавленість, є використанням ферментів мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, для виробництва манози або маноолігосахаридів з кавових відходів, для того, щоб одержати більш високо корисні продукти. Як описано раніше, мананаза вивільняє манозу або олігосахариди з кавових відходів, які є високо корисними функціональними компонентами продуктів харчування та кормів. В промисловості кавових напоїв, використану кавову гущу, в основному, використовують як паливо або оброблену як промислові відходи). Смажена кава містить 1,8-4,4 % манану. Таким чином, використана кавова гуща містить велику кількість β-манану, який може бути перетворений в маноолігосахариди шляхом ферментного гідролізу. Маноолігосахариди одержані з кавового манану, як вже згадувалось, знижують рівні ліпідів в сироватці в людей (Jpn J food eng 6 (2005). Корм для тварин: Деякі непоживні фактори обмежують застосування конкретного рослинного матеріалу в приготуванні кормів для тварин та продуктів харчування для людей. Рослинні матеріали, що містять олігоманани, такі як манан, галактоманан, глюкоманан та галактоглюкоманан, описані для зниження лекготравності та абсорбції поживних сполук, таких як мінерали, вітаміни, цукри та жири, у тварин. Негативні ефекти, зокрема, є завдяки високій в'язкості манополімерів та здатності манополімерів абсорбувати поживні сполуки. Дані ефекти можуть бути усунені/зменшенні за рахунок застосування ферментів, що розщеплюють манополімери, так звані ферменти мананази, які потім допускають набагато більшу пропорцію манополімеру, що міститься в дешевому рослинному матеріалі в кормі та у такий спосіб знижують вартість. До того ж, за рахунок активності ферментів мананази манополімери руйнуються до моносахаридів, які можуть легко засвоюватися та забезпечувати додаткову енергію. З метою застосування ферменту як ефективної кормової добавки, наприклад, для моношлункових тварин, таких як свійська птиця або свині, він повинен бути стабільним в шлунку. Це означає, що він повинен бути стабільним при низьких pH (приблизно pH 2-3) та додатково він повинен бути резистентним щодо пепсину при даних низьких pH. Більш того, такі ферменти повинні бути активними при низьких pH (приблизно pH 3,0), щоб бути ефективними у шлунку. Ферменти мананази, передбачені в представленому розкритті винаходу, задовольняють всі дані критерії на відміну від інших ферментів мананази, як наприклад, немутантного типу мананаза з Trichoderma reesei, яка не є стабільною при низьких pH, зокрема нестабільна проти пепсину при низьких pH. Тому, ферменти мананази, передбачені в представленому розкритті винаходу, є особливо добре прийнятними для кормового застосування, в якому фермент повинен бути активним в тварині. Ферменти мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, є корисними як добавки до кормів для моношлункових тварин, таких як свійська птиця та свині, а також до продуктів харчування для людей. Корм, однак, крім того, може передбачатись для качок, гусей, а також великої рогатої худоби, собак, кіз, коней, котячих, а також ракоподібних та риби. Крім того, ферменти мананази можуть застосовувати для попередньої обробки кормів, замість додавання їх до кормів. В переважному втіленні винаходу ферменти мананази додають до корму для відлучених поросят, маленьких поросят, поросят, свиней, що відгодовують, свиней, що ростуть, свиней на завершальній стадії відкорму, курей-несучок, курчат бройлерів, індичок. В наступному переважному втіленні винаходу ферменти мананази є добавками до корму, що складається з рослинного матеріалу, такого як ядро кокосового горіха, кокосовий горіх, конжек, смола ріжкового дерева, гуарова камедь, соєві боби, ячмінь, овес, льон, пшениця, кукурудза, лляне насіння, цитрусова целюлоза, бавовник, арахіс, рапс, соняшник, горох, люпин та вітамінів, а також мінерали. В ще більш переважному втіленні винаходу ферменти мананази є добавками до корму, зокрема, що складається з муки з ядер кокосового горіха, експеллєрів ядер кокосового горіха, муки з копри, драже з копри та/або стручків соєвих бобів. В наступному переважному втіленні винаходу ферменти мананази застосовують в поєднанні з іншими ферментами, вибраними з групи, що складається з, але не обмежується цим, фітаз, альфа-галактозидаз, бета-галактозидаз, пектіназ, ксиланаз, арабіноксиланаз, протеаз, бета-глюканаз, целюлаз, галактаназ, ендоглюканаз, ксилозидаз, кутіназ, ліпаз та/або фосфоліпази, для виробництва кормів. Ферменти мананази з або без додаткових ферментів, крім того, можуть застосовувати в поєднанні з мінералами, вітамінами та іншими кормовими добавками. В зв'язку з тим, що ферменти мананази відповідно до представленого розкриття винаходу є термічно стабільними ферментами, їх можуть піддавати нагріванню без значної втрати активності. Тому, ферменти мананази можуть застосовувати в процесах виробництва 19 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гранульованих кормів, в яких нагрівання використовують при змішуванні кормів перед стадією гранулювання, так як це реалізовано в більшості комерційних грануляторах. Фермент мананази можуть додавати до інших інгредієнтів кормів заздалегідь до стадії грануляції або після стадії грануляції у вже сформовані гранули корму. В наступному переважному втіленні представленого розкриття винаходу ферменти мананази застосовують в кормах для тварин, яким годують тварин особливо в умовах, коли є бажаною відсутність антибіотиків. В переважному втіленні ферменти мананази застосовують в кормі для тварин, зокрема, що містить муку з ядер кокосового горіха, експеллєри ядер кокосового горіха, муку з копри, драже з копри та/або стручків соєвих бобів. В найбільш переважному втіленні ферменти мананази застосовують в кормі для тварин для курчат бройлерів, який, зокрема, складається з муки з ядер кокосового горіха, експеллєрів ядер кокосового горіха, муки з копри, драже з копри та/або стручків соєвих бобів. Паперово-целюлозна промисловість: Ферменти мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, є корисним в сприянні ферментного відбілювання паперової маси, такої як хімічна целюлозна маса, напівхімічна целюлозна маса, крафт целюлозна маса, механічна целюлозна маса або целюлозна маса, виготовленої сульфітним способом. Целюлозна маса, крім того, може бути повністю відбіленою целюлозною масою вільною без використання хлору, а використовуючи кисень, озон, перекис пероксикислоти. В переважному втіленні представленого розкриття винаходу ферменти мананази застосовують для посиленого ферментного відбілювання целюлозної маси, одержаної способами модифікування або безперервного варіння, які демонструють низький вміст лігніну. В наступному переважному втіленні представленого розкриття винаходу ферменти мананази в таких застосуваннях можуть або використовуватися самостійно, або переважно в поєднанні з ферментами ксиланази, та/або ендоглюканази, та/або альфа-галактозидази, та/або целобіогідролази. Відбілюючий та/або розшліхтовуючий агент в текстильному виробництві: Ферменти мананази відповідно до представленого розкриття винаходу є також придатними для відбілювання небавовняних целюлозних волокон, пряжі або тканини, що містять льон, джут, рамі, або льняне полотно шляхом інкубування волокна, пряжі або тканини з мананазою, відповідно до представленого розкриття винаходу, протягом заданого періоду часу та за умов прийнятних для проведення відбілювання волокна, пряжі або тканині. Розщеплення геміцелюлози покращує процес відбілювання тканини. В текстильному друці, в якому використовують друкарську пасту, що містить барвник та біологічний полімер (наприклад, гуарову смолу), як згущувач, видалення загусника та надлишку барвника набагато більш ефективно проводити, використовуючи прання друкованого текстилю в присутності мананази. Ферментативне розщеплення загусника зменшує час обробки, а також кількість енергії та води, необхідних для досягнення задовільної якості текстилю. Ферменти мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, є придатними для розшліхтовки тканин, вироблених з, наприклад, синтетичних волокон, в яких часто як розмірні агенти використовують галактоманнани, такі як гуарова смола або камедь ріжкового дерева. Стимуляція гідравлічного розриву пласта на нафтових та газових свердловинах: Ферменти мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, є придатними в способі гідравлічного розриву пласта, який використовують для стимуляції на нафтових та газових свердловинах. В даному документі, ферменти мананази діють як зріджені агенти в гідравлічній рідині, який ґрунтується на тому, що вона входить до складу манополімеру та зазвичай містить пісок. Якщо ферменти мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, є термічно стабільними ферментами, їх переважно застосовують для гідравлічного розриву, що проводять при високих температурах. В іншому переважному втіленні представленого розкриття винаходу зріджуюча активність ферментів мананази в застосуванні гідравлічного розриву контролюють (інгібують або сприяють) за умов навколишнього середовища, таких як pH та температура. Миючі засоби: Ферменти мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, можуть застосовувати в композиціях миючих засобів, для того, щоб полегшити видалення манополімеру, що міститься в плямах/забрудненнях. В переважному втіленні представленого розкриття винаходу ферменти мананази застосовують в композиціях миючих засобів в поєднанні з іншими ферментами з групи амілаз, целюлаз, ліпаз, пектиназ, протеаз та ендоглюканаз. 20 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Видалення біоплівки: Ферменти мананазі, описані в представленому розкритті винаходу є придатними для видалення біоплівок, що містять манополімер. Переважно, для такого застосування ферменти мананазі використовують в поєднанні з миючими засобами та/або іншими ферментами з групи альфа-галактозидаз, пектіназ, ксиланаз, арабіноксиланаз, протеаз, бета-глюканаз, целюлоз, галактананаз, ендоглюканаз, ксилозидаз, кутіназ та ліпаз. Системи доставки: Ферменти мананази, відповідно до представленого розкриття винаходу, можуть застосовувати для цільової та/або час-залежної доставки речовини. Це досягається шляхом використання систем, що ґрунтуються на гелях манополімерів, які містять та транспортують речовину. Функція ферменту мананаза в такій системі полягає в контролюванні вивільнення речовини з гелю шляхом часткового або повного розщеплення, за рахунок конкретної зміни в оточуючому середовищі гелю, наприклад, pH та/або температури, що активують ферменти мананази. В переважному втіленні представленого розкриття винаходу ферменти мананази застосовують для цільової доставки лікарського засобу в фармацевтичних застосуваннях. Відновлювані ресурси, тобто субстрати біомаси, які вирощують та збирають, такі як сільськогосподарські культури, солома, деревина та деревопродукти, одержують все більшу та більшу увагу, так як вони є прийнятними субстратами для виробництва біологічних видів палива, тобто твердого, рідкого, або газоподібного палива, такого як біодизель, біогаз, рослинне масло, біоетанол, біобутанол, біоводень, біо-диметиловий ефір, біометанол, BTL ("біомаса в рідину") палива, GTL ("газ в рідину") палива, тощо. В біологічних видах палива 1-го покоління зазначені рослини перетворювали, використовуючи встановлені способи з харчової промисловості, тобто їх вижимали з метою одержати рослинну олію, або крохмаль, що міститься в зерні, перетворювали на цукор та далі ферментували дріжджами для отримання біоетанолу. Це означає, що запас енергії (тобто жир та/або крохмаль) зазначених рослин використовували безпосередньо. Це призвело до поганих виходів енергії, або поганих кількостей виробництва біопалива на акр. В біологічних видах палива 2-го покоління, використовують не тільки резерв енергії зазначених рослин, але й підхід, що має на меті використовувати повну біомасу рослин. В даному контексті, мананазу відповідно до винаходу можуть застосовувати для перетворення рослинної біомаси, що містить геміцелюлозу, в цукри, які можуть метаболізувати під дією конкретних дріжджів (наприклад, Saccharomyces sp.) або штамів бактерй та інших мікроорганізмів з метою одержання продуктів ферментації. Дані продукти ферментації можуть бути паливом, таким як біоетанол, біобутанол, але, крім того, можуть бути білдінг-блоковими молекулами, такими як 3-гідроксипропіонова кислота, аспарагінова кислота, ксиліт та глюконова кислота. Для більшого одержання білдінг-блокових молекул, які можуть бути похідними цукрів, дивись (Werpy and Petersen (2004) Top Value Added Chemicals from Biomass: Volume 1—Results of Screening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas. National Renewable Energy Laboratory Report NREL/TP-510-35523, figure 3 and table 8). Інші потенціальні застосування включають каталітичну обробку продуктів, які одержували з відновлювальних ресурсів за допомогою мананаз відповідно до винаходу. Це включає обробку глюкози та/або фруктози, обох одержаних за допомогою мананази відповідно до винаходу, в 2,5-диметилфурані гетероциклічною сполукою, яка, як вважається, має набагато кращі властивості пального, ніж біоетанол, так як вона має на 40 % більше питомої енергії, та є хімічно стабільною та нерозчинною у воді. Зазначені підходи зображують великі вигоди від покращених властивостей мананаз відповідно до винаходу, зокрема, від підвищеної стабільності до нагрівання. Це означає, що відповідні перетворення біомаси в цукор може відбуватися в умовах високих температур, що прискорює відповідні процеси і, тим самим, робить їх економічно більш ефективним. В недавніх експериментах для живлення дріжджів винахідники використовували субстрати експеллєра ядер кокосового горіха (PKE) (Saccharomyces cerevisiae). Згадані субстрати містять близько 37 % галактоманану. Виявилося, що PKE обробка двома мананазами відповідно до винаходу (тобто, модифікація B, модифікація C та/або модифікація 31) призводить до вивільнення великої кількості цукрів, та, тим самим, призводить до покращення росту дріжджів в порівнянні з необробленим PKE. Це є явною вказівкою на вищезгадане твердження, тобто, мананази відповідно до винаходу можуть бути корисним інструментом в підвищенні виходу в, наприклад, виробництві біоетанолу з відновлювальних ресурсів (дивись приклад 19 в WO 2008/009673). Всі згадані застосування мананаз відповідно до винаходу мають загальне, що дані підходи зображують суттєві переваги від покращення властивостей мананази відповідно до винаходу, 21 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 особливо в умовах підвищеної термічної стабільності та підвищеної резистентності щодо низьких значень pH та ферментів протеази. В основному, завдяки тому факту, що більшість зі згаданих застосувань відбуваються в оточуючому середовищі з несприятливими умовами, такими як в шлунково-кишковому тракті ссавців, де переважають низькі значення pH, або при підвищених температурах, які використовують для прискорення, полегшення та економічноїоптимізації процесів гідролізу, таких як перетворення відновлювальних ресурсів в цукри, як описано вище. Наступні способи та приклади пропонуються тільки для ілюстрації та, в будь-якому випадку, не призначені для обмеження обсягу представленого розкриття винаходу. Методи і приклади. В наступних прикладах, матеріалах та способах даного розкриття забезпечується включення визначення каталітичних властивостей ферментів, що були одержані даним способом. Слід зрозуміти, що дані приклади наведені лише для ілюстративної мети та не можуть бути інтерпретовані як обмежувальні для даного розкриття винаходу будь-яким способом. Всі публікації, патенти та патентні заявки, що цитовані в даному документі є включеними шляхом посилання в усій їх повноті для всіх цілей Приклад 1: Очистка ферментів мананази за допомогою His-мітки Очистка ферментів мананази без вуглеводневого домену зв'язування (CBD) була здійснена з використанням 6xHis-мітки C-термінально злиття з ферментами мананази. S. saccharomyces, трансформовані плазмідою, що кодує 6xHis-мічену мананазу, були культивовані в склянках для струшування при 30 °C протягом 72 годин в SC-галактозному культуральному середовищі. Клітини з 2 літрів культурального середовища видаляли центригуванням та супернатант піддавали 40-кратному концентруванню способом ультрафільтрації, використовуючи 5 кДа відсікаючу мембрану. Концентрат згодом діафільтрували з тим самим відсіканням для обміну буферу (50 мМ NaH 2PO4, 300 мМ NaCl, pH 5,0) та концентруванням до кінцевого об'єму 1/40 від культурального об'єму. Концентрат фільтрували через фільтр 0,45 мкм та pH регулювали до 8,0 безпосередньо перед загрузкою в метал-афінну колонку (BD-Talon, BD-Bioscience). Колонку промивали декількома об'ємами шару діафільтраційного буфера з pH 8,0. Мананазу елюювали з градієнтом від 0 % до 100 % буферу B, де буфер B містить 50 мМ NaH 2PO4, 300 мМ NaCl та 250 мМ імідазолу при pH 6,0. Елюйовані зразки протеїнів аналізували, використовуючи SDS PAGE. Фракції, що містили мананазу об'єднували та діалізували проти буфера, що містить 50 мМ NaOAc, pH 5.0. Чистоту зразків мананази контролювали хроматографією з оберненою фазою, використовуючи поглинання на 280 нм для виявлення протеїну. Приклад 2: Очистка ферментів мананази C-термінальним CBD Очистку ферментів мананази C-термінальним CBD виконували, використовуючи аніон обмінну та гідрофобну хроматографію взаємодії. Детально, S. saccharomyces, трансформовану з плазмі дою, що кодує відповідний фермент мананази, був культивований в склянках для струшування при 30 °C протягом 72 годин в SC-галактозному культуральному середовищі. Клітини з 5 літрів культурального середовища видаляли центрифугуванням та супернатант піддавали концентруванню та буферному обміну (буфер A: 20 мМ Тріс(гідроксиметил)амінометан, pH 8,6) за допомогою ультрафільтрації, використовуючи 10 кДа відсікаючу мембрану. В кінці кінців утворилося 200 мл концентрату мананази в буфері A. Розчин загружали в 6,3 мл TSKgel SuperQ-5PW(30) колонку (Tosoh Bioscience) урівноважену буфером A. Колонку промивали декількома об'ємами колонки буферу A. Згодом фермент мананази елюювали з лінійним градієнтом від 0 до 100 % буферу B (20 мМ Тріс(гідроксиметил)амінометан, pH 8,6, 1M NaCl) понад 120 мл. Елюйовані зразки протеїнів аналізували, використовуючи SDS PAGE. Фракції, що містили мананазу об'єднували, розбавляли 1:1 3M розчином амонію сульфату та загружали в урівноважену (буфер C: 50 мМ NaOAc, pH 5,0, 1,5M амонію сульфат) 8,8 мл TSK Gel Phenyl-5PW (20) колонку (Tosoh Bioscience). Колонку промивали буфером C. Елюювання мананази виконували лінійним градієнтом від 0 до 100 % буферу D (50 мМ NaOAc, pH 5,0) понад 100 мл. Елюйовані зразки протеїнів аналізували, використовуючи SDS PAGE., що містили мананазу об'єднували та діалізували проти буферу D. Чистоту зразків мананази контролювали хроматографією з оберненою фазою, використовуючи поглинання на 280 нм для виявлення протеїну. Приклад 3: Утворення та характеризування модифікацій мананази. Модифікації мананази створювали, використовуючи різні методи мутагенезу ДНК, що кодує протеїни мананази, такі як касетний або PCR мутагенези, або інші методи мутагенезу, добре відомі з рівня техніки. Дані методи включають такі методи як розкрито в Morinaga et al., Biotechnology 2:646-649 (1984) та в Nelson and Long, Analytical Biochemistry 180:147-151(1989); 22 UA 107212 C2 5 10 15 20 25 30 35 або протоколах Error Threshold Mutagenesis, описаних в WO 92/18645. Для мутагенного PCR в Cadwell and Joyce, PCR Methods Appl. 3:136-140(1994) розкрито інший прийнятний метод. Модифікації мананази гетерологічно експресували в одному або більше з наступних господарів експресії: Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis and Escherichia coli. Приклад 4: Визначення температурної стабільності Температурну стабільність модифікацій мананази характеризують, використовуючи їх температури інактивації. Температури інактивації визначали вимірюванням залишкової активності ферментів мананази після інкубування при різних температурах. Залишкові активності визначали вимірюванням активностей мананази з та без попередньої температурної стимуляції зразків мананази. Більш детально, зразки мананази інкубували в 50 мМ NaOAc буфері, pH 5,0 та 0,025 % Triton-X-100 протягом 45 хвилин при різних температурах. Потім визначали активності мананази, використовуючи AZCL-галактоманан (carob, Megazyme) як субстрат. Для даних зразків мананази та ферменту мананази калібраційні серії (очищена мананаза відповідно до Seq. ID No 3 з C-термінальною 6xHis-міткою) інкубували з 1 мг/мл AZCLгалактоманану, 50 мМ NaOAc, pH 5,0 та 0,1 % Triton-X-100 протягом 60 хвилин при 37 °C. Супернатанти з аналізу AZCL-галактоманану потім переносили в 96-лунковий мікро-титрований планшет та визначали поглинання на 590 нм в стандартному планшетному рідері. За даними поглинання ферменту мананази калібраційної серії будували графік залежності від концентрації ферменту. Активності інших зразків мананази розраховували, використовуючи рівняння, які були виведені, використовуючи відповідні криві за точками даних щодо ферменту мананази стандартних серій. Тому, активності зразків мананази виражали як еквіваленти активності ферменту мананази калібраційної серії. Температури інактивації ферменту мананази визначали як температури, при яких залишкова активність мананази становить 50 % порівняно із залишковою активністю тієї ж мананази після інкубування за тих самих умов, але при кімнатній температурі. Відповідні екстраполяції та інтерполяції даних активності зроблено для того, щоб визначити температуру, що відповідає 50 % залишкової активності. Різниці в температурній стабільності (TD) в [°C] були розраховані шляхом віднімання температур інактивації двох ферментів однієї від іншої. Таблиця 3: Різниці в температурній стабільності (TD) в [°C] для модифікацій мананази. Представлені модифікації основані на послідовності Seq. ID No 3 та C-термінально несуть або 6xHis-мітку або вуглеводний домен зв'язування (CBD, Seq. ID No 10, ФІГ. 11). Представлені заміщення вводили в Seq. ID No 3. Різниці в температурній стабільності (TD) визначають як (температура інактивації модифікації) – (температура інактивації послідовності Seq. ID No 3) як модифікацією, так і ферментом з Seq. ID No 3, що має ідентичну C-термінальну мітку. Фермент з Seq. ID No 3, що несе C-термінальний CBD, демонструє температуру інактивації 74,6 °C. Фермент з Seq. ID No3, що несе C-термінальну 6xHis-мітку, демонструє температуру інактивації 75,7 °C. C-термінальна мітка 8,6 6xHis 8,5 6xHis 8,4 6xHis 8,2 6xHis 8,0 6xHis 7,9 6xHis 7,9 6xHis 23 9,0 6xHis 40 9,3 6xHis F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T /Q259R/Q280S/N331S F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T /Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T /Q259R/Q280S/N282D/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280L S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T /Q259R F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H /V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D TD / [°C] 6xHis Модифікація 7,8 UA 107212 C2 C-термінальна мітка 7,6 6xHis 7,3 6xHis 7,3 6xHis 7,2 6xHis 7,1 6xHis 7,0 6xHis 6,9 6xHis 6,8 6xHis 6,8 6xHis 6,7 6xHis 6,7 6xHis 6,5 6xHis 6,4 6xHis 6,3 6xHis 6,2 6xHis 5,9 6xHis 5,9 6xHis 5,3 6xHis 5,2 6xHis 5,0 6xHis 5,0 6xHis 4,7 6xHis 4,7 6xHis 4,6 6xHis 4,6 6xHis 6xHis 4,4 4,4 6xHis 24 7,7 6xHis F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H /V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H /V181H/A215T/Q259R/Q280L F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T /Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H /V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280L/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q /N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D F31Y/S66P/N173H/V181H/A215T /Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280L S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173T /V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173T/V181H /A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280S/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T /Q259R/Q280S/N282D S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A /A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T /Q259R/Q280L/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T /Q259R/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H /V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H /A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181A/A215T /Q259R F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H /V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T /Q259R S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T /Q259R/N331S F31Y/S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T /Q259R/Q280L F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H /A215T/Q259R/Q280L F31Y/S66P/Q97R/K146Q/V181H/A215T /Q259R/Q280R/N282D S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/V181H/A215T/Q259R/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R /Q280S/N331S TD / [°C] 6xHis Модифікація 4,2 UA 107212 C2 C-термінальна мітка 5 10 15 4,1 6xHis 4,0 6xHis 3,9 6xHis 3,8 6xHis 3,8 6xHis 3,7 6xHis 3,6 6xHis 3,2 6xHis 3,2 6xHis 3,1 CBD 8,0 CBD 6,9 CBD 6,8 CBD 6,7 CBD 6,4 CBD 6,4 CBD 6,3 CBD 5,7 CBD 5,2 CBD 5,2 CBD 5,1 CBD 4,3 CBD F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280S/N331S S66P/V181H/A215T/Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H /A215T/Q259R/Q280L/N331S S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T /Q259R/N282D S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R /N282D S66P/V181H/A215T/Q259R S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R /Q280R/N282D F31Y/S66P/N173T/V181H/A215T/Q259R /N282D S66P/A215T/Q259R F31Y/S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R /Q280R/N344D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R /Q280S S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T /Q259R S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T /Q259R/Q280S S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R /Q280S/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T /Q259R/Q280R/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T /Q259R/N331S F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T /Q259R/Q280S/N282D/N331S S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R /Q280S/N331S S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T /Q259R/Q280S/N331S F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280S/N331S TD / [°C] 6xHis Модифікація 4,0 Приклад 5: Специфічна активність Специфічну активність ферментів мананази визначають, використовуючи очищені ферменти відповідно до прикладів 1 та 2. Активність мананази визначали як виділення редукуючи цукрів з галактоманану. Протеїн мананази визначали за допомогою оптичної густини (OD), що вимірюють на 280 нм. Детально, очищені зразки мананази розбавляли 50 мМ розчином NaOAc, pH 5,0. Розчин галактоманану рожкового дерева (низької в'язкості, Megazyme) додавали, щоб одержати кінцеві концентрації 0,7 % (мас./об.) галактоманану, 50 мМ NaOAc, pH 5,0 та приблизно 10 мкг/мл протеїну мананази. Розчини інкубували протягом 16 годин при 37 °C. Потім визначали кількість редукую чого цукру як наведено далі. Одну частину зразку галактоманану або визначені розчини манози змішували з однією частиною розчину, що містить 1 % (мас./об.) динітросаліцилової кислоти (DNSA), 30 % (мас./об.) калію натрію тартрату та 0,4 M NaOH. Суміш інкубували протягом 10 хвилин при 99 °C та 5 хвилин при 4 °C. Остаточно 25 UA 107212 C2 5 10 15 20 поглинання вимірювали на 540 нм. Еквіваленти редукуючого цукру (як еквіваленти манози) розраховували за графіком даних поглинання для стандартних зразків манози по відношенню до концентрації манози. Кількість еквівалентів редукую чого цукру для зразків розраховували, використовуючи рівняння, що виводили з відповідних кривих за точками з даних для стандартних зразків манози. Концентрації мананази розраховували з даних оптичної густини препаратів на 280 нм та відповідного коефіцієнту екстинції для кожної модифікації мананази. Коефіцієнти екстинції розраховували на основі амінокислотної композиції протеїнів відповідно до способу, передбаченого Gill and von Hippel, Analytical Biochemistry 182:319-326 (1989). Специфічну активність ферментів мананази відповідно до представленого розкриття винаходу виражають в нкат на мг протеїну мананази в субстраті галактоманану рожкового дерева, як описано вище. Активність одного нкат визначають як виділення одного наномолю редукуючи цукрів на секунду. Таблиця 4: Специфічна активність модифікацій мананази. Представлені модифікації основані на Seq. ID No 3 та несуть C-термінально або 6xHis-мітку або вуглеводний домен зв'язування (CBD, Seq. ID No 10). Представлені заміщення вводили в Seq. ID No 3. Значення специфічної активності визначали як (специфічна активність модифікації) / (специфічну активність референтного зразку). Референтним зразком в даному випадку є мананаза з Seq. ID No 3 з тою самою C-термінальною міткою, як та, що присутня і відповідній модифікації. Посилання з C-термінальною 6xHis-міткою має специфічну активність 1228 нкат/мг та посилання з C-термінальним CBD має специфічну активність 535 нкат/мг. Модифікація F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280R/N282D S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T /Q259R S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T /Q259R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T /Q259R/Q280R/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T /Q259R/Q280S/N282D/N331S F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H /A215T/Q259R/Q280S/N331S 25 30 35 40 C-термінальна мітка Специфічна активність [% референтного] Специфічна активність [нкат/мг] 6xHis 107 1064 6xHis 119 1184 6xHis 173 1529 6xHis 167 1482 CBD 144 872 CBD 112 679 CBD 212 1008 CBD 141 756 CBD 149 813 Приклад 6: Стабільність при низькому pH / щодо пепсину Для визначення стабільності при низькому pH / щодо пепсину ферменти мананази, S. saccharomyces, трансформовані з плазмідом, що є кодуючим для відповідного ферменту мананази, культивували в склянках для струшування при 30 °C протягом 72 годин в SCгалактозному культуральному середовищі. Клітини видаляли центрифугуванням та супернатант відокремлювали та концентрували, наприклад, 10-кратно шляхом ультрафільтрації, використовуючи 10 кДа відсікаючі мембрани. Концентрований супернатант розбавляли, наприклад, 10-кратно автоклавованим розчином, що містить 30 г/л картопляної сокової води, 30 г/л рідкого кукурудзяного екстракту, 5 г/л амонію сульфату, 15 г/л KH 2PO4, 10 г/л локусту бобової смоли та 20 г/л целюлози (Avicell). Розбавлені зразки мананази змішували 1:1 зі зразком пепсину (200 мМ гліцин-HCl, pH 1,5; 5мг/мл песин-попередньо-розщеплений BSA, 2 мМ CaCl2 та 0,5 мг/мл пепсину) та інкубували протягом 2 годин при 37 °C. pH суміші становив pH 2,45. На додаток створювали контрольний зразок. Для даних такі ж самі зразки мананази змішували 1:1 з контрольним зразком (100 мМ NaOAc, pH 5,2, 5 мг/мл песин-попередньо-розщеплений BSA та 2 мМ CaCl2) та інкубували протягом 2 годин при 37 °C. pH суміші становив pH 5,2. Для визначення активності мананази, 1 частину зазначених вище сумішей або ферменту мананази калібраційної серії (очищена мананаза відповідно до Seq. ID No 3 з C-термінальною 6xHis-міткою) змішували з 14 частинами зразку AZCL-галактоманану (200 мМ NaOAc, pH 5,0, 26 UA 107212 C2 5 10 15 0,1 % Triton-X-100, 1 % AZCL-галактоманану ріжкового дерева (Megazyme)) та інкубували протягом 60 хвилин при 37 °C. Зразки центрифугували та супернатант аналізували за поглинанням на 590 нм. За даними поглинання ферменту мананази калібраційної серії будували графік по відношенню до концентрації ферменту. Активності інших зразків мананази розраховували, використовуючи рівняння, які виводять з відповідної кривої за точками даних для ферменту мананази калібраційної серії. Таким чином, активності зразків мананази виражали як активності еквівалентів ферменту мананази калібраційної серії. Залишкові активності ферментів мананази розраховували за наступним співвідношенням: (Активність мананази після інкубування з пепсиновим зразком) / (активність мананази після інкубування з контрольним зрпазком). Таблиця 5: Стабільність при низькиз pH / щодо пепсину модифікацій мананази. Представлені модифікації на основі Seq. ID No 3 та несуть C-термінальний вуглеводний домен зв'язування (CBD, Seq. ID No 10). Представлені заміщення вводили в Seq. ID No 3. Мананаза посилання відповідно до Seq. ID No 1 з C-термінальним CBD демонструє залишкову активність 39 %. C-термінальна мітка 20 25 30 96 CBD 74 CBD 68 CBD 75 CBD F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T /Q259R/Q280R/N282D F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R /Q280R/N282D S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R /Q280S/N282D/N331S F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T /Q259 R/Q280S/N331S pH/пепсин стабіль-ність / [% залишкова активність] CBD Модифікація 63 Приклад 7: Порівняння Trichoderma reesei мананази та модифікації S3R Температурна стабільність та продукування манози з Trichoderma reesei мананази як показано в SEQ ID NO:1 порівнювали з модифікацією мананази, похідною з SEQ ID NO:1 за допомогою введення заміщення S3R (серин на аргінін в положенні 3). Експеримент та результати детально описані в WO 2008/009673 (приклад 8, p.100-101; ФІГ. 1B) та на ФІГ. 10. Прелік послідовностей, вільний текст SEQ ID NO 1: фрагмент не мутантного типу Trichoderma reesei мананази / амінокислоти SEQ ID NO 2: модифікація мананази V-31, розкрита в WO 2008/009673 / амінокислота SEQ ID NO 3: модифікація мананази V-31/S3R, розкрита в WO 2008/009673 / амінокислота SEQ ID NO 4: модифікація мананази TM-1 / амінокислота SEQ ID NO 5: модифікація мананази TM-1 / DNA SEQ ID NO 6: мананаза TM-100 / амінокислота SEQ ID NO 7: модифікація мананази TM-108 / амінокислота SEQ ID NO 8: модифікація мананази TM-CBD-148 / амінокислота SEQ ID NO 9: модифікація мананази TM-144 / амінокислота SEQ ID NO 9: CBD / амінокислота. ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 35 БАСФ СЕ Нові модифікації мананази 40 US61294684 US 61/294684 2010-01-13 45 10 PatentIn версія 3.3 27 UA 107212 C2 5 1 352 PRT Trichoderma reesei 1 10 15 20 25 30 35 40 45 Ala Ser Ser Phe Val Thr Ile Ser Gly Thr Gln Phe Asn Ile Asp Gly 1 5 10 15 Lys Val Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Cys Tyr Trp Cys Ser Phe Leu 20 25 30 Thr Asn His Ala Asp Val Asp Ser Thr Phe Ser His Ile Ser Ser Ser 35 40 45 Gly Leu Lys Val Val Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Asn Thr Gln 50 55 60 Pro Ser Pro Gly Gln Ile Trp Phe Gln Lys Leu Ser Ala Thr Gly Ser 65 70 75 80 Thr Ile Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gln Thr Leu Asp Tyr Val Val 85 90 95 Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Leu Lys Leu Ile Ile Pro Phe Val Asn 100 105 110 Asn Trp Ser Asp Tyr Gly Gly Ile Asn Ala Tyr Val Asn Ala Phe Gly 115 120 125 Gly Asn Ala Thr Thr Trp Tyr Thr Asn Thr Ala Ala Gln Thr Gln Tyr 130 135 140 Arg Lys Tyr Val Gln Ala Val Val Ser Arg Tyr Ala Asn Ser Thr Ala 145 150 155 160 Ile Phe Ala Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro Arg Cys Asn Gly Cys Ser 165 170 175 Thr Asp Val Ile Val Gln Trp Ala Thr Ser Val Ser Gln Tyr Val Lys 180 185 190 Ser Leu Asp Ser Asn His Leu Val Thr Leu Gly Asp Glu Gly Leu Gly 195 200 205 Leu Ser Thr Gly Asp Gly Ala Tyr Pro Tyr Thr Tyr Gly Glu Gly Thr 210 215 220 Asp Phe Ala Lys Asn Val Gln Ile Lys Ser Leu Asp Phe Gly Thr Phe 225 230 235 240 His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Asn Tyr Thr Trp Gly Asn Gly 245 250 255 Trp Ile Gln Thr His Ala Ala Ala Cys Leu Ala Ala Gly Lys Pro Cys 260 265 270 Val Phe Glu Glu Tyr Gly Ala Gln Gln Asn Pro Cys Thr Asn Glu Ala 275 280 285 Pro Trp Gln Thr Thr Ser Leu Thr Thr Arg Gly Met Gly Gly Asp Met 290 295 300 Phe Trp Gln Trp Gly Asp Thr Phe Ala Asn Gly Ala Gln Ser Asn Ser 305 310 315 320 50 Asp Pro Tyr Thr Val Trp Tyr Asn Ser Ser Asn Trp Gln Cys Leu Val 325 330 335 Lys Asn His Val Asp Ala Ile Asn Gly Gly Thr Thr Thr Pro Pro Pro 340 345 350 55 60 2 352 PRT Штучна 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюNovel mannanase variants
Автори англійськоюKensch, Oliver
Автори російськоюКенш Оливер
МПК / Мітки
МПК: C12N 9/42, C12N 15/00, C12N 5/00, C11D 3/386
Мітки: модифікація, мананази
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/43-107212-modifikaciya-mananazi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Модифікація мананази</a>
Модифікація поверхні
Номер патенту: 75144
Опубліковано: 15.03.2006
Автор: Данс Брюс Гай Ірвін
МПК: B23K 26/08, B23K 15/08
Мітки: поверхні, модифікація
Формула / Реферат:
1. Спосіб обробки виробу, що включає в себе приведення у відносний рух виробу і потужного променя в перетинаючому напрямі з тим, щоб піддати впливу потужного променя ряд місцеположень на виробі; і в кожному місцеположенні приведення потужного променя в рух у множині напрямів по відношенню до виробу заздалегідь заданим чином, за рахунок чого в кожному місцеположенні матеріал виробу плавлять і переміщують під дією потужного променя таким чином,...
Модифікація електроконтактного матеріалу на основі міді
Номер патенту: 107172
Опубліковано: 25.11.2014
Автори: Дьомін Андрій Юрійович, Тимофеєв Сергій Сергійович, Морозов Володимир Сергійович, Вовк Руслан Володимирович, Тимофеєва Лариса Андріївна
МПК: C22C 1/04, B22F 3/00, H01H 1/025
Мітки: міді, матеріалу, основі, електроконтактного, модифікація
Формула / Реферат:
Електроконтактний матеріал на основі міді, що містить борид титану та графіт, який відрізняється тим, що в сплав додатково введено діоксид цирконію й окис титану при таких співвідношеннях компонентів, мас. %: борид титану 0,5-5,0 графіт 1,0-2,0 діоксид цирконію 0,5-0,8 окис титану 0,1-1,0 ...
Поліморфна модифікація телмісартану та спосіб її одержання
Номер патенту: 56358
Опубліковано: 15.05.2003
Автор: ШНАЙДЕР Хайнріх
МПК: A61P 9/10, C07D 235/18, A61P 27/06, A61P 13/10, A61K 31/4184, A61P 1/04, A61P 43/00, A61P 9/04, A61P 9/12, A61P 25/28, C07D 235/20
Мітки: поліморфна, спосіб, телмісартану, модифікація, одержання
Формула / Реферат:
1. Поліморфна кристалічна модифікація В (форма В) телмісартану формули І, (І)яка відрізняється тим, що ендотермічний максимум, який проявляється при термічному аналізі методом диференційної сканувальної калориметрії (ДСК), становить 183 ± 2°С.2. Телмісартан, який відрізняється тим, що він містить форму В за п. 1.3. Спосіб отримання телмісартану за п. 1 або 2, який відрізняється тим, щоа) телмісартан...
Нова кристалічна модифікація n торасеміду
Номер патенту: 72895
Опубліковано: 16.05.2005
Автори: Клєпіч Божена, Філіч Дарко, Даніловскі Алєксандар, Фістріч Інес, Думіч Мільєнко, Орешіч Маріна, Хорват Мікулчіч Ясна
МПК: A61P 9/12, A61P 27/06, C07D 213/74, A61P 35/00, A61K 31/4409, C07D 213/53, A61P 9/10, A61P 7/02, A61K 9/20, A61P 11/06
Мітки: нова, кристалічна, торасеміду, модифікація
Формула / Реферат:
1. Нова кристалічна модифікація N торасеміду, яка відрізняється тим, що характерна рентгенограма дифракції на порошку, одержана при дифракції рентгенівських променів на її зразку у приборі PHILIPS PW3710 у Сu рентгенівських променях представлена такими інтервалами між площинами кристалічної решітки: Нова кристалічна модифікація N торасеміду ...
Генетична модифікація mon89788 сої і способи її визначення
Номер патенту: 94582
Опубліковано: 25.05.2011
Автори: Дікінсон Еллен, Райнхарт Дженніфер, Малвен Маріанне, Тейлор Ненсі
МПК: C12N 15/82, C12Q 1/68, A01H 5/00
Мітки: генетична, способи, модифікація, сої, визначення, mon89788
Формула / Реферат:
1. Послідовність нуклеїнових кислот, яка включає послідовність SEQ ID NO:1, 2, 3 або 4.2. Рослина сої або її частина, яка включає генну модифікацію MON89788, де насіння сої, що включає генну модифікацію MON89788, депоноване в ATCC під номером PTA-6708, де геном вказаної рослини включає щонайменше одну молекулу ДНК, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:21 і SEQ ID...
Попередній патент: Стабілізовані склади, які містять антитіла до рецептора інтерлейкіну 6 (il-6r)
Наступний патент: Конструкція верху взуттєвого виробу, а також взуттєвий виріб з такою конструкцією верху
Випадковий патент: Спосіб одержання багатокомпонентних борошняних сумішей і пристрій для його здійснення