Застосування антитіла до cd20 типу ii із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (adcc) у комбінації із циклофосфамідом, вінкристином та доксорубіцином для лікування неходжкінських лімфом

Реферат: Винахід належить до застосування гуманізованого антитіла В-Lyl (B-HH6-B-KV1 GE), яке має варіабельну область важкого ланцюга (VH), яка представлена в SEQ ID NO: 7, та варіабельну область легкого ланцюга (VL), яка представлена в SEQ ID NO: 20, та яке є створеним за UA 105361 C2 (12) UA 105361 C2 допомогою глікоінженерії, гуманізованим антитілом B Lyl, у якому принаймні 40 % або більше олігосахаридів в Fc-області є нефукозильованими, для приготування лікарського засобу для лікування раку, при якому відбувається експресія CD20, у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, причому лікування за допомогою антитіла до CD20 тину II здійснюють у комбінації а) з циклофосфамідом і вінкристином, б) з доксорубіцином, в) з циклофосфамідом, або г) з циклофосфамідом, вінкристином і доксорубіцином. UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 Цей винахід відноситься до застосування антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування раку, головним чином, видів раку, що експресуюють CD20, у комбінації з хіміотерапевтичним засобом, вибраним із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину. Передумови створення винаходу Молекула CD20 (яку також називають як характерний для людських B-лімфоцитів диференційовочний антиген або Bp35) представляє собою гідрофобний трансмембранний білок з молекулярною масою приблизно 35 кДа, локалізований на пре-B- та зрілих B-лімфоцитах (Valentine M.A. та ін., J. Biol. Chem. 264(19), 1989, стор. 11282-11287; та Einfield D.A. та ін., EMBO J. 7(3), 1988, стор. 711-717). CD20 виявлений на поверхні більше 90 % B-клітин із периферічної крові або лімфоїдних органів, та він експресується під час раннього розвитку преB-клітин та зберігається до диференціювання в плазматичні клітини. CD20 є присутнім на поверхні як здорових, так і злоякісних B-клітин. Зокрема, при неходжкінських лімфомах (НХЛ) CD20 експресується на поверхні більше 90 % B-клітин (Anderson K.C. та ін., Blood 63(6), 1984, стор. 1424-1433), але він не виявлений на гематопоетичних стовбурових клітинах, про-Bклітинах, здорових плазматичних клітинах або в інших здорових тканинах (Tedder T.F. та ін., J. Immunol. 135(2), 1985, стор. 973-979). Карбоксильна кінцева область білка CD20, що складається з 85 амінокислот, локалізована в цитоплазмі. Довжина цієї області відрізняється від довжини інших специфічних для поверхні Bклітин структур, таких як важкі ланцюги IgM, IgD та IgG або антигени комплексу гістосумісності класу II або β-ланцюга, які мають відносно короткі внутрішньоцитоплазматичні області, що складаються з 3, 3, 28, 15 та 16 амінокислот, відповідно (Komaromy M. та ін., NAR 11, 1983, стор. 6775-6785). Серед останніх 61 амінокислоти карбоксильного кінця 21 представляють собою кислотні залишки, а лише 2 є основними, що свідчить про те, що ця область має великий чистий негативний заряд (GenBank, реєстраційний № NP-690605). Вважається, що CD20 може брати участь у регуляції на ранній(іх) стадії(ях) процесу активації та диференціювання B-клітин (Tedder T.F. та ін., Eur. J. Immunol. 16, 1986, стор. 881-887) і може функціонувати в якості іонселективного кальцієвого каналу (Tedder T.F. та ін., J. Cell. Biochem. 14D, 1990, с. 195). Існують два різних типи антитіл до CD20, які істотно відрізняються механізмом зв'язування CD20 та біологічною активністю (Cragg M.S. та ін., Blood 103, 2004, стор. 2738-2743; та Cragg M.S. та ін., Blood, 101, 2003, стор. 1045-1052). Антитіла типу I, такі, наприклад, як ритуксимаб, мають сильну опосередковану комплементом цитотоксичність, у той час як антитіла типу II, такі, наприклад, як тозитумомаб (B1), 11B8, AT80 або гуманізовані антитіла B-Ly1, ефективно ініціюють загибель клітин-мішеней за допомогою незалежного від каспази апоптозу при супутній обробці фосфатиділсерином. Характерні особливості антитіл до CD20 типу I і типу II узагальнені в таблиці 1. Таблиця 1 Властивості антитіл до CD20 типу I і типу II Антитіла до CD20 типу I Епітоп CD20 типу I Локалізують CD20 у ліпідних рафтах Підвищений рівень CDC (у випадку IgG1ізотипу) ADCC-активність (у випадку IgG1-ізотипу) Повна зв’язуюча активність Гомотипічна агрегація Індукція апоптозу при перехресному зшиванні 40 45 Антитіла до CD20 типу II Епітоп CD20 типу II Не локалізують CD20 у ліпідних рафтах Знижений рівень CDC (у випадку IgG1-ізотипу) ADCC-активність (у випадку IgG1-ізотипу) Знижена зв’язуюча активність Більш сильна гомотипічна агрегація Сильна індукція клітинної загибелі без перехресного зшивання Короткий виклад суті винаходу Цей винахід відноситься до застосування антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування раку, при якому відбувається експресія CD20, у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину. Винахід також відноситься до застосування антитіла до CD20 типу II із підвищеною 1 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування пацієнта, що страждає на рак, при якому відбувається експресія CD20, у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину. Винахід також відноситься до антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), яке призначено для лікування раку, при якому відбувається експресія CD20, у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину. Винахід також відноситься до антитіла до CD20 типу II, що має підвищену антитіло-залежну клітиноопосередковану цитотоксичність (ADCC), яке призначено для лікування пацієнта, який страждає на рак, при якому відбувається експресія CD20, у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину. Переважно лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II, яке має підвищену антитілозалежну клітиноопосередковану цитотоксичність (ADCC), здійснюють у комбінації із циклофосфамідом та вінкристином. У винаході запропонована фармацевтична композиція, яка містить як антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), так і один або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, які застосовують при раку, при якому відбувається експресія CD20, зокрема при B-клітинних неходжкінських лімфомах (НХЛ). Переважно вказане антитіло до CD20 типу II представляє собою піддане глікоінженерії гуманізоване антитіло B-Ly1. Докладний опис винаходу Поняття «антитіло» відноситься до різних форм антитіл, включаючи (але, не обмежуючись тільки ними) повні антитіла, людські антитіла, гуманізовані антитіла та створені за допомогою генної інженерії антитіла, такі як моноклональні антитіла, химерні антитіла або рекомбінантні антитіла, а також фрагменти зазначених антитіл, якщо вони зберігають відмітні ознаки антитіл відповідно до винаходу. Поняття «моноклональне антитіло» або «композиція моноклонального антитіла» у контексті цього опису відносяться до препарату, що містить молекули антитіла, які мають однаковий амінокислотний склад. Відповідно поняття «людське моноклональне антитіло» відноситься до антитіл, що мають однакову специфічність зв'язування, які мають варіабельну та константну області, отримані з послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу людські моноклональні антитіла отримують за допомогою гібридоми, яка включає B-клітину, отриману із трансгенної тварини, крім людини, наприклад, трансгенної миші, що має геном, який містить трансген людського важкого ланцюга та трансген людського легкого ланцюга, злиті з імморталізованою клітиною. Переважно вказане антитіло до CD20 типу II представляє собою моноклональне антитіло. Поняття «химерне антитіло» відноситься до моноклонального антитіла, яке містить варіабельну область, тобто зв’язуючу область, виведену із одного джерела або видів, і, принаймні частину константної області, виведену з іншого джерела або видів, яке, як правило, отримують за допомогою методів рекомбінантної ДНК. Найбільш переважними є химерні антитіла, що містять варіабельну область миші та людську константну область. Такі химерні антитіла миші/людини є продуктом експресовуваних генів імуноглобуліну, що містять сегменти ДНК, які кодують мишачі варіабельні області імуноглобуліну, та сегменти ДНК, які кодують людські константні області імуноглобуліну. Іншими формами «химерних антитіл», що підпадають під обсяг цього винаходу, є антитіла, у яких клас або підклас є модифікованим або зміненим, у порівнянні з вихідним антитілом. Такі «химерні» антитіла називають також «антитілами переключеного класу». Методи отримання химерних антитіл засновані на загальноприйнятих методиках рекомбінантної ДНК і методиках генної трансфекції, і на сьогодні є добре відомими в даній області (див., наприклад, Morrison S.L. та ін., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, стор. 6851-6855; US 5202238 та US 5204244). Поняття «гуманізоване антитіло» відноситься до антитіл, у яких каркасна ділянка або «гіперваріабельні ділянки» (CDR) модифіковані таким чином, що вони містять CDR імуноглобуліну іншої специфічності, у порівнянні з батьківським імуноглобуліном. У переважному варіанті здійснення винаходу мишачі CDR трансплантують у каркасну ділянку людського антитіла, в результаті чого утворюється «гуманізоване антитіло» (див., наприклад, Riechmann L. та ін., Nature 332, 1988, стор. 323-327; і Neuberger M.S. та ін., Nature 314, 1985, 2 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стор. 268-270). Особливо переважними CDR є CDR, які містять послідовності, що розпізнають антигени, вказані вище для химерних і біфункціональних антитіл. Мається на увазі, що в контексті цього опису поняття «людське антитіло» включає антитіла, що мають варіабельну та константну області, виведені з послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії. Людські антитіла добре відомі в даній області (van Dijk M.A. і van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, стор. 368-374). На основі зазначеної технології можна одержувати людські антитіла до широкої розмаїтості мішеней. Приклади людських антитіл описані в Kellermann S.A. та ін., Curr Opin Biotechnol. 13, 2002, стор. 593-597. Мається на увазі, що поняття «рекомбінантне людське антитіло» у контексті цього опису включає всі людські антитіла, які отримують, експресують, створюють або виділяють методами рекомбінації, такі як антитіла, виділені із клітини-хазяїна, такої як NS0- або CHO-клітина, або із тварини (наприклад, із миші), яке є трансгенним у відношенні генів людського імуноглобуліну, або антитіла, експресовувані за допомогою рекомбінантного експресійного вектора, яким трансфектують клітину-хазяїна. Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельну та константну області, виведені з послідовностей імуноглобуліну людської зародкової лінії, у перетвореній формі. Рекомбінантні людські антитіла відповідно до винаходу, піддавали in vivo соматичній гіпермутації. Так, амінокислотні послідовності VH- і VL-областей рекомбінантного антитіла представляють собою послідовності, які, хоча і виведені з послідовностей VH- і VLобластей людської зародкової лінії і є родинними їм, але можуть не зустрічатись в існуючому в природних умовах in vivo спектрі зародкових ліній людського антитіла. В контексті цього опису поняття «специфічно зв'язується» або «зв'язується специфічно з» відноситься до антитіла, що специфічно зв'язується з антигеном CD20. Переважно афінність до -9 зв'язування характеризується значенням КД, що становить 10 молей/л або менше (наприклад, -10 -10 10 молей/л), переважно значенням КД, що становить 10 молей/л або менше (наприклад, 10 12 молей/л). Афінність зв'язування визначають за допомогою стандартного аналізу зв'язування, наприклад, аналізу графіків Скетчарда, з використанням експресуючих CD20 клітин. Мається на увазі, що поняття «молекула нуклеїнової кислоти» у контексті цього опису відноситься до молекул ДНК і молекул РНК. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, але переважно вона представляє собою дволанцюгову ДНК. «Константні області» не беруть участь безпосередньо у зв'язуванні антитіла з антигеном, але вони беруть участь в еффекторних функціях (таких як ADCC, зв'язування комплементу та CDC (комплементзалежна цитотоксичність). Поняття «варіабельна область» (варіабельна область легкого ланцюга (VL), варіабельна область важкого ланцюга (VH)) у контексті цього опису означає кожну з пар легких і важких ланцюгів, які беруть безпосередню участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні області людських легкого та важкого ланцюгів мають однакову загальну структуру, і кожна область містить чотири каркасних ділянки (FR), послідовності яких у значній мірі є консервативними, з'єднані трьома «гіперваріабельними ділянками» (або ділянками, що визначають комплементарність, CDR). Каркасні ділянки адаптовані до -складчастої конформації, та CDR можуть утворювати петлі, що з'єднують -складчасту структуру. CDR у кожному ланцюзі підтримують свою тривимірну структуру за допомогою каркасних ділянок та утворять разом із CDR з іншого ланцюга антигензв’язувальний центр. CDR3-ділянки важкого та легкого ланцюга антитіла відіграють найбільш важливу роль у специфічності/афінності до зв'язування антитіл відповідно до винаходу, і тому вони представляють собою іще один об'єкт винаходу. Поняття «гіперваріабельна ділянка» або «антигензв’язувальний центр антитіла» у контексті цього опису відносяться до амінокислотних залишків антитіла, які відповідальні за зв'язування з антигеном. Гіперваріабельна ділянка містить амінокислотні залишки з «ділянок, що визначають комплементарність» або «CDR». «Каркасні» або «FR»-ділянки представляють собою ділянки варіабельної області, відмінні від залишків гіперваріабельної ділянки, як вона визначена у цьому описі. Таким чином, легкий і важкий ланцюги антитіла містять у напрямку від N- до Cкінця наступні ділянки: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 та FR4. CDR3 важкого ланцюга представляє собою ділянку, яка перш за все вносить основний вклад у зв'язування з антигеном. CDR- і FR-ділянки визначають відповідно до стандартної номенклатури Kabat та ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е вид., вид-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991) та/або як ділянки з «гіперваріабельної петлі». Поняття «CD20» та «антиген CD20» у контексті цього опису використовують як взаємозамінні, і вони включають будь-які варіанти, ізоформи та видові гомологи людського CD20, які в природних умовах експресуються клітиною або експресуються на клітинах, 3 UA 105361 C2 5 10 трансфектованих геном CD20. Зв'язування антитіла, що пропонується у винаході, з антигеном CD20 опосередковує знищення клітин, експресуючих CD20 (наприклад, пухлинної клітини), шляхом інактивації CD20. Знищення клітин, експресуючих CD20, може відбуватися за допомогою одного або декількох з наступних механізмів: індукція клітинної загибелі/апоптозу, ADCC та CDC. Синонімами CD20, прийнятими в даній області, є антиген CD20 B-лімфоцитів, поверхневий антиген B-лімфоцитів B1, Leu-16, Bp35, BM5, та LF5. Поняття «антитіло до CD20», запропоноване у винаході, відноситься до антитіла, що специфічно зв'язується з антигеном CD20. Залежно від характеристик зв'язування та біологічної активності антитіла до CD20 у відношенні антигену CD20 можна розрізняти два типи антитіл до CD20 (антитіла до CD20 типу I і типу II) згідно Cragg M.S. та ін., Blood 103, 2004, стор. 27382743; та Cragg M.S. та ін., Blood 101, 2003, стор. 1045-1052 (див. таблицю 2). Таблиця 2 Властивості антитіл до CD20 типу I і типу II Антитіла до CD20 типу I Епітоп CD20 типу I Локалізують CD20 у ліпідних рафтах Підвищений рівень CDC (у випадку IgG1ізотипу) ADCC-активність (у випадку IgG1-ізотипу) Повна зв’язуюча активність Гомотипічна агрегація Індукція апоптозу при перехресному зшиванні 15 20 25 30 35 40 Антитіла до CD20 типу II Епітоп CD20 типу II Не локалізують CD20 у ліпідних рафтах Знижений рівень CDC (у випадку IgG1-ізотипу) ADCC-активність (у випадку IgG1-ізотипу) Знижена зв’язуюча активність Більш сильна гомотипічна агрегація Сильна індукція клітинної загибелі без перехресного зшивання Одним з основних властивостей антитіл до CD20 типу I та типу II є їх механізм зв'язування. Так, антитіла до CD20 типу I та типу II можна класифікувати за співвідношенням здатностей зазначеного антитіла до CD20 і ритуксимаба зв'язувати CD20 на Raji-клітинах (клітини лінії африканської лімфоми Беркітта) (ATCC № CCL-86). Антитіла до CD20 типу II характеризуються тим, що співвідношення здатностей зазначеного антитіла до CD20 і ритуксимаба зв'язувати CD20 на Raji-клітинах (ATCC № CCL-86) становить від 0,3 до 0,6, переважно від 0,35 до 0,55, більш переважно від 0,4 до 0,5. Прикладами зазначених антитіл до CD20 типу II є, наприклад, тозитумомаб (B1 IgG2a), гуманізоване антитіло B-Ly1 ізотипу IgG1 (химерне гуманізоване антитіло ізотипу IgG1 описане в WO 2005/044859), 11B8 IgG1 (описано в WO 2004/035607) та AT80 IgG1. Переважним антитілом до CD20 типу II є моноклональне антитіло, що зв'язується з тим же епітопом, що й гуманізоване антитіло B-Ly1 (описане в WO 2005/044859). Антитіла до CD20 типу I на відміну від антитіл типу II характеризуються тим, що співвідношення здатностей зазначеного антитіла до CD20 і ритуксимаба зв'язувати CD20 на Raji-клітинах (ATCC № CCL-86) становить від 0,8 до 1,2, переважно від 0,9 до 1,1. Прикладами зазначених антитіл до CD20 типу I є, наприклад, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ECACC, гібридома; Press O.W. та ін., Blood 69/2, 1987, стор. 584-591), HI47 IgG3 (ECACC, гібридома), 2C6 IgG1 (описано в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описано в WO 2004/035607 та WO 2005/103081) і 2H7 IgG1 (описано в WO 2004/056312). «Співвідношення здатностей антитіла до CD20 і ритуксимаба зв'язувати CD20 на Rajiклітинах (ATCC № CCL-86)» визначають методом прямої імунофлуоресценції (вимірюють середню інтенсивність флуоресценції (СІФ)) за допомогою пристрою FACSArray (фірма Becton Dickinson), використовуючи вказане антитіло до CD20, кон’юговане з Cy5, і ритуксимаб, кон’югований з Cy5, на Raji-клітинах (ATCC № CCL-86), відповідно до методу, описаному в прикладі 2, та вираховують наступним чином: Співвідношення здатності зв'язувати CD20 на Raji-клітинах (ATCC № CCL-86) = СІФ (Cy5 - антитіло до CD20) рівень Cy5 - мічення (Cy5 - ритуксимаб )  СІФ (Cy5 - ритуксимаб )рівень Cy5 - мічення (Cy5 - антитіло до - CD20) СІФ означає середню інтенсивність флуоресценції. «Рівень Cy5-мічення» у контексті цього опису означає кількість мічених Cy5 молекул на молекулу антитіла. Як правило, для зазначених антитіл до CD20 типу II є характерним співвідношення 4 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здатностей зазначеного антитіла до CD20 і ритуксимаба зв'язувати CD20 на Raji-клітинах (ATCC № CCL-86), що становить від 0,3 до 0,6, переважно від 0,35 до 0,55, більш переважно від 0,4 до 0,5. Вказане антитіло до CD20 типу II відповідно до винаходу має підвищену антитіло-залежну клітиноопосередковану цитотоксичність (ADCC). Під «антитілом, із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) або «антитілом з підвищеною антитіло-залежною клітиноопосередкованю цитотоксичністю (ADCC)» розуміють антитіло, характеристики якого описані вище, що має підвищену ADCC при визначенні за допомогою будь-якого придатного методу, відомого звичайним фахівцям у даній області. Один із прийнятних аналізів in vitro ADCC передбачає, що: 1) в аналізі використовують клітини-мішені, про яких відомо, що вони експресують антигенмішень, що розпізнається антигензв’язувальною областю антитіла; 2) у якості еффекторних клітин в аналізі використовують мононуклеарні клітини периферічної крові людини (PBMC), виділені із крові довільно обраного здорового донора; 3) аналіз здійснюють відповідно до наступного протоколу: I) виділяють PBMC за допомогою стандартних процесів центрифугування у градієнті 6 щільності та суспендують із розрахунку 5×10 клітин/мл в RPMI-середовищі для культивування клітин; II) вирощують клітини-мішені за допомогою стандартних методів культивування тканин, збирають клітини на експоненціальній фазі росту, життєздатність яких перевищує 90 %, 51 відмивають в RPMI-середовищі для культивування клітин, мітять Cr (100 мкКі), відмивають двічі в середовищі для культивування клітин і ресуспендують у середовище для культивування 5 клітин із щільністю 10 клітин/мл; III) здійснюють трансфекцію, використовуючи по 100 мкл зазначеної вище кінцевої суспензії клітин-мішеней на кожну лунку 96-лункового титраційного мікропланшету; IV) здійснюють серійне розведення антитіла від 4000 до 0,04 нг/мл у середовище для культивування клітин і додають по 50 мкл розчинів антитіла до клітин-мішеней в 96-лунковому титраційному мікропланшеті, які утворились, оцінюють у трьох повторностях антитіло в різних концентраціях, що покривають весь діапазон зазначених вище концентрацій; V) для контролю максимального вивільнення (MR) в 3 додаткові лунки в планшеті, що містять мічені клітини-мішені, вносять по 50 мкл 2 %-ного (VN) водного розчину неіоногенної поверхнево-активної речовини (Nonidet, фірма Sigma, Сент-Луїс) замість розчину антитіла (пункт IV, вище); VI) для контролю спонтанного вивільнення (SR) в 3 додаткові лунки в планшеті, що містять мічені клітини-мішені, вносять по 50 мкл RPMI-середовища для культивування клітин замість розчину антитіла (пункт IV, вище); VII) потім 96-лунковий титраційний мікропланшет центрифугують при 50×g протягом 1 хв та інкубують протягом 1 г при 4 °C; VIII) додають по 50 мкл суспензії PBMC (пункт I, вище) у кожну лунку для забезпечення співвідношення еффекторна клітина:клітина-мішень 25:1, та планшети поміщають в інкубатор в атмосферу, що містить 5 % CO2, на 4 г при температурі 37 °C; IX) збирають безклітинний супернатант із кожної лунки та за допомогою гамма-лічильника, кількісно оцінюють радіоактивність, що вивільнилась в експерименті (ER); X) розраховують відсоток питомого лізису для кожної концентрації антитіла за допомогою формули (ER-MR)/(MR-SR) х 100, де ER представляє собою середню радіоактивність (див. пункт IX, вище), визначену для зазначеної концентрації антитіла, MR представляє собою середню радіоактивність (див. пункт IX, вище), визначену для MR-контролів (див. пункт V, вище), а SR представляє собою середню радіоактивність (див. пункт IX, вище), визначену для SR-контролів (див. пункт VI, вище); 4) визначають «підвищений рівень ADCC» або за підвищенням максимального відсотку питомого лізису, виявленого в зазначеному вище діапазоні концентрацій антитіла, та/або за зниженням концентрації антитіла, необхідної для досягнення половини від максимального відсотку специфічного лізису, виявленого в зазначеному вище діапазоні концентрацій антитіла. Підвищення рівня ADCC визначають по відношенню до рівня ADCC, виміреного за допомогою описаного вище аналізу, опосередковуваного таким же антитілом, отриманим з використанням такого ж типу клітин-хазяїв, з використанням таких же стандартних методів очищення, приготування форм і зберігання, які добре відомі фахівцям у даній області, але яке не отримано з використанням клітин-хазяїв, сконструйованих так, що вони надекспресують GnTIII. Зазначену «підвищену (підвищений рівень) ADCC» можна отримувати шляхом глікоінженерії вказаних антитіл, що означає підвищення опосередковуваних клітиною еффекторних функцій 5 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 моноклональних антитіл, що зустрічаються в природних умовах, шляхом інженерії їх олігосахаридного компоненту відповідно до методу, який описаний в Umana, P. та ін., Nature Biotechnol. 17, 1999, стор. 176-180 та в US 6602684. Поняття «комплементзалежна цитотоксичність (CDC)» відноситься до лізису людських пухлинних клітин-мішеней антитілом, що пропонується у винаході, у присутності комплементу. CDC переважно оцінюють шляхом обробки препарату експресуючих CD20 клітин антитілом до CD20, що пропонується у винаході, у присутності комплементу. Вважають, що має місце CDC, якщо антитіло при його застосуванні у концентрації 100 нМ індукує лізис (загибель клітин) 20 % або більше пухлинних клітин протягом 4 г. Аналіз переважно здійснюють за допомогою мічених 51 51 Cr або Eu пухлинних клітин та оцінюють вивільнення Cr або Eu. В якості контролю пухлинні клітини-мішені інкубують з комплементом без антитіла. Як правило, антитіла до CD20 типу II ізотипу IgG1 характеризуються наявністю CDCактивності. Антитіла до CD20 типу II мають знижену CDC (у випадку ізотипу IgG1), у порівнянні з антитілами типу I ізотипу IgG1. Переважно антитіла до CD20 типу II представляють собою антитіла ізотипу IgG1. Антитіло «ритуксимаб» (стандартне антитіло; приклад антитіла до CD20 типу I) представляє собою створене за допомогою генетичної інженерії химерне людське/мишаче моноклональне антитіло до людського антигену CD20 яке містить людську гама-1 константну область. Химерне антитіло містить людські гама-1 константні області та ідентифіковане під назвою «C2B8» у патенті США 5736137 (Anderson K.C. та ін.), виданому 17 квітня 1998 р. на ім'я фірми IDEC Pharmaceuticals Corporation. Ритуксимаб дозволений для лікування пацієнтів, що страждають рецидивною або рефрактерною, низького ступеня злоякісності або фолікулярною, CD20позитивною, B-клітинною неходжкінською лімфомою. Вивчення механізму дії в дослідах in vitro продемонструвало, що ритуксимаб має залежну від людського комплементу цитотоксичність (CDC) (Reff M.E. та ін., Blood 83(2), 1994, стор. 435-445). Крім того, він має виражену активність в аналізах з оцінки антитіло-залежної клітиноопосередкованої цитотоксичності (ADCC). Поняття «гуманізоване антитіло B-Ly1» відноситься до гуманізованого антитіла B-Ly1, яке описане у WO 2005/044859 та WO 2007/031875, яке отримували з мишачого моноклонального антитіла до CD20 B-Ly1 (варіабельна область мишачого важкого ланцюга (VH): SEQ ID NO: 1; варіабельна область мишачого легкого ланцюга (VL): SEQ ID NO: 2 - див. Poppema S. та Visser L., Biotest Bulletin 3, 1987, стор. 131-139;) шляхом химеризації з людською константною областю з IgG1 та наступної гуманізації (див. WO 2005/044859 та WO 2007/031875). Ці «гуманізовані антитіла B-Ly1» докладно описані в WO 2005/044859 та WO 2007/031875. Переважно «гуманізоване антитіло B-Ly1» має варіабельну область важкого ланцюга (VH), обрану із SEQ ID NО: 3 - SEQ ID No.20 (B-HH2 - B-HH9 та B-HL8 - B-HL17, які описані в WO 2005/044859 та WO 2007/031875). Найбільш переважними є SEQ. ID NО: 3, 4, 7, 9, 11, 13 та 15 (B-HH2, B-HH3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 та B-HL13, які описані в WO 2005/044859 та WO 2007/031875). Переважно «гуманізоване антитіло B-Ly1» має варіабельну область легкого ланцюга (VL), яка представлена в SEQ ID NО: 20 (B-KV1 WO 2005/044859 та WO 2007/031875). Крім того, гуманізоване антитіло B-Ly1 переважно представляє собою антитіло ізотипу IgG1. Зазначені гуманізовані антитіла B-Ly1, відповідно до винаходу, створені за допомогою глікоінженерії (GE) в Fc-області відповідно до методів, які описані в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, в Umana P. та ін., Nature Biotechnol. 17, 1999, стор. 176-180 та WO 99/154342. Зазначені «створені за допомогою глікоінженерії гуманізовані антитіла B-Ly1» мають змінену схему глікозилювання в Fc-області, переважно мають знижений рівень фукозних залишків. Переважно, принаймні, 40 % або більше (в одному з варіантів здійснення винаходу від 40 % до 60 %, в іншому варіанті здійснення винаходу, принаймні, 50 %, а в ще одному варіанті здійснення, принаймні, 70 % або більше) олігосахаридів Fc-області є нефукозильованими. Крім того, олігосахариди Fc-області переважно є бісекційними. Олігосахаридний компонент може суттєво впливати на властивості, що мають відношення до ефективності терапевтичного глікопротеїну, включаючи стабільність, стійкість до впливу протеаз, взаємодії з імунною системою, фармакокінетичні параметри та специфічну біологічну активність. Зазначені властивості можуть залежати не тільки від присутності або відсутності олігосахаридів, але також від їхніх специфічних структур. Можна зробити певні узагальнення, що стосуються залежності структури олігосахариду та функції глікопротеїну. Наприклад, деякі структури олігосахариду опосередковують швидкий кліренс глікопротеїну із кровотоку в результаті взаємодій зі специфічними білками, що зв’язують вуглеводи, а інші можуть зв'язуватись антитілами та запускати небажані імунні реакції (Jenkins N. та ін., Nature Biotechnol. 14, 1996, стор. 975-981). Клітини ссавців є переважними хазяями для виробництва терапевтичних глікопротеїнів 6 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 завдяки їх здатності глікозилювати білки з отриманням найбільш прийнятної для застосування на людині форми (Cumming D.A. та ін., Glycobiology 1, 1991, стор. 115-130; Jenkins N. та ін., Nature Biotechnol. 14, 1996, стор. 975-981). Бактерії дуже рідко глікозилюють білки, та подібно іншим типам звичайних хазяїв, таких як клітини дріжджів, нитчатих грибів, комах і рослин, забезпечують схеми глікозилювання, асоційовані зі швидким кліренсом із кровотоку, небажаними імунними взаємодіями та, у деяких випадках, зниженою біологічною активністю. Серед клітин ссавців клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO) знайшли найбільш широке застосування протягом двох останніх десятиліть. Крім забезпечення прийнятних схем глікозилювання ці клітини дозволяють стійко отримувати генетично стабільні, високопродуктивні клональні клітинні лінії. Їх можна культивувати, досягаючи високої щільності, в простих біореакторах з використанням безсироваткових середовищ, та на їх основі можна розробляти безпечні та відтворювані біопроцеси. Іншими клітинами тварин, що звичайно застосовуються, є клітини нирки дитинчати хом'яка (BHK), клітини мишачої мієломи NSО та SP2/0. В останні роки вивчали також можливість виробництва із трансгенних тварин (Jenkins N. та ін. Nature Biotechnol. 14, 1996, стор. 975-981). Всі антитіла містять вуглеводні структури в консервативних положеннях в константних областях важкого ланцюга, при цьому кожен ізотип характеризується різною організацією Nзв'язаних вуглеводних структур, які спричиняють різну дію на збірку, секрецію та функціональну активність білка (Wright A. та Monison S. L., Trends Biotech. 15, 1997, стор. 26-32). Структура приєднаного N-зв'язаного вуглеводу значно варіюється залежно від ступеня процесування та може включати безліч розгалужень, що мають високий вміст маннози, а також біантенні складні олігосахариди (Wright A. та Morrison S. L., Trends Biotech. 15, 1997, стор. 26-32). Як правило, має місце гетерогенний процесинг структур корових олігосахаридів, приєднаних у конкретному сайті глікозилювання, в результаті чого навіть моноклональні антитіла існують у вигляді декількох глікоформ. Було встановлено також, що основні розходження в глікозилюванні антитіл мають місце між клітинними лініями, і навіть невеликі розходження вимагають вирощування даної клітинної лінії в інших умовах культивування (Lifely M. R. та ін., Glycobiology 5(8), 1995, стор. 813-22). Одним зі шляхів досягнення значного підвищення ефективності при збереженні простого процесу отримання та, який, очевидно, може забезпечити відсутність значних небажаних побічних дій, є посилення обумовлених клітиною еффекторних функцій моноклональних антитіл, що зустрічаються в природних умовах, шляхом конструювання їх олігосахаридного компоненту відповідно до методу, що описаний в Umana P. та ін., Nature Biotechnol. 17, 1999, стор. 176-180; та US 6602684. Антитіла IgGl-типу, які найбільш часто застосовують в імунотерапії раку, представляють собою глікопротеїни, що мають консервативний N-зв'язаний сайт глікозилювання на Asn297 у кожному CH2-домені. Два складних біантенних олігосахариди, приєднаних до Asn297, розташовують між CH2-доменами, формуючи обширний контакт із поліпептидним каркасом, і їхня присутність є важливою для того, щоб антитіло могло здійснювати еффекторні функції, такі як антитіло-залежна клітиноопосередкована цитотоксичність (ADCC) (Lifely M.R. та ін., Glycobiology 5, 1995, стор. 813-822; Jefferis R. та ін., Immunol. Rev. 163, 1998, стор. 59-76; Wright A. та Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15, 1997, стор. 26-32). Раніше було встановлено, що надекспресія β(1,4)-N-ацетилглюкозамінтрансферази III («GnTIII»), тобто глікозилтрансферази, яка каталізує утворення бісекційних олігосахаридів, значно підвищує in vitro ADCC-активність антинеобластомного химерного моноклонального антитіла (chCE7), яке продукується сконструйованими CHO-клітинами (див. Umana P. та ін., Nature Biotechnol. 17, 1999, стор. 176-180; та WO 99/154342, повний вміст яких включений в цей опис в якості посилання). Антитіло chCE7 належить до великого класу некон’югованих моноклональних антитіл, які мають високий рівень афінності та специфічності у відношенні пухлин, але мають занадто низьку ефективність для їх клінічного застосування при виробництві в стандартних застосовуваних в промисловості індустріальних клітинних лініях, у яких відсутній фермент GnTIII (Umana P. та ін., Nature Biotechnol. 17, 1999, стор. 176-180). У цьому дослідженні вперше було продемонстровано, що значне підвищення ADCC-активності можна досягати шляхом створення продукуючих антитіла клітин, які експресують GnTIII, що приводить також до підвищення відносного вмісту асоційованих з константною областю (Fc) бісекційних олігосахаридів, включаючи бісекційні нефукозиловані олігосахариди, у порівнянні з рівнями, характерними для антитіл, що зустрічаються в природних умовах. Мається на увазі, що поняття «експресія антигену CD20» відноситься до значного рівня експресії антигену CD20 у клітині, переважно на клітинній поверхні T- або B-клітини, більш переважно B-клітини, з пухлини або раку відповідно, переважно несолідної пухлини. Пацієнтів, 7 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 які мають «рак, при якому відбувається експресія CD20», можна виявляти за допомогою стандартних аналізів, відомих у даній області. Наприклад, експресію антигену CD20 оцінюють імуногістохімічним (ІГХ) методом, FACS (клітинним сортером із активацією флуоресценції) або шляхом виявлення із застосуванням ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) відповідної мРНК. Поняття «рак, при якому відбувається експресія CD20» у контексті цього опису відноситься до всіх видів ракових клітин, для яких характерна експресія антигену CD20. Зазначений рак, при якому відбувається експресія CD20, може представляти собою, наприклад, лімфоми, лімфолейкози, рак легенів, недрібноклітинний рак легенів (NSCL), бронхоальвеолярноклітинний рак легенів, рак кісток, рак підшлункової залози, рак шкіри, рак голови або шиї, шкірну або внутрішньочну меланому, рак матки, рак яєчників, рак прямої кишки, рак анальної області, рак шлунку, рак шлуково-кишкового тракту, рак товстої кишки, рак молочної залози, рак матки, карциному фаллопієвих труб, карциному ендметрія, карциному шийки матки, карциному піхви, карциному вульви, хворобу Ходжкіна, рак стравоходу, рак тонкого кишечнику, рак ендокринної системи, рак щитовидної залози, рак паращитовидної залози, рак надниркової залози, саркому м'яких тканин, рак сечовипускного каналу, рак полового члену, рак передміхурової залози, рак сечового міхура, рак нирки або сечоводу, нирково-клітинну карциному, карциному ниркових мисок, мезотеліому, печінково-клітинний рак, рак біліарного тракту, неоплазми центральної нервової системи (ЦНС), пухлини хребта, гліому стовбура головного мозку, мультиформну гліобластому, астроцитоми, шваноми, епендімоми, мебуллобластоми, менінгіоми, плоскоклітинні карциноми, аденому гіпофізу, у тому числі резистентні форми кожного із вказаних вище видів раку або комбінації одного або декількох із вказаних вище видів раку. У контексті цього опису рак, при якому відбувається експресія CD20, переважно відноситься до лімфом (переважно B-клітинних неходжкінських лімфом (НХЛ)) та лімфолейкозів. Зазначені лімфоми та лімфолейкози включають, наприклад, a) фолікулярні лімфоми, б) дрібноклітинні з нерозщепленими ядрами лімфоми/лімфому Беркітта (включаючи ендемічну лімфому Беркітта, спорадичну лімфому Беркітта та неберкіттовську лімфому), в) лімфоми маргінальної зони (включаючи екстранодальну B-клітинну лімфому маргінальної зони (лімфоми лімфоїдної тканини слизових оболонок, MALT), нодальну B-клітинну лімфому маргінальної зони та лімфому маргінальної зони селезінки), г) лімфому із клітин зони мантії (MCL), д) великоклітинну лімфому (включаючи B-клітинну дифузну великоклітинну лімфому (DLCL), дифузну змішано-клітинну лімфому, імунобластну лімфому, первинну медіастенальну B-клітинну лімфому, лімфангіомулегеневу B-клітинну лімфому), е) волосяноклітинний лейкоз, ж) лімфоцитарну лімфому, макроглобулінемію Вальденстрема, з) гострий лімфобластний лейкоз (ALL), хронічний лімфолейкоз (CLL)/дрібноклітинний лімфолейкоз (SLL), B-клітинний пролімфоцитарний лейкоз, і) неоплазми із плазматичних клітин, мієломи із плазматичних клітин, множинну мієлому, плазмацитому, к) хворобу Ходжкіна. Більш переважно рак, при якому відбувається експресія CD20, представляє собою Bклітинні неходжкінські лімфоми (НХЛ). Особливо переважно рак, при якому відбувається експресія CD20, представляє собою лімфому із клітин зони мантії (MCL), гострий лімфобластний лейкоз (ALL), хронічний лімфолейкоз (CLL), B-клітинну дифузну великоклітинну лімфому (DLCL), лімфому Беркітта, волосяноклітинний лейкоз, фолікулярну лімфому, множинну мієлому, лімфому маргінальної зони, пост-трансплантаційне лімфопроліферативне порушення (PTLD), ВІЛ-асоційовану лімфому, макроглобулінемію Вальденстрема або первинну лімфому ЦНС. Поняття «спосіб лікування» або його еквівалент по відношенню, наприклад, до раку відноситься до процедури або курсу лікування, яку/який розробляють із метою зниження або усунення деякої кількості ракових клітин в організмі пацієнта або для полегшення симптомів раку. «Спосіб лікування» раку або іншого проліферативного порушення не обов'язково має на увазі те, що ракові клітини або інші порушення повинні бути фактично еліміновані, що кількість клітин або рівень порушення фактично повинні бути знижені, або що інші симптоми раку або іншого порушення фактично повинні бути полегшені. Часто спосіб лікування раку можна здійснювати навіть із невеликою ймовірністю успіху, але він із урахуванням історії хвороби пацієнта та оціненої перспективи хірургічного втручання, все таки, як передбачається, може мати загальний сприятливий вплив. Одним із варіантів здійснення винаходу є лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) у комбінації із циклофосфамідом та вінкристином. Іншим варіантом здійснення винаходу є лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) у комбінації з доксорубіцином. 8 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Іншим варіантом здійснення винаходу є лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) у комбінації із циклофосфамідом. Іншим варіантом здійснення винаходу є лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) у комбінації із циклофосфамідом, вінкристином і доксорубіцином. Поняття «спільне застосування» «спільне введення» або «введення «у комбінації (комбінації)» у контексті цього опису мають однакове значення та відносяться до введення зазначеного антитіла до CD20 типу II і вказаних хіміотерапевтичних засобів у вигляді однієї індивідуальної препаративної форми або у вигляді двох різних препаративних форм. Спільне застосування може бути одночасним або послідовним у будь-якому порядку, при цьому переважно існує період часу, протягом якого дві (або всі) діючі речовини одночасно проявляють свою біологічну дію. Вказане антитіло до CD20 типу II і зазначені хіміотерапевтичні засоби спільно вводять або одночасно, або послідовно (наприклад, внутрівенно (внутрішньовенно) за допомогою постійної інфузії (однієї для антитіла та, як правило, ще однієї для хіміотерапевтичних засобів; або хіміотерапевтичні засоби вводять орально). Коли обидва терапевтичних засоби спільно вводять послідовно, то дозу, яка вводиться, застосовують або в той самий день у вигляді двох різних введень, або один із засобів вводять на 1 день, а другий спільно застосовуваний засіб вводять на 2-7 день, переважно на 2-4 день. Таким чином, поняття «послідовно» означає введення в межах 7 днів після введення дози першого антитіла, переважно в межах 4 днів після введення дози першого антитіла; а поняття «одночасно» означає в один і той же час. Поняття «спільне застосування» у відношенні підтримуючих доз антитіла до CD20 типу II і хіміотерапевтичних засобів означає, що підтримуючі дози можна спільно вводити одночасно, якщо цикл лікування обох лікарських засобів придатний для цього, наприклад, щотижня. Або хіміотерапевтичні засоби вводять, наприклад, кожний перший-третій день, а антитіло до CD20 типу II вводять щотижня. Або підтримуючі дози застосовують спільно послідовно або в один день, або в межах декількох днів. Очевидно, що антитіла вводять пацієнтові в «терапевтично ефективній кількості» (або просто в «ефективній кількості»), що представляє собою кількість відповідного складу або комбінації, що викликає біологічну або медичну відповідь тканини, системи, тварини або людини, яка є очікуваною дослідником, ветеринаром, лікарем або іншим клініцистом. Кількість антитіла до CD20 типу II і хіміотерапевтичних засобів, що застосовуються для спільного введення, і час спільного застосування мають залежати від типу (вид, стать, вік, вага та т.д.) і стану пацієнта, що підлягає лікуванню, та серйозності захворювання або стану, що підлягає лікуванню. Вказане антитіло до CD20 типу II і зазначені хіміотерапевтичні засоби можна спільно вводити пацієнтові один раз або у вигляді серії лікування. Залежно від типу та серйозності захворювання можлива початкова доза при спільному введенні пацієнтові обох лікарських засобів може становити приблизно від 1 мкг/кг до 50 мг/кг (наприклад, 0,1-20 мг/кг) зазначеного антитіла до CD20 типу II і від 1 мкг/кг до 50 мг/кг (наприклад, 0,1-20 мг/кг) вказаних хіміотерапевтичних засобів. Якщо введення становить собою внутрішньовенне введення, то тривалість початкової інфузії зазначеного антитіла до CD20 типу II або вказаних хіміотерапевтичних засобів може бути більш пролонгованою, у порівнянні із тривалістю наступних інфузій, наприклад, становити приблизно 90 хв у випадку початкової інфузії та приблизно 30 хв у випадку наступних інфузій (якщо початкова інфузія добре переносилась). Переважна доза зазначеного антитіла до CD20 типу II може становити від приблизно 0,05 до приблизно 30 мг/кг. Так, пацієнтові можна спільно вводити одну або кілька доз, що становлять приблизно 0,5, 2,0, 4,0, 10 або 30 мг/кг (або будь-яку їх комбінацію). Переважна доза вказаних хіміотерапевтичних засобів, у випадку бортезомібу, може становити від 0,01 до приблизно 30 мг/кг, наприклад, від 0,1 до 10,0 мг/кг. Залежно від типу (вид, стать, вік, вага та т.д.) і стану пацієнта та типу антитіла до CD20 і хіміотерапевтичних засобів доза та схема введення зазначеного антитіла до CD20 може відрізнятися від дози хіміотерапевтичних засобів. Наприклад, вказане антитіло до CD20 можна вводити, наприклад, кожні 1-3 тижні, а зазначені хіміотерапевтичні засоби можна вводити щодня або кожні 2-10 днів. Можна вводити також початкову більш високу ударну дозу з наступним введенням однієї або декількох більш низьких доз. У переважному варіанті здійснення винаходу лікарський засіб можна застосовувати для попередження або зниження метастаз чи проти подальшого їх поширення у пацієнта, що страждає на рак, при якому відбувається експресія CD20. Лікарський засіб можна застосовувати для подовження тривалості життя зазначеного пацієнта, подовження тривалості життя до прогресування хвороби у зазначеного пацієнта, подовження тривалості відповіді, що приводить 9 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до статистично значимого та клінічно помітного поліпшення стану пацієнта, якого лікують, а при оцінці за тривалістю життя, для тривалості життя до прогресування хвороби, рівня ремісії або тривалості ремісії. У переважному варіанті здійснення винаходу лікарський засіб можна застосовувати для підвищення рівня ремісії у групи пацієнтів. Можна застосовувати комбінацію антитіла до CD20 типу II і хіміотерапевтичних засобів для лікування раку, при якому відбувається експресія CD20. Зазначені молекули можуть бути присутніми у комбінації у кількостях, ефективних відповідно до поставленої мети. Таким чином, відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу вводять антитіло до CD20 типу II, яке має підвищену антитіло-залежну клітиноопосередковану цитотоксичність (ADCC), у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, та одним додатковим кортикостероїдом, переважно преднізоном. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу лікування комбінацією антитіла до CD20 типу II і хіміотерапевтичних засобів здійснюють без додаткового використання кортикостероїдів. Описане вище застосування кортикостероїдів у якості хіміотерапевтичних схем лікування, як правило, добре охарактеризовано в області терапії раку, та відповідно із цим описом розглядається їх застосування для моніторингу толерантності та ефективності та для контролю способів введення та доз, з деяким коригуванням. Наприклад, фактичні дози хіміотерапевтичних засобів і кортикостероїдів можна варіювати залежно від відповіді культивуємих клітин пацієнта, яку визначають за допомогою методів гістокультур. Як правило, доза повинна бути знижена в порівнянні з кількістю, яка застосовується у відсутності інших додаткових засобів. Типові дози ефективних хіміотерапевтичних засобів та/або кортикостероїдів можуть перебувати в діапазонах, рекомендованих виробником, і якщо це встановлено відповідно до відповідей in vitro або відповідно до відповідей на створених на тваринах моделях, то їх концентрацію або кількість можна знижувати приблизно аж до 10 разів. Так, фактична доза повинна залежати від рішення лікаря, стану пацієнта та ефективності способу лікування, заснованих на оцінці чутливості in vitro первинних культур злоякісних клітин або зразка тканини у гістокультурі, або відповідей, виявлених навідповідних моделях, створених на тваринах. У контексті цього винаходу на додаток до комбінованого лікування раку, при якому відбувається експресія CD20, з використанням антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) та хіміотерапевтичних засобів можна застосовувати іонізуючу ефективну кількість іонізуючого випромінювання та/або радіофармацевтичних засобів. Джерело випромінювання по відношенню до пацієнта, який підлягає лікуванню, може бути внутрішнім або зовнішнім. Коли джерело по відношенню до пацієнта є зовнішнім, то терапію називають зовнішньою променевою терапією (EBRT). Коли джерело випромінювання є внутрішнім по відношенню до пацієнта, то терапію називають брахітерапією (BT). Радіоактивні атоми, які можуть бути застосовані відповідно до цього винаходу, можуть бути вибрані із групи, яка включає (але, не обмежуючись тільки ними) радій, цезій-137, іридій-192, америцій-241, золото-198, кобальт-57, мідь-67, технецій-99, йод-123, йод131 та індій-111. Можна також мітити антитіло відповідними радіоактивними ізотопами. Переважно комбіновану терапію з використанням антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) та хіміотерапевтичного засобу застосовують без іонізуючого випромінювання. Променева терапія є стандартним засобом лікування для боротьби з нерезектабельними або неоперабельними пухлинами та/або метастазами пухлин. Покращені результати були отримані, коли променеву терапію поєднували з хіміотерапією. Променева терапія заснована на тому принципі, що висока доза випромінювання, яка поставляється до області мішені, може приводити до загибелі репродуктивних клітин, як у пухлині, так і в здорових тканинах. Режим дози радіаційного випромінювання, як правило, визначають в показниках абсорбованої дози випромінювання (Гр), часу та фракціонування, та її повинен ретельно підбирати онколог. Кількість випромінювання, яку отримує пацієнт, має залежати від різних умов, однак двома найбільш важливими умовами є локалізація пухлини по відношенню до інших структур або органів організму, які мають вирішальне значення, та ступінь поширення пухлини. Типовий курс лікування пацієнта, якого піддають променевій терапії, представляє собою курс лікування протягом періоду часу, що становить від 1 до 6 тижнів, при цьому дозу від 10 до 80 Гр вводять пацієнтові у вигляді однократної добової фракціонованої дози, що становить від 1,8 до 2,0 Гр, 5 днів на тиждень. У переважному варіанті здійснення цього винаходу, коли пухлини у хворих людей піддають комбінованій терапії відповідно до винаходу та випромінюванню, то має місце 10 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 синергізм. Інакше кажучи, інгібування росту пухлин за допомогою засобів, які містять комбінацію, відповідно до винаходу, посилюється тоді, коли вони комбінуються з радіаційним випромінюванням, необов'язково в сполученні з додатковими хіміотерапевтичними або протираковими засобами. Параметри допоміжної променевої терапії описані, наприклад, в WO 99/60023. Антитіла до CD20 типу II вводять пацієнтові за допомогою відомих методів із застосуванням внутрішньовенного введення у вигляді болюсу або постійної інфузії протягом певного періоду часу, використовуючи внутрішньом'язовий, інтраперитонеальний, спинномозковий, підшкірний, інтраартикулярний, інтрасиновіальний або інтратекальний спосіб введення. Переважним є внутрішньовенний або підшкірний спосіб введення антитіл. Хіміотерапевтичні засоби вводять пацієнтові за допомогою відомих способів, наприклад, із застосуванням внутрішньовенного введення у вигляді болюсу або постійної інфузії протягом певного періоду часу, за допомогою внутрішньом'язового, внутрішньочеревного, спинномозкового, підшкірного, інтраартикулярне, інтрасиновіальне, інтратекальний або перорального способів введення. Переважним є внутрішньовенне, підшкірне або пероральне введення хіміотерапевтичних засобів. Винахід також відноситься до набору, який містить антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), і один або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, для комбінованої терапії пацієнта, що страждає на рак, при якому відбувається експресія CD20. У переважному варіанті здійснення винаходу упаковки набору можуть містити також фармацевтично прийнятний носій. Набір може включати також стерильний розріджувач, який переважно зберігають у окремій додатковій упаковці. Набір також може включати в середині упакування листівку-вкладиш, яка містить керівництво із застосування комбінованої терапії для лікування раку, при якому відбувається експресія CD20, переважно B-клітинної неходжкінської лімфоми (НХЛ). Поняття «листівка-вкладиш в упакуванні» відноситься до інструкцій, які звичайно включають у поступаючі у продаж упакування терапевтичних продуктів, які можуть містити інформацію про показання, застосування, дозу, введення, протипоказаннях та/або запобіжні заходи при застосуванні вказаних терапевтичних продуктів. У переважному варіанті здійснення винаходу упаковки виробу можуть містити також фармацевтично прийнятний носій. Виріб також може включати стерильний розріджувач, який переважно знаходиться в окремій додатковій упаковці. У контексті цього опису поняття «фармацевтично прийнятний носій» включає будь-який і всі матеріали, придатні для фармацевтичного введення, включаючи розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні та протигрибкові засоби, засоби, які надають ізоточність та сповільнюють абсорбцію, та інші матеріали та склади, які є придатними для фізіологічного введення. За винятком випадку, коли вони є несумісними з діючою речовиною, будь-які традиційні середовища або засоби застосовують у композиціях відповідно до винаходу. Додаткові діючі речовини також можуть бути включені у композиції. Фармацевтичні композиції: Фармацевтичні композиції можна отримувати при допомозі обробки антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) та/або хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину відповідно до винаходу, з фармацевтично прийнятними неорганічними або органічними носіями. Наприклад, в якості носіїв для таблеток, таблеток з покриттям, драже та твердих желатинових капсул, можна застосовувати лактозу, кукурудзяний крохмаль або його похідні, тальк, стеаринові кислоти або їх солі і т.д. Придатними носіями для м'яких желатинових капсул є, наприклад, рослинні масла, воски, жири, напівтверді та рідкі поліоли і т.д. Однак, в залежності від природи діючої речовини, як правило, для м'яких желатинових капсул носії не потрібні. Прийнятними носіями для приготування розчинів і сиропів є, наприклад, вода, поліоли, гліцерин, рослинне масло і т.д. Прийнятними носіями для супозиторіїв є, наприклад, такі, що зустрічаються в природних умовах, або гідрогенізовані масла, воски, жири, напівтверді або рідкі поліоли і т.д. Крім того, до складу фармацевтичних композицій входять консерванти, солюбілізатори, стабілізатори, змочувальні засоби, емульгатори, що підсолоджувальні речовини, барвники, ароматизатори, солі для зміни осмотичного тиску, буферні розчини, маскуючі речовини або антиоксиданти. Вони також можуть містити інші терапевтично ефективні субстанції. Одним з варіантів здійснення винаходу є фармацевтична композиція, яка містить як антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою 11 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 цитотоксичністю (ADCC), так і один або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, зокрема, для застосування при раку, при якому відбувається експресія CD20. Зазначена фармацевтична композиція може містити також один або більше фармацевтично прийнятних носіїв. Цей винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, яку застосовують, зокрема, при раку, яка містить (I) в якості першого засобу антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), в ефективній кількості, та (II) в якості другого засобу один або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, в ефективній кількості. Зазначена композиція необов'язково містить фармацевтично прийнятні носії та/або допоміжні речовини. Фармацевтичні композиції, які містять лише антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), які застосовують відповідно до цього винаходу, підготовлюють для зберігання шляхом змішування антитіла, яке має необхідний ступінь чистоти, з додатковими фармацевтично прийнятними носіями, допоміжними речовинами або стабілізаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, під ред. Osol A.E., 16-е видання, 1980), в таких формах як ліофілізовані препаративні форми або водні розчини. Придатні носії, допоміжні речовини або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів в застосовуваних дозах і концентраціях та включають буферні розчини, такі як фосфатні, цитратні та буферні розчини на основі інших органічних кислот; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензиламмонійхлорид; гексаметонійхлорид; бензалконійхлорид, бензетонійхлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3пентанол; та мета-крезол); низькомолекулярні (що складаються з менш чим приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпірролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, маннозу або декстрини; хелатуючі засоби, такі як ЕДТК; цукри, такі як сахароза, манніт, трегалоза або сорбіт; протиіони, які утворюють солі, такі як натрій; комплекси з металами (наприклад, комплекси Zn-білок); та/або неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як TM TM TWEEN , PLURONICS або поліетиленгліколь (ПЕГ). Фармацевтичні композиції хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, залежать від їхніх фармацевтичних властивостей; наприклад, у випадку невеликих хімічних сполук, таких, наприклад, як бортезоміб, можна застосовувати наступну препаративну форму: а) Препаративна форма у вигляді таблетки (волога грануляція): № 1. 2. 3. 4. 5. 40 45 Інгредієнти Сполука формули (I) Лактоза безводна DTG Sta-Rx 1500 Мікрокристалічна целюлоза Стеарат магнію Всього 5 125 6 30 1 167 Мг/таблетку 25 100 105 30 6 6 30 30 1 1 167 167 500 150 30 150 1 831 Спосіб отримання: 1. Інгредієнти 1, 2, 3 та 4 змішують та гранулюють із застосуванням очищеної води. 2. Гранули сушать при температурі 50 °C. 3. Пропускають гранули через підходящий розмелюючий пристрій. 4. Додають інгредієнт 5 та перемішують протягом 3 хв; пресують на підходящому пресі. б) Препаративна форма у вигляді капсули: № 1. 2. 3. 4. 5. Інгредієнти Сполука формули (I) Лактоза водна Кукурудзяний крохмаль Тальк Стеарат магнію Всього 5 159 25 10 1 200 12 Мг/капсулу 25 100 123 148 35 40 15 10 2 2 200 300 500 --70 25 5 600 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб отримання: 1. Інгредієнти 1, 2 та 3 змішують у придатному міксері протягом 30 хв. 2. Додають інгредієнти 4 та 5 і перемішують протягом 3 хв. 3. Заповнюють відповідну капсулу. Відповідно до іншого варіанту здійснення винаходу фармацевтичні композиції відповідно до винаходу переважно представляють собою дві окремі препаративні форми, одна з яких включає вказане антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), а друга включає хіміотерапевтичні засоби, вибрані із групи. яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину. Діючі речовини можна включати в мікрокапсули, які отримують, наприклад, за допомогою способу коацервації або міжфазової полімеризації, наприклад, гідроксиметилцелюлози, або желатинових мікрокапсул та полі(метилметакрилатних) мікрокапсул, відповідно, у колоїдних системах для введення лікарських засобів (наприклад, ліпосомах, альбумінових мікросферах, мікроемульсіях, наночастинках та нанокапсулах) або в макроемульсії. Зазначені методи описані в Remington's Pharmaceutical Sciences, під ред. Osol A.E., 16-е видання, 1980. Можуть бути виготовлені препарати з уповільненим вивільненням. Прийнятними прикладами препаратів з уповільненим вивільненням є напівпроникні матриці із твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, зазначені матриці мають форму виробів певної конфігурації, наприклад, плівок або мікрокапсул. Прикладами матриць із уповільненим вивільненням є складні поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі(2-гідроксиетилметакрилат) або полі(вініловий спирт)), полілактиди (US 3773919), сополімери L-глутамінової кислоти та гаммаетил-L-глутамату, нерозкладний етиленвінілацетат, розкладні сополімери молочної та TM гліколевої кислоти, такі як LUPRON DEPOT (мікросфери, що вводяться за допомогою ін’єкцій, які складаються із сополімеру молочної та гліколевої кислоти та лейпролід ацетату), та полі-D-()-3-гідроксимасляна кислота. Препаративні форми, призначені для введення in vivo, повинні бути стерильними. Для цієї мети можна застосовувати фільтрацію через стерильні фільтруючі мембрани. Цей винахід також відноситься до способу лікування раку, який полягає в тому, що пацієнтові, який має потребу в такому лікуванні, вводять (I) вякості першого засобу антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), в ефективній кількості, та (II) в якості другого засобу один або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, в ефективній кількості. Цей винахід також відноситься до способу лікування раку, який полягає в тому, що пацієнтові, який має потребу в такому лікуванні, вводять (I) в якості першого засобу антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), в ефективній кількості, та (II) в якості другого засобу один або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, в ефективній кількості. У контексті цього опису поняття «пацієнт» переважно відноситься до людини, яка має потребу в лікуванні із застосуванням антитіла до CD20 типу II (наприклад, пацієнт, який страждає на рак, при якому відбувається експресія CD20), для будь-якої мети, та більш переважно до людини, яка має потребу в зазначеному лікуванні раку або передракового стану або ураження. Однак поняття «пацієнт» може також відноситись до тварин, які не належать до людини, переважно до ссавців, таких як, серед іншого, собаки, кішки, коні, корови, свині, вівці та примати, які не належать до людини. Винахід також відноситься до антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), призначеного для лікування раку, при якому відбувається експресія CD20, у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину. Винахід також відноситься до антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC), призначеного для лікування пацієнта, який страждає на рак, при якому відбувається експресія CD20, у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину. Винахід також відноситься до антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) та одного або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, для застосування з метою лікування раку, при якому відбувається експресія CD20. 13 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід також відноситься до антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) та одного або більше хіміотерапевтичних засобів, вибраних із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, для застосування з метою лікування пацієнта, що страждає на рак, при якому відбувається експресія CD20. Переважно вказане антитіло до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) представляє собою отримане за допомогою глікоінженерії гуманізоване антитіло B-Ly1. Переважно рак, при якому відбувається експресія CD20, представляє собою B-клітинну неходжкінську лімфому (НХЛ). Наведені нижче приклади, перелік послідовностей та фігури представлені з метою пояснення цього винаходу, справжній обсяг якого встановлений у доданій формулі винаходу. Є очевидним, що у наведені процеси можна вносити модифікації без відхилення від суті винаходу. Опис переліку послідовностей: SEQ ID NO: 1 - амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга (VH) мишачого моноклонального антитіла до CD20 B-Ly1. SEQ ID NO: 2 - амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга (VL) мишачого моноклонального антитіла до CD20 B-Ly1. SEQ ID NO: 3-19 - амінокислотні послідовності варіабельної області важкого ланцюга (VH) гуманізованих антитіл B-Ly1 (B-HH2 - B-HH9, B-HL8 та B-HL10 - B-HL17). SEQ ID NO: 20 - амінокислотні послідовності варіабельної області легкого ланцюга (VL) гуманізованого антитіла B-Ly1 B-KV1. Опис фігур: Фігура 1 а) Синергічна протипухлинна дія комбінованого лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) (BHH6-B-KV1 GE) з циклофосфамідом та вінкристином та б) порівняння з комбінованим лікуванням за допомогою антитіла до CD20 типу I (ритуксимаб) із циклофосфамідом та вінкристином на клітинній лінії WSU-DLCL2 (дифузна великоклітинна лімфома отримана в Державному університеті Уейна) B-клітинної неходжкінської лімфоми (НХЛ) людини. 3 На осі ординат відкладені середні значення обсягу пухлин [мм ] +/- IQR (міжквартильний розмах); на осі абсцис відкладені дні після ін'єкції пухлинних клітин. Позначення: A) плацебо (кружечки), Б) циклофосфамід (25 мг/кг) та вінкристин (0,25 мг/кг) один раз на тиждень (хрестики), В) ритуксимаб (30 мг/кг) один раз на тиждень (трикутники), Г) створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) один раз на тиждень (квадратики), Д) ритуксимаб (30 мг/кг) із циклофосфамідом (25 мг/кг) та вінкристином (0,25 мг/кг) один раз на тиждень (ромби) та Е) створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) із циклофосфамідом (25 мг/кг) та вінкристином (0,25 мг/кг) один раз на тиждень (знаки плюс); Фігура 2 Середня інтенсивність флуоресценції (СІФ, ліворуч на осі ординат) антитіла до CD20 типу I (Cy5-ритуксимаб = білий прямокутник) та антитіла до CD20 типу II (Cy5 - створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване B-Ly1 B-HH6-B-KV1 GE = чорний прямокутник) із застосуванням Rajiклітин (ATCC № CCL-86); Співвідношення здатності до зв'язування антитіла до CD20 типу I (ритуксимаб) та антитіла до CD20 типу II (B-HH6-B-KV1 GE), у порівнянні з ритуксимабом (відкладено праворуч на осі ординат); Фігура 3 а) Синергічна протипухлинна дія комбінованого лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) (BHH6-B-KV1 GE) із доксорубіцином та б) порівняння з комбінованим лікуванням за допомогою антитіла до CD20 типу I (ритуксимаб) із доксорубіцином на клітинній лінії RL фолікулярної неходжкінської лімфоми (НХЛ) людини. 3 На осі ординат відкладені середні значення обсягу пухлини [мм ] +/- IQR; на осі абсцис відкладені дні після ін'єкції пухлинних клітин. Позначення: A) плацебо (знаки плюс), Б) доксорубіцин (3 мг/кг) один раз на тиждень (хрестики), В) ритуксимаб (30 мг/кг) один раз на тиждень (трикутники), Г) створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) один раз на тиждень (квадратики), Д) ритуксимаб (30 мг/кг) з доксорубіцином (3 мг/кг) один раз на тиждень (ромби) та Е) створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване B 14 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) з доксорубіцином (3 мг/кг) один раз на тиждень (кружечки); Фігура 4 а) Синергічна протипухлинна дія комбінованого лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) (BHH6-B-KV1 GE) із циклофосфамідом та б) порівняння з комбінованим лікуванням за допомогою антитіла до CD20 типу I (ритуксимаб) із циклофосфамідом на клітинній лінії RL фолікулярної неходжкінської лімфоми (НХЛ) людини. 3 На осі ординат відкладені середні значення обсягу пухлини [мм ] +/- IQR; на осі абсцис відкладені дні після ін'єкції пухлинних клітин. Позначення: A) плацебо (кружечки), Б) циклофосфамід (50 мг/кг) один раз на тиждень (хрестики), В) ритуксимаб (30 мг/кг) один раз на тиждень (трикутники), Г) створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) один раз на тиждень (квадратики), Д) ритуксимаб (30 мг/кг) із циклофосфамідом (50 мг/кг) один раз на тиждень (ромби) та Е) створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване B-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE) (30 мг/кг) із циклофосфамідом (50 мг/кг) один раз на тиждень (знаки плюс). Експериментальні процедури Приклад 1 Протипухлинна активність комбінованого лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) (B-HH6-B-KV1 GE) із циклофосфамідом та вінкристином Протестовані засоби: Антитіло B-HH6-B-KV1 GE до CD20 типу II (= гуманізоване B-Ly1, створене за допомогою глікоінженерії B-HH6-B-KV1, див. WO 2005/044859 та WO 2007/031875) отримували у вигляді маткового розчину (концентрація 9,4 мг/мл) від фірми GlycArt, Шлірен, Швейцарія. Буфер для антитіла включав гістидин, трегалозу та полісорбат 20. Розчин антитіла розводили відповідним чином у ФСБ із маткового розчину перед ін'єкціями. Ритуксимаб отримували від фірми Hoffmann La Roche, Базель. Циклофосфамід та вінкристин купували у вигляді призначеної для клінічного застосування препаративної форми у фірми Baxter Oncology Gmb, Галлі, Німеччина або медак, фірма Gesellschaft fur klinische Spezialpraparate mbH, Гамбург, Німеччина, відповідно. Розчин виготовляли із відновленого маткового розчину. Клітинні лінії та умови культивування: Клітини людської B-клітинної неходжкінської лімфоми (НХЛ) лінії WSU-DLCL2 люб'язно надані фірмою Hoffmann-La Roche, Inc., Нутлей, штат Нью-Джерсі, США. Пухлинну лінію клітин, як правило, культивували в середовищі RPMI (фірма PAA, Laboratories, Австрія), до якого додавали 10 % фетальну бичачу сироватку (фірма PAA Laboratories, Австрія) та 2мМ Lглутаміну, при температурі 37 °C у насиченій вологою атмосфері з 5 % CO 2. Для трансплантації використовували клітини, отримані за допомогою 4 пасажів. Клітини насичували Матрігелем. Тварини: Самок мишей з важкою комбінованою імунною недостатністю (ВКІН) з уродженою відсутністю природних клітин-кілерів, яким при надходженні було 7-8 тижнів (куплених у фірми Charles River, Сульцфельд, Німеччина), поміщали у середовище, вільне від особливих патогенів, з добовим циклом, який складав 12 г світла/12 г темряви відповідно до затверджених правил (GV-Solas; Felasa; Tiersch). Протокол експериментального дослідження був перевірений та затверджений місцевою владою. Після того, як отримані тварини були витримані у карантині, частині тварин давали пройти акліматизацію протягом 1 тижня в нових умовах навколишнього середовища та піддавали обстеженню. Постійний моніторинг стану здоров'я проводили на регулярній основі. Тварини мали вільний доступ до корму (Provimi Kliba 3337) та води (підкисленої до p 2,5-3). Моніторинг: У тварин щодня контролювали клінічні симптоми та виявляли побічну дію. Дані моніторингу ваги тіла протягом усього експерименту фіксували двічі на тиждень, та обсяг пухлини визначали за допомогою кронциркуля. після визначення стадії. Лікування тварин: Лікування тварин починали в день рандомізації через 9 днів після трансплантації. Створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване антитіло до CD20 типу II B-HH6-B-KV1 GE або ритуксимаб водили у вигляді окремих засобів внутрішньовенно 7 раз на добу на 9, 15, 23, 30, 37, 44, 51 та 58 день досліду у встановленій дозі 30 мг/кг. Відповідне плацебо вводили в ці ж дні. Циклофосфамід та вінкристин вводили внутрішньовенно один раз на тиждень на 9, 15, 23, 15 UA 105361 C2 5 10 15 30, 37, 44, 51 та 58 день у дозі 25 мг/кг або 0,25 мг/кг, відповідно. У групах, які піддавали комбінованій терапії, обидва антитіла вводили через 24 години після хіміотерапевтичних засобів на 10, 16, 24, 31, 38, 45, 52 та 59 день. Оцінка інгібування росту пухлини in vivo: На 35-й день після трансплантації клітин було виявлено значне інгібування росту пухлини, що становило 73 %, 85 %, 66 %, 94 % або 90 % у тварин, яким вводили ритуксимаб, антитіло BHH6-B-KV1 GE до CD20, хіміотерапевтичні засоби, комбінацію хіміотерапевтичних засобів та антитіла до CD20 або комбінацію хіміотерапевтичних засобів та ритуксимаба відповідно, у порівнянні з контрольною групою. Наприкінці експерименту значно краще інгібування росту пухлини було виявлено у групі тварин, яких лікували комбінацією хіміотерапевтичних засобів/антитіла B-HH6-B-KV1 GE до CD20, у порівнянні з групою тварин, яких лікували комбінацією хіміотерапевтичних засобів/ритуксимабу. Наприкінці експерименту, на 64-й день після трансплантації клітин оцінювали дію різних варіантів лікування на основі значень уповільнення росту пухлини (T-C, де T означає середній час, у днях, необхідний для того, щоб розмір пухлини в групах, які піддавали лікуванню, досяг 3 заданого розміру у 1500 мм , а C означає середній час, у днях, необхідний для того, щоб розмір пухлини у контрольній групі досяг такого ж розміру). Результати узагальнені в наступній таблиці: Таблиця 3 Уповільнення росту пухлини в групах, які піддавали лікуванню, у порівнянні з контрольною групою, у днях Група 2 3 4 5 6 Склад (доза) Ритуксимаб (30 мг/кг) антитіло B-HH6-B-KV1 GE до CD20 (30 мг/кг) Циклофосфамід (25 мг/кг) Вінкристин (0,25 мг/кг) Циклофосфамід (25 мг/кг) Вінкристин (0,25 мг/кг) антитіло B-HH6-B-KV1 GE до CD20 (30 мг/кг) Циклофосфамід (25 мг/кг) Вінкристин (0,25 мг/кг) Ритуксимаб (30 мг/кг) Значення T - C (дні) 13 19 14 38 28 20 25 30 35 40 Приклад 2 Визначення співвідношення здатності до зв'язування з CD20 на Raji-клітинах (ATCC № CCL86) антитіла до CD20 типу II та ритуксимаба Raji-клітини (ATCC № CCL-86) підтримували в культурі в середовищі RPMI-1640 (фірма PanBiotech Gmb, № за кат. PO4-18500), що містить 10 % ФТС (фетальна теляча сироватка) (фірма Gibco, № за кат. 10500-064). Антитіло B-HH6-B-KV1 GE до CD20 типу II (створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване антитіло B-Ly1) та ритуксимаб мітили із застосуванням складного Cy5-моно-NHS-ефіру (фірма Amersham GE Healthcare, № за кат. PA15101) відповідно до інструкцій виробника. Для кон’югованого із Cy5 ритуксимаба виявлений рівень мічення, що становить 2,0 молекули Cy5 на антитіло. Для кон’югованого з Cy5 антитіла B-HH6-B-KV1 виявлений рівень мічення, що становить 2,2 молекули Cy5 на антитіло. Для визначення здатності до зв'язування та порівняння здатностей до зв'язування та механізму зв'язування обох антитіл створювали криві зв'язування (шляхом титрування кон’югованого з Cy5 ритуксимаба та кон’югованого з Cy5 антитіла B-HH6-B-KV1 GE) методом прямої імунофлуоресценції із застосуванням клітинної лінії Raji лімфоми Беркітта (ATCC № CCL-86). Аналізували середню інтенсивність флуоресценції (СІФ) у вигляді значень EC50 (50 % максимальної інтенсивності) для кон’югованого з Cy5 ритуксимаба та кон’югованого з Cy5 5 антитіла B-HH6-B-KV1 GE відповідно. 5×10 клітин на зразок офарблювали протягом 30 хв при температурі 4 °C. Потім клітини відмивали в культуральному середовищі. Для виключення загиблих клітин використовували фарбування йодидом пропідію (PI). Вимірювання здійснювали за допомогою пристрою FACSArray (фірма Becton Dickinson), для оцінки фарбування йодидом пропідію (PI) використовували пристрій Far Red A, а для оцінки Cy5 пристрій Red-A. Фігура 2 показує середню інтенсивність флуоресценції (СІФ) для зв'язування при EC50 (50 % 16 UA 105361 C2 5 максимальної інтенсивності) міченого за допомогою Cy5 антитіла B-HH6-B-KV1 GE (чорний прямокутник) та міченого за допомогою Cy5 ритуксимаба (білий прямокутник). Потім співвідношення здатностей до зв'язування з CD20 на Raji-клітинах (ATCC № CCL-86) розраховували за допомогою наступної формули: Співвідношення здатностей до зв'язування з CD20 на Raji-клітинах (ATCC № CCL-86) = СІФ (Cy5 - антитіло до CD20) рівень Cy5 - мічення (Cy5 - ритуксимаб )  СІФ (Cy5 - ритуксимаб ) рівень Cy5 - мічення (Cy5 - антитіло до CD20 ) СІФ (B - HH6 - B - KV1 ) рівень Cy5 - мічення (Cy5 - ритуксимаб )  = СІФ (Cy5 - ритуксимаб ) рівень Cy5 - мічення (B - HH6 - B - KV1 ) 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 207 2.2  = 433 2.0 = 0,44 Таким чином, для антитіла B-HH6-B-KV1 GE, яке є типовим представником антитіл до CD20 типу II , виявлена більш низька здатність до зв'язування, в порівнянні з ритуксимабом. Приклад 3 Протипухлинна активність комбінованого лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) (B-HH6-B-KV1 GE) із доксорубіцином Протестовані засоби: Антитіло B-HH6-B-KV1 GE до CD20 типу II (= гуманізоване B-Ly1, створене за допомогою глікоінженерії B-HH6-B-KV1, див. WO 2005/044859 та WO 2007/031875) отримували у вигляді маткового розчину (концентрація 9,4 мг/мл) від фірми GlycArt, Шлірен, Швейцарія. Буфер для антитіла включав гістидин, трегалозу та полісорбат 20. Розчин антитіла розводили відповідним чином у ФСБ із маткового розчину перед ін'єкціями. Ритуксимаб отримували від фірми Hoffmann La Roche, Базель. Доксорубіцин купували у вигляді призначеної для клінічного застосування препаративної форми у фірми Hexal, Хольцкірхен, Німеччина Розчин виготовляли з відновленого маткового розчину. Клітинні лінії та умови культивування: Клітини лінії RL фолікулярної неходжкінської лімфоми людини були люб'язно надані Д-ром Charles Dumontet, INSERM 590, Ліон, Франція. Пухлинну лінію клітин, як правило, культивували в середовищі RPMI (фірма PAA, Laboratories, Австрія), до якого додавали 10 % фетальної бичачої сироватки (фірма PAA Laboratories, Австрія) та 2мМ L-глутаміну, при темппературі 37 °C у насиченою вологою атмосфері з 5 % CO 2. Для трансплантації використовували клітини, отримані за допомогою 2 пасажів. Тварини: Самок мишей з важкою комбінованою імунною недостатністю (ВКІН) з уродженою відсутністю природних клітин-кілерів, яким при надходженні було 7-8 тижнів (купували у фірми Charles River, Сульцфельд, Німеччина), поміщали у середовище, вільне від особливих патогенів, з добовим циклом, що становив 12 годин світла/12 годин темряви, відповідно до затверджених правил (GV-Solas; Felasa; Tiersch). Протокол експериментального дослідження був перевірений та схвалений місцевою владою. Після того як, отримані тварини були витримані у карантині, частині тварин давали пройти акліматизацію протягом 1 тижня в нових умовах навколишнього середовища та піддавали обстеженню. Постійний моніторинг стану здоров'я проводили на регулярній основі. Тварини мали вільний доступ до корму (Provimi Kliba 3337) та води (підкисленої до p 2,5-3). Моніторинг: У тварин щодня контролювали клінічні симптоми та виявляли побічну дію. Дані моніторингу ваги тіла протягом усього експерименту фіксували двічі на тиждень та обсяг пухлини визначали за допомогою кронциркуля. після визначення стадії. Лікування тварин: Лікування тварин починали в день рандомізації через 14 днів після трансплантації. Створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване антитіло B-HH6-B-KV1 GE до CD20 типу II або ритуксимаб водили у вигляді окремих засобів внутрішньовенно 7 раз на добу на 14, 21, 28, 36 та 42 день досліду у встановленій дозі 30 мг/кг або 60 мг/кг. У ці ж дні вводили відповідне плацебо або доксорубіцин, які вводили внутрішньовенно один раз на тиждень у дозі 3 мг/кг. У групах, які піддавали комбінованій терапії, доксорубіцин водили внутрішньовенно один раз на тиждень на 15, 22, 29, 37 та 43 день у дозі 3 мг/кг, а ритуксимаб вводили групі, яку піддавали комбінованій терапії, внутрішньовенно один раз на тиждень у ці ж дні у дозі 30 мг/кг. 17 UA 105361 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 4 Протипухлинна активність комбінованого лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II із підвищеною антитілозалежною клітиноопосередкованою цитотоксичністю (ADCC) (B-HH6-B-KV1 GE) із циклофосфамідом у відношенні клітин лінії RL Протестовані засоби: Антитіло B-HH6-B-KV1 GE до CD20 типу II (= гуманізоване B-Ly1, створене за допомогою глікоінженерії B-HH6-B-KV1, див. WO 2005/044859 та WO 2007/031875) отримували у вигляді маткового розчину (концентрація 9,4 мг/мл) від фірми GlycArt, Шлірен, Швейцарія. Буфер для антитіла включав гістидин, трегалозу та полісорбат 20. Розчин антитіла розводили відповідним чином у ФСБ із маткового розчину перед ін'єкціями. Антитіло до CD20 типу I ритуксимаб отримували у вигляді маткового розчину (концентрація 10 мг/мл) від фірми Hoffmann La Roche, Базель, Швейцарія. Буфер містив полісорбат 80, хлорид натрію та цитрат натрію. Циклофосфамід купували у вигляді призначеної для клінічного застосування препаративної форми у фірми Baxter Oncology GmbH, Галлі, Німеччина або медак, фірма Gesellschaft fur klinische Spezialpraparate mbH, Гамбург, Німеччина, відповідно. Розчин виготовляли з відновленого маткового розчину. Клітинні лінії та умови культивування: Клітини лінії RL фолікулярної неходжкінської лімфоми людини культивували стандартним чином у середовище RPMI, до якого додавали 10 % фетальної бичачої сироватки та антибіотики. Клітини лінії RL вирощували в суспензії до утворення кластерів. Клітини на стадії експонентного росту вводили підшкірно мишам, які страждали ВКІН. Тварини: Досліди проводили на тваринах, які становили собою самок мишей, що страждали ВКІН, яким було по 6 тижнів, отриманих від фірми Charles River (Арбресль, Франція), які мали IPSOSстатус. Тварин утримували, принаймні, протягом 1 тижня перед ін'єкцією RL-клітин. У клітках розміщали по 5 тварин. Моніторинг: У тварин щодня контролювали клінічні симптоми та виявляли побічну дію. Дані моніторингу ваги тіла протягом усього експерименту фіксували двічі на тиждень та обсяг пухлини визначали за допомогою кронциркуля після визначення стадії. Критерії виключення тварин з дослідів були описані та затверджені місцевим комітетом із проведення дослідів на тваринах (Experimental Animal Committee). Лікування тварин: Лікування тварин починали в день рандомізації через 31 день після трансплантації. Створене за допомогою глікоінженерії гуманізоване антитіло B-HH6-B-KV1 GE до CD20 типу II, плацебо або ритуксимаб вводили тваринам внутрішньовенно один раз на тиждень у дозі 30 мг/кг (на 31, 38, 45 та 52 день). Циклофосфамід вводили в ці ж дні у дозі 50 мг/кг. Розчини антитіла виготовляли з маткового розчину безпосередньо перед застосуванням. Оцінка інгібування росту пухлин in vivo: На 66-й день після трансплантації клітин було виявлено значне інгібування росту пухлини, що становить 54 %, 8 5% або 91 % у тварин, яким вводили комбінації ритуксимаба та циклофосфаміда, антитіла B-HH6-B-KV1 GE до CD20 та ритуксимаба або антитіла B-HH6-B-KV1 GE до CD20 та циклофосфаміда. Таким чином, комбіноване лікування за допомогою антитіла BHH6-B-KV1 GE до CD20 та циклофосфаміду забезпечувало більш високий рівень протипухлинної дії, у порівнянні з лікуванням лише за допомогою циклофосфаміду. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 60 1. Застосування гуманізованого антитіла В-Lyl (B-HH6-B-KV1 GE), яке має варіабельну область важкого ланцюга (VH), яка представлена в SEQ ID NO: 7, та варіабельну область легкого ланцюга (VL), яка представлена в SEQ ID NO: 20, та яке є створеним за допомогою глікоінженерії, гуманізованим антитілом B Lyl, у якому принаймні 40 % або більше олігосахаридів в Fc-області є нефукозильованими, для приготування лікарського засобу для лікування раку, при якому відбувається експресія CD20, у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичними засобами, вибраними із групи, яка складається із циклофосфаміду, вінкристину та доксорубіцину, причому лікування за допомогою антитіла до CD20 типу II здійснюють у комбінації а) з циклофосфамідом і вінкристином, б) з доксорубіцином, 18 UA 105361 C2 5 в) з циклофосфамідом або г) з циклофосфамідом, вінкристином і доксорубіцином. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що рак, при якому відбувається експресія CD20, являє собою В-клітинну неходжкінську лімфому (НХЛ). 3. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що вводять один додатковий кортикостероїд. 4. Застосування за п. 3, яке відрізняється тим, що кортикостероїд являє собою преднізон. 19 UA 105361 C2 20 UA 105361 C2 21 UA 105361 C2 22 UA 105361 C2 23 UA 105361 C2 24 UA 105361 C2 25 UA 105361 C2 26 UA 105361 C2 27 UA 105361 C2 28