Гени дельта-8-десатурази, ферменти, що ними кодуються, та їх застосування

Реферат: Даний винахід належить до виділеної нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, що має десатуразну активність, при цьому зазначена послідовність кодує функціонально активний Δ8-десатуразний фермент, що використовує як субстрат ω6-ейкозадієнову кислоту або ω3-ейкозатриєнову кислоту. Також винахід належить до вектора експресії, що містить виділену нуклеїнову кислоту, клітини-хазяїна, що містить вектор UA 106212 C2 (12) UA 106212 C2 експресії, і до способу продукування Δ8-десатуразного ферменту і способу одержання поліненасиченої жирної кислоти. UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Цей винахід відноситься до виділених полінуклеотидів, що кодують дельта-8-десатуразу, до дельта-8-десатураз, що кодуються виділеними полінуклеотидами, векторам експресії, що містять виділені полінуклеотиди, клітинам-хазяям, що містять вектори експресії, і до способів одержання дельта-8-десатураз і поліненасичених жирних кислот. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Поліненасичені жирні кислоти (PUFA) беруть участь у правильному функціонуванні всіх живих організмів. Наприклад, PUFA є важливими складовими плазматичної мембрани клітини, у складі якої вони перебувають у вигляді фосфоліпідів. PUFA необхідні для нормального розвитку мозку у дітей, а також для утворення і відновлення тканин у дорослих ссавців. У біологічному синтезі PUFA беруть участь кілька типів ферментів, насамперед, десатурази і елонгази (див. Фіг. 1). Десатурази каталізують внесення ділянок ненасичення (наприклад, подвійних зв'язків) між атомами вуглецю в алкільному ланцюзі жирної кислоти в субстраті. Елонгази каталізують приєднання одиниці, що складається з двох атомів вуглецю, до субстрату жирної кислоти. Наприклад, лінолеву кислоту (LA, 18:2n-6) одержують з олеїнової кислоти (OA, 18:1n-9) за допомогою Δ12-десатурази. Ейкозадієнову кислоту (EDA, 20:2n-6) одержують з LA за допомогою Δ9-елонгази. Дихомо-γ-ліноленову кислоту (DGLA, 20:3n-6) одержують з EDA за допомогою Δ8-десатурази (див. Фіг. 1). Арахідонову кислоту (ARA, 20:4n-6) одержують з DGLA за допомогою Δ5-десатурази (див. Фіг. 1). У даній галузі техніки відомо декілька важливих PUFA з довгим ланцюгом. Наприклад, однієї з найбільш важливих PUFA з довгим ланцюгом є ейкозапентаєнова кислота (EPA). EPA міститься в грибах і жирах морських продуктів. Другою важливою PUFA з довгим ланцюгом є докозагексаєнова кислота (DHA). DHA часто міститься в риб'ячому жирі, а також її можна одержати шляхом виділення з тканини мозку ссавців. Третьою важливою PUFA з довгим ланцюгом є ARA. ARA міститься в міцеліальних грибах, а також її можна одержати шляхом виділення з тканин ссавців, включаючи тканини печінки та надниркова залоза. ARA, EPA і/або DHA можна одержати як за допомогою альтернативного ланцюжка перетворень Δ8-десатурази/Δ9-елонгази, так і за допомогою традиційного ланцюжка перетворень Δ6-десатурази (див. Фіг. 1). Раніше були ідентифіковані елонгази, що мають активність відносно жирних кислот як субстрат в класичному ланцюжку перетворень Δ6 для утворення PUFA з довгим ланцюгом, зокрема, ARA, EPA і DHA. У ході традиційного ланцюжка перетворень Δ6-десатурази, спрямованої на перетворення LA в DGLA і альфа-ліноленової кислоти (ALA) в ω3-ейкозатетраєнову кислоту (ω3-ETA), використовують Δ6-десатуразний фермент для перетворення LA у гамма-ліноленову кислоту (GLA) і ALA у стеаридонову кислоту (SDA), і C18-елонгазний фермент для перетворення GLA в DGLA і SDA в ω3-ETA. Проте, у деяких випадках ще кращим може бути альтернативний ланцюжок перетворень Δ8десатурази/Δ9-елонгази у порівнянні з традиційним ланцюжком перетворень Δ6-десатурази. Наприклад, якщо в ході одержання DGLA, ARA, ω3-ETA, EPA, ω3-докозапентаенової кислоти (DPA) і/або DHA є небажаним утворенням залишкових проміжних продуктів омега-6 або омега-3 жирних кислот, наприклад, GLA або SDA, можна застосовувати альтернативний шлях Δ8десатурази/Δ9-елонгази замість традиційного шляху Δ6-десатурази для того, щоб уникнути утворення GLA і SDA. Можливість застосування Δ8-десатураз у зазначеному ланцюжку перетворень обумовлена здатністю десатурувати молекулу жирної кислоти в положенні між восьмим і дев'ятим атомами вуглецю (нумерація здійснюється від карбоксильного кінця молекули) і їх здатністю, наприклад, каталізувати перетворення ω6-ейкозадієнової кислоти (EDA) в DGLA і/або ω3-ейкозатрієнової кислоти (ω3-ETrA) в ω3-ETA. Отже, у даній галузі техніки існує потреба в нових джерелах Δ8-десатураз, які можна застосовувати для одержання PUFA з довгим ланцюгом. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ В одному аспекті цей винахід відноситься до виділеної нуклеотидної кислоти або її фрагменту, що містить послідовність нуклеотидів, що кодує поліпептид, який має десатуразну активність, або комплементарну зазначеної послідовності, причому амінокислотна послідовність поліпептиду щонайменше на 55 % ідентична амінокислотній послідовності, що містить SEQ ID NO:29. Виділена нуклеиновая кислота або її фрагмент кодує функціонально активний фермент Δ8-десатуразу, що використовує як субстрат ω6-ейкозадієнову кислоту або ω3-ейкозатрієнову кислоту. Зазначену виділену послідовність нуклеинової кислоти можна одержувати з Emiliana huxleyi, краще, з Emiliana huxleyi CCMP 378. В іншому аспекті цей винахід відноситься до виділеної нуклеотидної послідовності або її фрагменту, що містить або комплементарній щонайменше 55 % нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30. Виділена нуклеотидна 1 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність або її фрагмент кодує функціонально активний фермент десатурази, що використовує як субстрат ω6-ейкозадієнову кислоту або ω3-ейкозатрієнову кислоту. Виділена нуклеотидна послідовність може містити послідовність, представлену в SEQ ID NO:28. Як альтернативний варіант, виділена нуклеотидна послідовність може містити послідовність, представлену в SEQ ID NO:30. Зазначену виділену нуклеотидну послідовність можна одержати з Emiliana huxleyi, краще, Emiliana huxleyi CCMP 378. В іншому аспекті цей винахід відноситься до вектора експресії. Зазначений вектор експресії згідно з цим винаходом містить нуклеотидну послідовність, функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю, причому нуклеотидна послідовність містить або комплементарна щонайменше 55 % нуклеотидній послідовності, вибраній з групи, що складається з SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30. У ще одному додатковому аспекті цей винахід відноситься до клітини-хазяїна, що містить описаний вище вектор експресії. Клітина-хазяїн може являти собою клітину еукаріот. Зокрема, клітину еукаріот вибирають із групи, що складається з: клітини ссавця, клітини комахи, клітини рослини і клітини гриба. Приклади що застосовуються клітин грибів включають клітини грибів, обрані з групи, що складається з: Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp. і Pichia spp. Приклади клітин рослин, що застосовуються, включають клітини рослин, обрані із групи, що складається з: клітин рослин сої, видів роду Brassica, сафлору, соняшника, кукурудзи, бавовни і льону. У ще одному аспекті цей винахід відноситься до клітини рослини, зерну рослини, рослині або тканині рослини, що містять описаний вище вектор експресії, при цьому експресія нуклеотидної послідовності вектора приводить до утворення кліткою рослини, зерном рослини рослиною або тканиною рослини щонайменше однієї поліненасиченої жирної кислоти. Поліненасичена жирна кислота, утворена зазначеним вектором експресії, вибрана із групи, що складається з: арахідонової кислоти (ARA), ейкозапентаєнової кислоти (EPA), докозагексаєнової кислоти (DHA), дихомо-гамма-ліноленової кислоти (DGLA) або ω3ейкозатетраєнової кислоти (ω3-ETA), а також комбінацій зазначених кислот. У ще одному аспекті цей винахід відноситься до однієї або більше рослинних олій або жирних кислот, утворених клітиною рослини, зерном рослини, рослиною або тканиною рослини, описаними вище. У ще одному аспекті цей винахід відноситься до очищеного поліпептиду, що кодується нуклеотидною послідовністю, що містить або комплементарною щонайменше 55 % нуклеотидній послідовності, вибраній із групи, що складається з: SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30. У ще одному аспекті цей винахід відноситься до очищеного поліпептиду, що десатурує поліненасичену жирну кислоту, довжина вуглецевого ланцюга якої становить 20 атомів вуглецю (C20-PUFA), яка використовується як субстрат, у положенні між 8 і 9 атомами вуглецю, і при цьому амінокислотна послідовність поліпептиду щонайменше на 55 % ідентична амінокислотній послідовності, що містить SEQ ID NO:29. У ще одному варіанті реалізації цей винахід відноситься до очищеного поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:29. У ще одному варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу одержання ферменту Δ8-десатурази. Зазначений спосіб включає етапи: a) виділення нуклеотидної послідовності, що містить або комплементарної щонайменше 55 % нуклеотидній послідовності, вибраній із групи, що складається з: SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30; b) конструювання вектора експресії, що містить виділену нуклеотидну послідовність згідно з етапом a), функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю; і c) введення вектора експресії в клітину - хазяїна на період часу і в умовах, достатніх для утворення ферменту Δ8-десатурази. У способі, описаному вище, клітина-хазяїн являє собою клітину еукаріот. Зокрема, зазначену клітину еукаріот вибирають із групи, що складається з: клітини ссавця, клітини комахи, клітини рослини і клітини гриба. Приклади що застосовуються клітин грибів включають клітини грибів, обрані із групи, що складається з: Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp. і Pichia spp. Приклади що застосовуються клітин рослин включають клітини рослин, обрані із групи, що складається з: клітин рослин сої, видів роду Brassica, сафлору, соняшника, кукурудзи, бавовни і льону. У ще одному варіанті реалізації цей винахід відноситься до способу одержання поліненасиченої жирної кислоти, що включає етапи: 2 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 a) виділення нуклеотидної послідовності, що містить або комплементарної щонайменше 55 % нуклеотидній послідовності, вибраній із групи, що складається з: SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30; b) конструювання вектора експресії, що містить виділену нуклеотидну послідовність згідно з етапом a), функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю; c) введення вектора експресії в клітину - хазяїна на період часу і в умовах, достатніх для утворення ферменту Δ8-десатурази; і d) приведення у взаємодію ферменту Δ8-десатурази із субстратом, обраним із групи, що складається з: ω6-ейкозадієнової кислоти, ω3-ейкозатрієнової кислоти, а також комбінацій зазначених кислот, для перетворення субстрату в одержувану поліненасичену жирну кислоту. У способі, описаному вище, одержувана поліненасичена жирна кислота являє собою дихомо-гамма-ліноленову кислоту (DGLA), ω3-ейкозатетраєнову кислоту (ω3-ETA) або будь-які комбінації зазначених кислот. Також, спосіб, описаний вище, додатково може включати етап: приведення у взаємодію одержуваної поліненасиченої жирної кислоти зі щонайменше однією додатковою десатуразою або елонгазою, для перетворення одержуваної поліненасиченої жирної кислоти в іншу або додаткову поліненасичену жирну кислоту. Одержувана в результаті поліненасичена жирна кислота являє собою арахідонову кислоту(ARA), ейкозапентаенову кислоту (EPA), докозапентаенову кислоту (DPA) або докозагексаєнову кислоту (DHA) або будь-яку комбінацію зазначених кислот. У ще одному аспекті цей винахід відноситься до способу одержання поліненасиченої жирної кислоти в клітині-хазяїні, що включає етапи: a) виділення нуклеотидної послідовності, що містить або комплементарної щонайменше 55 % нуклеотидній послідовності, вибраній із групи, що складається з: SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30; b) конструювання вектора експресії, що містить виділену нуклеотидну послідовність згідно з етапом a), функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю; c) введення вектора експресії згідно з етапом b) і щонайменше однією додатковою рекомбінантною ДНК конструкції, що містить виділену нуклеотидну послідовність, функціонально пов'язану із щонайменше однією регуляторною послідовністю, що кодує дельта9 елонгазу, у клітину - хазяїна; d) приведення у взаємодію експресованого ферменту Δ8-десатурази і дельта-9 елонгази із субстратом, обраним із групи, що складається з: лінолевої кислоти (LA), альфа-ліноленової кислоти (ALA) і комбінацій зазначених кислот, для перетворення субстрату в одержувану поліненасичену жирну кислоту. В описаному вище способі, одержувана поліненасичена жирна кислота являє собою дихомо-гамма-ліноленову кислоту (DGLA) або ω3-ейкозатетраєнову кислоту (ω3-ETA) або будьяку комбінацію зазначених кислот. описаний вище спосіб додатково може включати етап: приведення у взаємодію поліненасиченої жирної кислоти зі щонайменше однією додатковою десатуразою або елонгазою для перетворення одержуваної поліненасиченої жирної кислоти в іншу або додаткову поліненасичену амінокислоту. Одержувана поліненасичена жирна кислота являє собою арахідонову кислоту(ARA), ейкозапентаенову кислоту (EPA), докозапентаенову кислоту (DPA), докозагексаєнову кислоту (DHA) або будь-яку комбінацію зазначених кислот. У способі, описаному вище, клітина-хазяїн являє собою клітину еукаріот. Зокрема, клітину еукаріот вибирають із групи, що складається з: клітини ссавця, клітини комахи, клітини рослини і клітини гриба. Приклади що застосовуються клітин грибів включають клітини грибів, обрані із групи, що складається з: Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp. і Pichia spp. Приклади що застосовуються клітин рослин включають клітини рослин, обрані із групи, що складається з: клітин рослин сімейства бобових, видів роду Brassica, сафлору, соняшника, кукурудзи, бавовни і льону. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР На Фіг. 1 показаний шлях біологічного синтезу жирної кислоти і роль Δ8-десатурази в зазначеному шляху. На Фіг. 2A і 2B показане вирівнювання амінокислотної послідовності, що кодується ED3-8 (SEQ ID NO:29) з відомими Δ8-десатуразами Pavlova lutheri CCMP 459 (SEQ ID NO:2), Pavlova salina (SEQ ID NO:3), Euglena gracialis (SEQ ID NO:1) і Perkinsus (SEQ ID NO:4). Ідентичні залишки виділені, консервативні гістидинові бокси підкреслені, консервативна ділянка в домені цитохрому b5 підкреслений (подвійною рискою). 3 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 3A показані амінокислотні послідовності Δ8-десатурази Euglena gracialis (# доступу AF139720, SEQ ID NO:1). На Фіг. 3B показані амінокислотні послідовності Δ8-десатурази Pavlova lutheri CCMP 459 (SEQ ID NO:2). На Фіг. 4A показані амінокислотні послідовності Δ8-десатурази Pavlova salina (# доступу DQ995518, SEQ ID NO:3). На Фіг. 4B показані амінокислотні послідовності Δ8-десатурази Perkinsus marinus (# доступу DQ508730, SEQ ID NO:4). На Фіг. 4C показані амінокислотні послідовності Δ8-десатурази Acanthamoenba castellani (# доступу CS608483, SEQ ID NO:5). На Фіг. 5 показана послідовність ДНК (SEQ ID NO:11) клону ED3-8, отриманого у відповідності зі способом, описаним у Прикладі 2. Фіг. 6 показана розшифрована амінокислотна послідовність (SEQ ID NO:12) клону ED3-8 отриманого у відповідності зі способом, описаним у Прикладі 2. Фіг. 7A показана послідовність ДНК (SEQ ID NO:15) клону PK15 отриманого у відповідності зі способом, описаним у Прикладі 2. Фіг. 7B показана амінокислотна послідовність (SEQ ID NO:16) клону PK15, отриманого у відповідності зі способом, описаним у Прикладі 2. Фіг. 8A показана послідовність ДНК (SEQ ID NO:24) передбачуваного 3′-кінця клону ED3-8, отриманого у відповідності зі способом, описаним у Прикладі 2. Фіг. 8B показана амінокислотна послідовність (SEQ ID NOS:25 і Δ4-46, відповідно, у порядку появи) передбачуваного 3′-кінця клону ED3-8, отриманого у відповідності зі способом, описаним у Прикладі 2. На Фіг. 9 показана послідовність гена 1254 пари азотистих основ передбачуваної Δ8десатурази Emiliana huxleyi CCMP 378 (SEQ ID NO:28). На Фіг. 10 показаний білок, що містить у складі 417 амінокислот (SEQ ID NO:29), що кодується послідовністю гена, що містить 1254 пари азотистих основ, (SEQ ID NO:28) передбачуваної Δ8-десатурази Emiliana huxleyi CCMP 378. На Фіг. 11 показана послідовність гена, оптимізована відносно кодонів, передбачуваної Δ8десатурази Emiliana huxleyi CCMP 378 (SEQ ID NO:30), позначена "ED3-8-EP2-5-SC". ED3-8EP2-5-SC має 66,98 % ідентичності з вихідною послідовністю гена ED3-8 (SEQ ID NO:28; Фіг. 9). Жодна з модифікацій у складі гена, оптимізованого стосовно кодонів, не змінює амінокислотної послідовності білка, що кодується (SEQ ID NO:29; Фіг. 10). На Фіг. 12 показана послідовність гена Δ9-елонгази, отримана з Isochrysis galbana (IsoD9) (№ доступу CQ831422, SEQ ID NO:31). ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Цей винахід відноситься до нуклеотидних послідовностей (наприклад, нуклеотидних послідовностей гена) і трансльованих амінокислотних послідовностей гена Δ8-десатурази Emiliana sp., наприклад, Emiliana huxley, зокрема, Emiliana huxley CCMP 378. Далі, в обсяг цього винаходу включені галузі застосування гена і ферменту, що кодується зазначеним геном. Наприклад, нуклеотид і відповідний фермент можна застосовувати для одержання поліненасичених жирних кислот, наприклад, DGLA, ARA, EPA, ω3-ETA DPA і DHA або будь-яких комбінацій зазначених кислот, які можна включати до складу фармацевтичних композицій, харчових сполук та інших коштовних продуктів. A. Визначення Форми однини, що використовуються в цьому описі, включають також і множину позначуваних об'єктів, якщо в контексті чітко не зазначено зворотне. Для перерахування в межах обсягів числових значень, наведених у цьому описі, передбачається кожне проміжне значення з однаковим ступенем точності. Наприклад, в інтервалі 6-9, крім чисел 6 і 9, також передбачаються 7 і 8, а для інтервалу 6,0-7.0, явно передбачаються числа 6,0, 6,1, 6,2, 6.3, 6,4, 6.5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 і 7.0. a) Види роду Brassica Фраза "види роду Brassica", що використовується в цьому описі, відноситься до кожної з рослин: Brassica juncea, Brassica napus, Brassica carinata, Brassica oleracea, Brassica nigra і Brassica campestris. b) Химерна конструкція Термін "химерна конструкція", що використовується в цьому описі, відноситься до комбінації молекул нуклеїнових кислот, що не зустрічається в природному вигляді у природі. Відповідно, химерна конструкція може містити регуляторні послідовності і послідовності, що кодують, отримані з різних джерел, або регуляторні послідовності і послідовності, що кодують, отримані з 4 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одного джерела, але розташовані в порядку, що відрізняється від того, що зустрічається в природному вигляді у природі. c) Послідовність, що кодує Термін "послідовність, що кодує", що використовується у цьому описі, відноситься до послідовності ДНК, що кодує певну амінокислотну послідовність. Термін "регуляторні послідовністі" відноситься до нуклеотидних послідовностей, розташованих у 3'-5' напрямку (5′ послідовності, що не кодують), у складі послідовності, що кодує, або в 5'-3' напрямку (3′ послідовності, що не кодують) від послідовності, що кодує, що впливає на транскрипцію, процесінг та стабільність РНК, або на трансляцію відповідної послідовності, що кодує. Регуляторні послідовності можуть включати, але не обмежуються зазначеними: промотори, лідерні послідовності трансляції, інтрони та послідовності розпізнавання поліаденілювання d) Оптимізований відносно кодону Термін "оптимізований відносно кодону", що вживається відносно гена або молекули нуклеїнової кислоти, відноситься до гена або молекули нуклеїнової кислоти, частота використання кодонів яких пристосована для відтворення кращої частоти використання кодонів у клітині - хазяїні. e) Комплементарність Термін "комплементарність", що використовується у цьому описі, відноситься до ступеня відповідності між двома сегментами ДНК. Комплементарність визначають шляхом оцінки здатності нитки одного сегменту ДНК, яка кодує, гібридизуватися з ниткою іншого сегмента ДНК, яка не кодує, у відповідних умовах, з утворенням подвійної спіралі. У подвійній спіралі аденін перебуває у складі однією нитки, тимін перебуває у складі іншої нитки. Також, у тих положеннях, у яких у складі однією нитки перебуває гуанін, у складі іншої перебуває цитозин. Чим більше ступінь відповідності між нуклеотидними послідовностями двох сегментів ДНК, тим вище здатність утворювати гібридні дуплекси зазначеними двома сегментами ДНК. f) Що кодується, гібридизація і жорсткі умови Термін "що кодується", що використовується у цьому описі, відноситься до послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність поліпептиду, причому послідовність поліпептиду або її фрагмент містить амінокислотну послідовність, що складається щонайменше з трьох послідовних амінокислот, ще краще – щонайменше 8 послідовних амінокислот, найкраще - 15 послідовних амінокислот зі сполуки поліпептиду, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти. Також в обсяг цього винаходу входить виділена нуклеотидна послідовність, що кодує фермент, який має десатуразну активність у відношенні PUFA, що гібридизується у жорстких умовах з нуклеїнової кислотою, нуклеотидна послідовність якої містить або комплементарна нуклеотидній послідовності, що містить SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:30 (Див., Фіг. 9 і 11). Молекула нуклеїнової кислоти здатна "гібридизуватися" з іншою молекулою нуклеїнової кислоти, якщо молекула нуклеїнової кислоти в одноланцюговій формі може з'єднуватися з дугою молекулою нуклеїнової кислоти у відповідних температурних умовах і при відповідній іонній силі (Див., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)). Температурні умови та іонна сила визначають "твердість" гібридизації. Для "гібридизації" необхідно, щоб дві нуклеїнові кислоти містили комплементарні послідовності. Проте, залежно від твердості умов гібридизації, можуть виникати невідповідності в основах. Відповідна твердість умов гібридизації нуклеїнових кислот залежить від довжини нуклеїнових кислот і ступеня комплементарності. Зазначені параметри добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Зокрема, чим більше ступінь подібності або гомологічності двох нуклеотидних послідовностей, тим більша величина Tm відповідає гібридам нуклеїнових кислот, що містять зазначені послідовності. Для гібридів, довжина яких становить більше 100 нуклеотидів, були отримані рівняння для розрахунків Tm (Див., Sambrook et al., вище). Для гібридизації з більш короткою нуклеїновою кислотою, положення невідповідностей має більше значення, і довжина олігонуклеотида визначає його специфічність (Див., Sambrook et al., вище). Звичайно, жорсткими умовами вважаються такі умови, у яких концентрація солей становить менше приблизно 1,5 M іонів Na, звичайно приблизно від 0,01 до 1.0 M іонів Na (або інших солей) при pH від 7.0 до 8,3 і температурі щонайменше приблизно 30° C для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60° C для довгих зондів (наприклад, довжина яких становить більше 50 нуклеотидів). Жорсткі умови також можна створити шляхом додавання дестабілізуючих агентів, наприклад, формаміду. Приклад мінімально жорстких умов включає гібридизацію із застосуванням буферного розчину з 30-35 % формамідом, 1 M NaCl, 1 % SDS (додецилсульфат натрію) при 37° C, і відмиванням в 1× 5 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2×SSC (20×SSC=3,0 M NaCl/0,3 M тринатрієвим цитратом) при 50-55° C. Приклад помірковано жорстких умов включає гібридизацію в 40-45 % формаміді, 1 M NaCl, 1 % SDS при 37° C, і відмиванням в 0,5× to 1×SSC при 55-60° C. Приклад дуже жорстких умов включає гібридизацію у 50 % формаміді, 1 M NaCl, 1 % SDS при 37° C, і відмиванням в 0,1×SSC при 60-65° C. g) Екзон Термін "екзон", що використовується у цьому описі, відноситься до ділянки послідовності гена, який зазнає транскрипції і виявляється у складі зрілої інформаційної РНК, отриманої на основі гена, але, що не обов'язково є частиною послідовності, що кодує кінцевий продукт гена. h) Експресія, антисмислове інгібування і до-супресія Термін "експресія", що використовується у цьому описі, відноситься до утворення функціонально активного кінцевого продукту. Експресія гена включає транскрипцію гена і трансляцію мРНК у попередник зрілого білка. Вираження "антисмислове інгібування", що використовується в цьому описі, відноситься до утворення антисмислових транскриптів РНК, здатних придушувати експресію цільового білка. Термін "до-супресія", що використовується у цьому описі, відноситься до утворення смислових транскриптів РНК, здатних придушувати експресію ідентичних або, по суті, аналогічних сторонніх або ендогенних генів (Див. патент США № 5,231,020). i) Фрагмент або субфрагмент, що є функціонально еквівалентним Терміни "фрагмент або субфрагмент, що є функціонально еквівалентним" і "функціонально активний фрагмент або субфрагмент", що використовуються взаємозамінно в цьому описі, відносяться до фрагмента або субпослідовності молекули виділеної нуклеїнової кислоти, що зберігають здатність впливати на експресію гена або проявляти певний фенотип, незалежно від того, чи кодує зазначений фрагмент або субфрагмент активний фермент. Наприклад, фрагмент або субфрагмент можна застосовувати для розробки химерних конструкцій, призначених для одержання цільового фенотипу трансформованої рослини. Химерні конструкції можна розробляти з метою застосування для до-супресії або антисмислового інгібування шляхом приєднання фрагмента або субфрагмента нуклеїнової кислоти, незалежно від того, чи кодує він активний фермент, у відповідному положенні відносно промоторної послідовності рослини. j) Ген, нативний ген і трансген Термін "ген", що використовується у цьому описі, відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що експресує певний білок, включаючи регуляторні послідовності, що передують (5′ послідовності, що не-кодують) і наступні за (3′ послідовності, що не-кодують) послідовністю, що кодує. Вираження "нативний ген", що використовується в цьому описі, відноситься до гена, що виявляється в природі, разом з характерними для нього регуляторними послідовностями. Термін "трансген", що використовується у цьому описі, відноситься до гена, введеного до складу генома за допомогою процедури трансформації. k) Види роду Gossypium Вислів "види роду Gossypium", що вживається в цьому описі, відноситься до кожної з рослин Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Gossypium hirsutum, Gossypium hirsutum var hirsutum, Gossypium hirsutum var marie-galante, Gossypium lapideum, Gossypium sturtianum, Gossypium thuberi, Gossypium thurberi, Gossypium tomentosum або Gossypium tormentosum. l) Гомологія Терміни "гомологія", "гомологічний", “ по суті, аналогічний" і "по суті, що відповідає", використовуються взаємозамінно в цьому опису і відносяться до молекул нуклеїнових кислот, зміни в одній або більше нуклеотидних основах у складі яких не впливають на здатність молекули нуклеїнової кислоти опосередковувати експресію гена або впливати на прояв певного фенотипу. Зазначені терміни також відносяться до таких модифікацій молекул нуклеїнових кислот згідно з цим винаходом, як делеція або введення одного або більше нуклеотидів, по суті, що не впливають на функціональні властивості одержуваної молекули нуклеїнової кислоти у порівнянні з вихідною молекулою, що не містить змін. Отже, для фахівця в цій галузі техніки буде очевидно, що в обсяг цього винаходу входить більше однією зразкової визначеної послідовності. m) Клітина - хазяїн Вислів "клітина - хазяїн", що використовується в цьому описі, позначає клітину, що містить виділену послідовність нуклеїнової кислоти або її фрагмент, згідно з цим винаходом. Клітини – хазяї можуть являти собою клітини прокаріот (наприклад, Escherichia coli, ціанобактерії і Bacillus subtilis) або клітини еукаріот (наприклад, клітини грибів, комах, рослин або ссавців). 6 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прикладами клітин грибів, що придатні для застосування, є Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Trichoderma spp. і Pichia spp. Особливо кращими клітинами грибів є клітини Saccharomyces cerevisiae. Клітини рослин можуть являти собою клітини однодольних або дводольних рослин. Особливо кращими клітинами рослин є клітини Glycine max (наприклад, соя), видів роду Brassica, Carthamus tinctorius L. (наприклад, сафлор), Helianthus annuus (наприклад, соняшника), Zea mays (наприклад, кукурудза), видів роду Gossypium і Linum usitatissimum (наприклад, льон). n) Ідентичність, ідентичність послідовностей і відсоток ідентичності послідовностей (% ідентичності) Терміни "ідентичність" або "ідентичність послідовностей", що використовуються взаємозамінно в цьому описі в контексті нуклеотидних послідовностей або послідовностей поліпептидів, відносяться до однакових азотистих основ або амінокислотних залишків у складі двох послідовностей, при вирівнюванні на максимальну відповідність у певному вікні порівняння. Отже, ідентичність визначається ступенем подібності, відповідності або еквівалентності однакових ланцюгів (що кодують або не кодують) двох сегментів ДНК або поліпептидів. "Відсоток ідентичності послідовностей" або “% ідентичності" обчислюють у ході порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей на певній ділянці, шляхом визначення числа положень, у яких в обох послідовностях перебуває ідентична основа, для одержання числа відповідних положень, розподілу числа зазначених положень на загальне число положень у ділянці, що порівнюється, і множення результату на 100. Оптимальне вирівнювання послідовностей можна здійснювати за допомогою алгоритму Smith & Waterman, Appl. Math. 2:482 (1981), алгоритму Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), способу Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988) і за допомогою комп'ютерних програм, що застосовують відповідні алгоритми (наприклад, Higgins et al., CABIOS. 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, Wis.) or GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis.). (Див. патент США № 5,912,120). Придатні приклади відсотка ідентичності послідовностей включають, але не обмежуються зазначеними, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 %. Зазначені величини відсотка ідентичності можна визначати за допомогою кожної з програм, описаних у цій заявці. o) Прямо або опосередковано Термін "опосередковано", що використовується у цьому описі відносно застосування гена і відповідного йому ферменту для одержання поліненасичених жирних кислот, позначає перетворення першої кислоти в другу кислоту (тобто, наявність проміжного продукту шляху) за допомогою першого ферменту (наприклад, LA перетворюють в EDA, наприклад, за допомогою Δ9-елонгази), після чого другу кислоту перетворюють у третю кислоту за допомогою другого ферменту (наприклад, EDA перетворюють в DGLA наприклад, за допомогою Δ8-десатурази). Термін "прямо", що використовується у цьому описі відносно застосування гену і відповідного йому ферменту для одержання поліненасичених жирних кислот, позначає безпосереднє перетворення ферментом першої кислоти в другу кислоту, при цьому другу кислоту згодом застосовують у складі композиції (наприклад, перетворення LA в EDA наприклад, за допомогою Δ9-елонгази або ω3-ETrA в ω3-ETA наприклад, за допомогою Δ8десатурази). p) Інтрон Термін "інтрон", що використовується у цьому описі, відноситься до проміжної послідовності у складі гена, яка не кодує частину послідовності білка. Отже, зазначені послідовності транскрибуються в РНК, але після цього виключаються і не транслюються. Термін також застосовується для позначення виключених послідовностей РНК. q) Виділений Термін "виділений (виділена)”, що використовується у цьому описі, відноситься до молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) або білку і його ділянки, що має біологічну активність, витягнуту з природного оточення або джерела, за допомогою стандартних методик, відомих у цій галузі техніки (наприклад, з бактерії, водорості, гриба, рослин, хребетних, ссавців, і т.д.). 7 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Виділені молекули нуклеїнових кислот або білки є, по суті, або головним чином вільними від компонентів, у нормальних умовах супутніх або взаємодіючих з молекулами нуклеїнових кислот або білків у їх природному оточенні. r) Фрагмент виділеної нуклеїнової кислоти або послідовність виділеної нуклеїнової кислоти Вислови "фрагмент виділеної нуклеїнової кислоти" або “ послідовність виділеноїнуклеїнової кислоти", що використовуються в цьому описі, відносяться до одно- або дволанцюгового полімеру РНК або ДНК, що, можливо, містить синтезовані, не природні або змінені азотисті основи. Фрагмент виділеної нуклеїнової кислоти у формі полімеру ДНК може включати один або більше сегментів кДНК, геномної ДНК або синтезованої ДНК. ("Фрагмент" певного полінуклеотида відноситься до послідовності полінуклеотида, що включає безперервну послідовність, довжина якої становить щонайменше приблизно 10 послідовних нуклеотидів щонайменше приблизно 15 послідовних нуклеотидів щонайменше приблизно 20 послідовних нуклеотидів, і т.д., ідентичної або комплементарної ділянці зазначеної нуклеотидної послідовності.) Для нуклеотидів (що звичайно перебувають у формі їх 5′-монофосфатів) використані їх наступні однолітерні позначення: "A" для аденілату або дезоксиаденілату (для РНК або ДНК, відповідно), "C" для цитидилату або дезоксицитидилату, "G" для гуанілату або дезоксигуанілату, "U" для уридилату, "T" для дезокситимідилату, "R" для пуринів (A або G), "Y" для піримідинів (C або T), "K" для G або T, "H" для A або C або T, "I" для інозину і "N" для будьякого нуклеотиду. s) Зрілий і попередник Термін "зрілий", що використовується у цьому описі відносно терміну "білок", відноситься до поліпептиду, що пройшов пост-трансляційні модифікації; тобто, до білка, зі складу якого вилучили всі пре- або пропептиди, що присутні в первинному продукті трансляції. Термін "попередник", що використовується у цьому описі відносно терміну "білок", відноситься до первинного продукту трансляції мРНК; тобто, у складі якого ще присутні пре- і пропептиди. Пре- і пропептиди можуть бути сигналами внутрішньоклітинної локалізації, але не обмежуються зазначеними. t) 3′ Не-кодуючі послідовності Вислів "3′-некодуючі послідовності", що використовується в цьому описі, відноситься до послідовностей ДНК, розташованих в 5' - 3' напрямку від послідовності, що кодує, і включає послідовності розпізнавання поліаденілювання та інші послідовності, що кодує сигнали регуляції, здатні впливати на процесінг мРНК або на експресію гену. Сигнал поліаденілювання часто характеризується впливом на внесення шляхів поліаденілової кислоти в 3′-кінець попередника мРНК. Застосування різних 3′-послідовностей, що не кодують, описано у Ingelbrecht, (1989) Plant Cell 1:671-680. u) Не-природний, що не зустрічається в природі Вислів "не природний" або "що не зустрічається в природі", що використовуються в цьому описі, відносяться до об'єкта, отриманого штучних шляхом, що не відповідає такому, який звичайно зустрічається в природі. v) Функціонально зв'язаний Вислів "функціонально зв'язаний", що використовується в цьому описі, відноситься до об'єднання послідовностей нуклеїнових кислот в одній молекулі нуклеїнової кислоти таким чином, що активність однієї послідовності регулюється іншою. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з послідовністю, що кодує, якщо він здатний регулювати експресію зазначеної послідовності, що кодує (тобто, транскрипція послідовності, що кодує, перебуває під контролем промотору). Послідовність, що кодує, може бути функціонально пов'язана з регуляторними послідовностями в орієнтації, що кодує або не кодує. В іншому прикладі, комплементарні ділянки РНК згідно з цим винаходом можна функціонально зв'язувати, прямо або опосередковано, з 5′-кінцем цільовий мРНК або 3′-кінцем цільової мРНК, або вводити її в межі цільової мРНК, або першу комплементарну ділянку можна приєднувати до 5′-кінця, а ділянку, комплементарну йому - до 3′-кінця цільової мРНК. w) Рослина Термін "рослина", що використовується у цьому описі, відноситься до цілих рослин, органів рослин, тканин рослин, насіння, клітин рослин, насінь і попередників усього перерахованого. Клітини рослин включають, без обмежень, клітини насінь, суспензії культур, ембріонів, ділянок меристеми, клітини калюса, листів, корінь, пагонів, гаметофітів, спорофітів, пилок і мікроспори. x) Полімеразна ланцюгова реакція або ПЦР Вислови "полімеразна ланцюгова реакція" або "ПЦР", що використовуються в цьому описі, відносяться до методики синтезу великої кількості специфічних сегментів ДНК, що складається з серій повторюваних циклів (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, Conn.). Звичайно, 8 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дволанцюгову ДНК руйнують при нагріванні, при низькій температурі приєднують два праймери, комплементарні 3′-границям сегмента – мішені, і потім послідовності подовжують при середніх значеннях температури. Один повтор трьох наведених послідовних етапів позначають як цикл. ПЦР являє собою ефективну методику, що застосовується для ампліфікації ДНК у мільйонах повторів, шляхом повторення реплікації матриці, за короткий період часу (Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Erlich et al, заявка на європейський патент 50,424; заявка на європейський патент 84,796; заявка на європейський патент 258,017, заявка на європейський патент 237,362; Mullis, заявка на європейський патент 201,184, Mullis et al, патент США № 4,683,202; Erlich, патент США № 4,582,788; і Saiki et al, патент США № 4,683,194). У ході процесу застосовують набір специфічних олігонуклеотидів, синтезованих in vitro, для початку синтезу ДНК. Структура праймерів залежить від цільових аналізованих послідовностей ДНК. Методику здійснюють у ході великої кількості циклів (звичайно 20-50) плавлення матриці при високій температурі, що дозволяють праймерам приєднається до комплементарних послідовностей матриці з наступною реплікацією матриці за допомогою ДНКполімерази. Продукти реакції ПЦР аналізують шляхом поділу в агарозному гелі з наступним фарбуванням бромідом етидію і візуалізацією за допомогою УФ просвічування. Як альтернативний варіант, у реакції ПЦР можна вносити радіоактивні дНТФ для включення міток у продукти. У цьому випадку продукти ПЦР візуалізують шляхом приведення гелю в контакт з рентгенівською плівкою. Додатковою перевагою внесення радіоактивних міток у продукти ПЦР є можливість кількісної оцінки рівнів окремих продуктів ампліфікації. y) Промотор і енхансер Термін "промотор", що використовується у цьому описі, відноситься до послідовності ДНК, здатної контролювати експресію послідовності, що кодує, або функціонально активної РНК. Послідовність промотору складається з проксимальних і більш віддалених в 3'-5' напрямку елементів, останні елементи часто позначають як енхансери. Термін "енхансер", що використовується у цьому описі, відноситься до послідовності ДНК, здатної стимулювати активність промотору і можливо, що є природним елементом промотору або гетерологічним елементом, введеним для підвищення рівня тканиноспецифічності промотору. Промоторна послідовність також може бути розташована всередині ділянок генів, що транскрибуються, і/або 5'-3' напрямку відносно генів, що транскрибуються. Промотори можуть цілком походити з нативного гену або складатися з різних елементів, отриманих з різних промоторів, що зустрічаються в природі, або навіть включати різні синтезовані сегменти ДНК. Фахівцям у цій галузі техніки слід розуміти, що різні промотори можуть контролювати експресію гена в різних типах тканин або клітин, або на різних стадіях їх розвитку або залежно від різних умов навколишнього середовища. Промотори, що стимулюють експресію гена в більшості типів клітин у більшості випадків, звичайно позначають як "конститутивні промотори". Постійно виявляються нові промотори різних типів, придатні для застосування в клітинах рослин; кілька прикладів можна знайти в компіляції, складеної Okamuro and Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Далі виявляється, що, оскільки в більшості випадків не були остаточно встановлені точні границі регуляторних послідовностей, деякі різновиди молекул ДНК можуть мати ідентичну промоторній активність. z) Рекомбінантний Термін "рекомбінантний", що використовується у цьому описі, відноситься до штучної комбінації двох сегментів послідовності, звичайно розташованих окремо, наприклад, шляхом хімічного синтезу або маніпуляцій з виділеними сегментами нуклеїнових кислот за допомогою методик генної інженерії. aa) Рекомбінантна конструкція, експресійна конструкція і рекомбінантна експресійна конструкція Вислів "рекомбінантна конструкція", "експресійна конструкція" і "рекомбінантна експресійна конструкція" використовуються взаємозамінно в цьому описі і відносяться до функціональної одиниці генетичного матеріалу, яку можна включати до складу генома клітини за допомогою стандартних методик, добре відомих фахівцеві в цій галузі техніки. Зазначену конструкцію можна застосовувати окремо або разом з вектором. У випадку застосування вектора, його вибирають у залежності від способу, що застосовується для трансформації рослин – хазяїв, як добре відомо фахівцеві в цій галузі техніки. Наприклад, можна застосовувати плазмідний вектор. Фахівець у цій галузі техніки добре обізнаний про генетичні елементи, присутність яких у складі вектора необхідна для успішної трансформації, селекції і розмноження клітин – хазяїв, що містять молекулу кожної з виділених нуклеїнових кислот згідно з цим винаходом. Також для фахівця в цій галузі техніки буде зрозуміло, що різні незалежні події трансформації приведуть до різних рівнів і характеру експресії (Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., 9 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), і, отже, слід розглянути велику кількість подій для одержання ліній, що представляють цільової рівень і характер експресії. Подібне скринінгове дослідження можна провести шляхом аналізу ДНК за допомогою Саузерн-блоттінга, аналізу експресії мРНК за допомогою Нозерн-блоттінга, аналізу експресії білка за допомогою Вестернблоттінга або аналізу фенотипу. bb) Транскрипт РНК, інформаційна РНК, кДНК, функціонально активна РНК і ендогенна РНК Вислів "транскрипт РНК", що використовується в цьому описі, відноситься до продукту, що утворюється в результаті транскрипції послідовності ДНК, яка каталізується РНК-полімеразою. Якщо транскрипт РНК являє собою абсолютно комплементарну копію послідовності ДНК, його позначають як первинний транскрипт, або він може являти собою послідовність РНК, отриману в результаті посттранскрипційного процесінга первинного транскрипту і позначатися як зріла РНК. Вислів "інформаційна РНК (мРНК)”, що використовується в цьому описі, відноситься до РНК, що не містить у складі інтронів і здатної транслюватися клітиною в білок. Термін "кДНК", що використовується у цьому описі, відноситься до ДНК, що є комплементарною і синтезованою на основі матриці мРНК за допомогою ферменту зворотної транскриптузи. Молекула кДНК може бути одноланцюговою або її можна перетворити у дволанцюгову форму за допомогою молекули полімерази I Кленова. "Смислова (що кодує)” РНК відноситься до траскрипту ДНК, що включає мРНК і здатному транслюватися в білок у клітині або in vitro. "Антисмислова (що не кодує) РНК" відноситься до транскрипту РНК, що є комплементарним повністю первинному транскрипту – мішені або його частині, і блокуючому експресію гена – мішені (патент США № 5,107,065). Антисмислова РНК може бути комплементарна будь-якій ділянці певного транскрипту гену, тобто, 5′ послідовності, що не кодує, 3′ послідовності, що не кодує, інтронам або послідовності, що кодує. Вислів "функціонально активна ДНК", що використовується в цьому описі, відноситься до антисмислової РНК, рибозимної РНК або РНК іншого типу, що ще не пройшла трансляцію, але, що впливає на процеси в клітині. Терміни "комплементарний ланцюг" і "зворотно комплементарний ланцюг" використовуються взаємозамінно в цьому описі стосовно транскриптів мРНК, і позначають антисмислову РНК транскрипту. Вислів "ендогенна РНК", що використовується в цьому описі, відноситься до будь-якої молекули РНК, що кодується будь-якою послідовністю нуклеїнової кислоти, що присутня у геномі хазяїна до трансформації за допомогою рекомбінантної конструкції згідно з цим винаходом, що як зустрічається, так і не зустрічається в природі, тобто, внесеної шляхом рекомбінації, мутагенезу, і т.д… cc) Подібність Термін "подібність", що використовується у цьому описі у відношенні "подібності" між двома амінокислотними послідовностями, білками або поліпептидами, відноситься до груп ідентичних, а також консервативних амінокислотних залишків, у складі обох послідовностей. Чим вище ступінь подібності між двома амінокислотними послідовностями, тим вище відповідність, подібність або еквівалентність двох послідовностей. dd) Стійка трансформація, тимчасова трансформація і трансформація Вислів "стійка трансформація", що використовується в цьому описі, відноситься до переносу молекули нуклеїнової кислоти в геном організму - хазяїна, включаючи як ядерний геном, так і геном, що присутній в органелах, що приводить до генетично стійкого наслідування. Навпаки, вислів "тимчасова трансформація", що використовується в цьому описі, відноситься до переносу молекули нуклеїнової кислоти в ядро або органелу організму - хазяїна, яка містить ДНК, що приводить до експресії гена без впровадження або стійкого наслідування. Організми – хазяї, що містять трансформовані молекули нуклеїнових кислот, позначають як "трансгенні" організми. Кращим способом трансформації клітин рису, кукурудзи та інших однодольних є застосування технології трансформації за допомогою прискорених частинок або "генної гармати" (Klein et al., (1987) Nature (London) 327:70-73; патент США № 4,945,050) або спосіб, що включає застосування агробактерій з відповідною Ti плазмідою, що несе трансген (Ishida Y. et al., (1996) Nature Biotech. 14:745-750). Термін "трансформація", що використовується у цьому описі, відноситься як до стійкої трансформації, так і до тимчасової трансформації. ee) Лідерна послідовність трансляції Вислів "лідерна послідовність трансляції", що використовується в цьому описі, відноситься до послідовності ДНК, розташованої між промоторною послідовністю гена і послідовністю, що кодує. Лідерна послідовність трансляції присутня в повністю процесованій мРНК в 3'-5' 10 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 напрямку від послідовності початку трансляції. Лідерна послідовність трансляції може впливати на процесінг первинного транскрипту в мРНК, стійкість мРНК або точність трансляції. Приклади лідерних послідовностей трансляції відомі (Turner, R. and Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225). Усі патенти, патентні публікації і пріоритетні документи, цитовані в цьому описі, повністю включені в цю заявку за допомогою посилання. B. Ген Δ8-десатурази і фермент, що кодується зазначеним геном Фермент, що кодується геном Δ8-десатурази, згідно з цим винаходом, необхідний для утворення поліненасичених жирних кислот (PUFA), що містять у складі, щонайменше, дві ділянки ненасиченості (подвійні зв'язки), повна довжина яких становить 20 атомів вуглецю або більше. Зокрема, фермент згідно з цим винаходом є функціонально активним (наприклад, має активність Δ8-десатурази), що означає, що він вносить подвійний зв'язок між атомом вуглецю номер 8 (C8) і атомом вуглецю номер 9 (C9) в PUFA, довжина ланцюга якої становить, щонайменше, 20 атомів вуглецю, і яка вже містить подвійні зв'язки в Δ9, Δ12 і/або Δ15 положеннях. Як показано на Фіг. 1, фермент, що кодується геном Δ8-десатурази, згідно з цим винаходом, утворює PUFA, довжина ланцюгів яких становить 20 атомів вуглецю або більше, у ході альтернативного шляху Δ8-десатурази/Δ9-елонгази. Субстрати, ω6-ейкозадієнова кислота, ω3-ейкозатрієнова кислота або обидві кислоти, ω6-ейкозадієнова і ω3-ейкозатрієнова, використовуються Δ8-десатуразою згідно з цим винаходом, у ході зазначеного шляху. Ген Δ8-десатурази згідно з цим винаходом, був виділений з генома Emiliana sp., точніше, Emiliana huxleyi, зокрема, Emiliana huxleyi CCMP 378. Нуклеотидна послідовність виділеного гена Δ8-десатурази з генома Emiliana huxleyi CCMP 378 показана на Фігурі 9 і в SEQ ID NO:28. Виділена нуклеотидна послідовність передбачуваної нуклеотидної послідовності, оптимізована стосовно кодонів, показана на Фігурі 11 і в SEQ ID NO:30. Виділена або очищена амінокислотна послідовність, що кодується SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30, показана на Фігурі 10 і в SEQ ID NO:29. Хімічне перетворення LA в DGLA і ALA в ω3-ETA за допомогою ферменту Δ9-елонгази і ферменту Δ8-десатурази називають альтернативним шляхом Δ8-десатурази/Δ9-елонгази. Класичний шлях Δ6 для перетворення LA в DGLA і ALA в ω3-ETA використовує фермент Δ6десатуразу для перетворення LA в GLA і ALA в SDA, і ген Δ6-елонгази для перетворення GLA в DGLA і SDA в ω3-ETA, відповідно. В обох шляхах, утворення ARA або EPA потім каталізується, наприклад, Δ5-десатуразою. DHA, наприклад, можна одержувати шляхом перетворення EPA в ω3-докозапентаєнову кислоту (DPA), і ω3-докозапентаєнову кислоту в DHA, з використанням, наприклад, C20-елонгази і Δ 4-десатурази, відповідно. Хоча, наприклад, DGLA, ARA, ω3-ETrA, ω3-ETA, EPA, DPA і/або DHA можна одержувати як за допомогою альтернативного шляху Δ8-десатурази/Δ9-елонгази, так і за допомогою класичного шляху Δ6, у деяких випадках альтернативний шлях Δ8-десатурази/Δ9-елонгази може бути ще кращим, ніж класичний шлях Δ6. Наприклад, якщо в ході одержання DGLA, ARA, ω3-ETrA, ω3-ETA, EPA, DPA і/або DHA, утворення побічних проміжних продуктів омега-6 або омега-3 жирних кислот, наприклад GLA або SDA, є небажаним, замість класичного шляху Δ6 можна застосовувати альтернативний шлях Δ8-десатурази/Δ9-елонгази, для того, щоб уникнути утворення GLA і SDA. Як було згадано вище, Δ8-десатураза є необхідним ферментом шляху Δ8-десатурази/Δ9елонгази. EPA, наприклад, не може бути синтезована в ході альтернативного шляху Δ8десатурази/Δ9-елонгази без гена Δ8-десатурази і ферменту, що кодується ним. Як показано на Фіг. 1, виділений фермент Δ8-десатураза згідно з цим винаходом перетворює, наприклад, EDA в DGLA і ω3-ETrA в ω3-ETA. Потім утворенням ω3-ETA з ω3-ETrA, і EPA з ω3-ETA каталізується, наприклад, Δ8-десатуразою і Δ5-десатуразою, відповідно. У результаті застосування альтернативного шляху Δ8-десатурази/Δ9-елонгази вдається уникнути утворення жирних кислот GLA і SDA. Також згідно з цим винаходом запропоновані виділені або очищені нуклеотидні послідовності (і відповідні білки, що кодуються ними), послідовності яких містять або комплементарні, щонайменше, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % нуклеотидів у послідовності (тобто, мають ідентичність із послідовністю), наведеній в SEQ ID NO:28 (виділена нуклеотидна послідовність Δ8-десатурази з генома Emiliana huxleyi CCMP 378) або SEQ ID NO:30 (виділена нуклеотидна послідовність Emiliana huxleyi CCMP 378, оптимізована стосовно кодонів). Зазначені послідовності можуть походити з організму людини або з інших організмів (наприклад, C. elegans або миші). 11 UA 106212 C2 5 10 15 Також в обсяг цього винаходу входять фрагменти і похідні, що містять або складаються з нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:30. Фрагменти, отримані на основі SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:30, можуть містити в складі від 10 до 1250 нуклеотидів, від 10 до 1000 нуклеотидів, від 10 до 750 нуклеотидів, від 10 до 500 нуклеотидів, від 10 до 250 нуклеотидів, від 10 до приблизно 100 нуклеотидів або від 10 до приблизно 50 нуклеотидів або від 15 до 40 нуклеотидів. В одному аспекті, фрагменти SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30 кодують поліпептид, що має Δ8-десатуразну активність. В іншому аспекті, фрагменти SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30 можна застосовувати як праймери і зонди. Способи створення праймерів і зондів добре відомі фахівцям у цій галузі техніки. Довжина зазначених праймерів і зондів може становити від 10 до 50 нуклеотидів, краще від 15 до 40 нуклеотидів. Також згідно з цим винаходом передбачені варіанти нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30. Зазначені варіанти можуть містити вставку, заміну або делецію однією або більше пар основ, і передбачається, що зазначені вставки, заміни або делеції не зачіпають жодного із трьох (3) високо консервативних "гістидинових боксів" у цитохром b5 – подібній ділянці, розташованій на 5′- кінці SEQ ID NO:29 (Див., Фіг. 2). Ділянки "гістидинових боксів" і цитохром b5 – подібна ділянка більш докладно описана в цій заявці у зв'язку з варіантами послідовності, наведеній в SEQ ID NO:29. Приклади варіантів нуклеотидних послідовностей, що входять в обсяг цього винаходу, наведені нижче, у Таблиці A. Таблиця А Заміна в послідовності/у кодоні (SEQ ID NO: 28) C73 =>T73 /CAT =>TAT A674 =>G674 /AAC =>AGC A1001 =>T1001 /CAC =>CTC C1230 => T1230 /GGC =>GGT T65 =>C65 /GTC =>GCC C73 =>T73 /CAT =>TAT A674 =>G674 /AAC =>AGC A1001 =>T1001 /CAC =>CTC A1037 =>G1037 /AAC =>AGC C73 =>T73 /CAT =>TAT T84 =>C84 /GCT =>GCC A674 =>G674 /AAC =>AGC A698 =>G698 /AAC =>AGC A1001 =>T1001 /CAC =>CTC G1059 =>A1059 /TCG =>TCA C73 =>T73 /CAT =>TAT A674 =>G674 /AAC =>AGC T851 =>C851 /GTC =>GCC A1001 =>T1001 /CAC =>CTC 20 25 30 35 Також в обсяг цього винаходу входять нуклеотидні послідовності, отримані з інших джерел і, що мають описану вище комплементарність або відповідність послідовності, наведеній в SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:30. Функціональні аналоги послідовності, наведеної в SEQ ID NO:28 або SEQ ID NO:30 (тобто, послідовності, що включають Δ8-десатуразу) також входять в обсяг цього винаходу. Також в обсяг цього винаходу входять нуклеотидні послідовності або їх фрагменти, що мають Δ8-десатуразну активність, причому амінокислотна послідовність зазначеного поліпептиду щонайменше на 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентична амінокислотній послідовності, наведеній в SEQ ID NO:29. Зазначені послідовності можуть походити як з організму людини, так і з інших джерел (наприклад, C. elegans або миші). Також цей винахід забезпечує виділений і/або очищений поліпептид, що десатурує поліненасичену жирну кислоту за допомогою внесення додаткового подвійного зв'язку в положенні між 8 і 9 атомами вуглецю (що означає, що зазначений поліпептид має Δ8 12 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 десатуразну активність) у складі жирної кислоти, що містить щонайменше 20 атомів вуглецю ділянка ненасиченості у атома вуглецю в 9 положенні, і щонайменше на 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % подібна з або ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO:29 (показаної на Фіг. 10). Зокрема, цей винахід забезпечує виділений поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, наведену в SEQ ID NO:29. Також цей винахід забезпечує фрагменти поліпептиду, що містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:29. Довжина зазначених фрагментів може залишати 10-400 послідовних амінокислот, 10-300 послідовних амінокислот, 10-200 послідовних амінокислот, 10-100 послідовних амінокислот, 10-50 послідовних амінокислот, 10-40 послідовних амінокислот або 10-30 послідовних амінокислот, 10-20 амінокислот. Зазначені фрагменти можна застосовувати, наприклад, як імуногени для одержання антитіл. Також, зазначені фрагменти можна застосовувати як специфічні учасники зв'язування для одного або більше імунологічних аналізів. Також цей винахід забезпечує варіанти поліпептиду, що містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:29. Зазначені варіанти можуть містити вставку, заміну або делецію однією або більше пар основ, і передбачається, що зазначені вставки, заміни або делеції не зачіпають жодного з трьох (3) високо консервативних "гістидинових боксів" у цитохром b5 – подібній ділянці, розташованій на 5′- кінці SEQ ID NO:29 (Див., Фіг. 2). Гістидинові бокси розташовані в 155-160 (HDYLH (SEQ ID NO:32)), 197-201 (HNTHH (SEQ ID NO:33)) і 355-359 (QTEHH (SEQ ID NO:34)) амінокислотних положеннях SEQ ID NO:29 (Див., Фіг. 2). Цитохром b 5 – подібна ділянка на 5′-кінці містить консервативний мотив зв'язування гену HPGG (38-41 амінокислотні положення SEQ ID NO:29) (Див., Фіг. 2). Цитохром b5 – подібна ділянка зустрічається в складі декількох ферментів десатураз, пов'язаних з мембраною "переднім кінцем", наприклад, Δ6-Δ5- і Δ 4-десатурази, що беруть участь в утворенні PUFA з довгими ланцюгами (Див., Napier J A et al. (2003) Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 68:135-43). Вважається, що цитохром b5 функціонує як донор електронів для зазначеним ферментів у ході реакції десатурації, і порушення в зазначеній галузі можуть привести до втрати або зміни ферментативної активності (Див., Sayanova O et al (1999) Plant Physiol. 121:641-646; Guillou H. et al (2004) J Lipid Res. 45: 3240). Приклади варіантів нуклеотидних послідовностей, що входять в обсяг цього винаходу, наведені нижче, у Таблиці B. Таблиця В Заміна амінокислоти (SEQ ID NO: 29) H25 =>Y25 N224 =>S224 H334 =>L334 V22 =>A22 H25 =>Y25 N224 =>S224 H334 =>L334 N346 =>S346 H25 =>Y25 N224 =>S224 N233 =>S233 H334 =>L334 H25 =>Y25 N224 =>S224 V284 =>A284 H334 =>L334 35 C. Одержання ферменту Δ8-десатурази Після виділення і/або очищення послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, гена), що кодує фермент Δ8-десатуразу, її можна вносити в клітину – хазяїна, як прокаріотичну, так і 13 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 еукаріотичну, за допомогою вектора або конструкції. Вектор, наприклад, бактеріофаг, косміда або плазміда, може містити нуклеотидну послідовність, що кодує фермент Δ8-десатуразу, а також будь-яку регуляторну послідовність (наприклад, промотор), що є функціонально активними в клітині – хазяїні і здатними стимулювати експресію ферменту Δ8-десатурази, що кодується нуклеотидною послідовністю. Регуляторна послідовність перебуває у функціональній взаємодії або функціонально пов'язана з нуклеотидною послідовністю. (Регуляторну послідовність називають "функціонально зв'язаною" з послідовністю, що кодує, якщо регуляторна послідовність впливає на транскрипцію або експресію послідовності, що кодує.) Приклади відповідних промоторів включають, але не обмежуються зазначеними: промотори генів, що кодують алкогольдегідрогеназу, гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогеназ, фосфоглюкоізомеразу, фосфогліцераткіназу, кислотну фосфатазу, T7, TPI, лактазу, металотіонеїн, предранний білок цитомегаловірусу, кислий білок сироватки, глюкоамілазу, і промотори, що активуються в присутності галактози, наприклад, GAL1 і GAL10. Також, до складу вектора можна включати нуклеотидні послідовності, що кодують інші білки, ферменти (наприклад, Δ9-елонгазу), олігосахариди, ліпіди, і так далі, а також інші регуляторні послідовності, наприклад, сигнал поліаденілювання (наприклад, сигнал полі-A антигену SV-40T, овальбумін або гормон росту великої рогатої худоби). Вибір послідовностей для включення до складу конструкції залежить від цільових продуктів експресії, а також від природи клітини – хазяїна. Як було згадано вище, після конструювання вектора його можна ввести в цільову клітину – хазяїна за допомогою способів, відомих середньому фахівцеві в цій галузі техніки, включаючи, наприклад, спосіб трансфекції, трансформації та електропорації (Див., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Після цього клітину – хазяїна культивують у відповідних умовах генів, що забезпечують експресію, яка веде до утворення цільової PUFA, яку потім відновлюють і очищають за допомогою рутинних методик, відомих у цій галузі техніки. Приклади відповідних клітин прокаріот включають, але не обмежуються зазначеними: клітини бактерій, наприклад, Escherichia coli, Bacillus subtilis, а також клітини ціанобактерій, наприклад, Spirulina spp. (тобто, синьо-зелених водоростей). Клітини еукаріот включають, але не обмежуються зазначеними: клітини ссавців, клітини комах, клітини рослин або клітини грибів. Клітини грибів включають, але не обмежуються, зазначеними: Saccharomyces spp., Candida spp., Lipomyces spp., Yarrowia spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Neurospora spp., Kluyveromyces spp., Hansenula spp., Trichoderma spp. або Pichia spp. Зокрема, клітина гриба може бути клітиною дріжджів, включаючи, але не обмежуючись зазначеними: Saccharomyces spp., Candida spp., Hansenula spp. і Pichia spp. Клітина дріжджів також може бути клітиною Saccharomyces cerevisiae. Клітини рослин включають, але не обмежуються зазначеними: клітини Glycine max (наприклад, сої), видів роду Brassica, Carthamus tinctorius L. (наприклад, сафлору),Helianthus annuus (наприклад, соняшника), Zea mays (наприклад, кукурудзи), видів роду Gossypium і Linum usitatissimum (наприклад, льону). Експресію клітини – хазяїна можна здійснювати в тимчасовій або стійкій формі. Тимчасову експресію можна здійснювати за допомогою внесених конструкцій, що містять сигнали експресії, функціонально активні в клітині – хазяїні, але зазначені конструкції не репліціюються і рідко інтегруються в клітину – хазяїн, або в клітині, що не проліферується. Також тимчасову експресію можна здійснювати шляхом стимулювання активності регульованого промотору, функціонально пов'язаного з цільовим геном, хоча зазначені системи, що індукуються, часто проявляють низький основний рівень експресії. Стійка експресія забезпечується шляхом внесення конструкції, здатної інтегруватися в геном клітини – хазяїна, або, що автономно репліціюється в клітині – хазяїні. Селекцію за ознакою стійкої експресії цільового гена можна проводити за допомогою селективного маркера, що перебуває у складі або трансфіціюється разом з експресійною конструкцією, з наступною селекцією клітин, що експресують маркер. Якщо стійку експресію здійснюють шляхом інтегрування, сайт інтегрування конструкції в геномі хазяїна може бути випадковим, або можна здійснювати спрямоване інтегрування шляхом застосування конструкцій, що містять області гомології з геномом хазяїна, достатні для спрямованої рекомбінації з локусом генома хазяїна. Якщо конструкції направляють на ендогенний локус, усі або деякі ділянки, що регулюють транскрипцію і трансляцію, можуть бути отримані з ендогенного локусу. Також експресію ферменту Δ8-десатурази і, в остаточному підсумку, цільової (цільових) PUFA, можна проводити за допомогою трансгенного ссавця. Зокрема, після створення описаної вище конструкції, її можна вносити в пронуклеус зародка. Після цього зародок можна імплантувати у самку – реципієнта. Як альтернативний варіант можна застосовувати метод 14 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 переносу ядра (Schnieke et al., Science 278:2130-2133 (1997)). Після цього забезпечують проходження процесів дозрівання і народження (Див., наприклад, патент США № 5,750,176 і патент США № 5,700,671). Молоко, тканина або інші рідкі зразки, отримані від потомства, будуть містити підвищені рівні PUFA відносно нормальних рівнів вмісту в організмі не трансгенної тварини. Можна спостерігати наступні покоління для виявлення утворення змінених або підвищених рівнів PUFA і, отже, включення гена, що кодує цільової фермент десатуразу, у їх геноми. Як хазяїв можна використовувати таких ссавців, як, наприклад, миша, пацюк, кролик, свиня, коза, вівця, кінь і корова. Проте, можна використовувати будь-яких інших ссавців, за умови, що існує можливість введення ДНК, що кодує цільової фермент, у геном зазначених ссавців. Для експресії поліпептиду Δ8-десатурази, функціонально активні ділянки ініціації і терминації транскрипції і трансляції функціонально зв'язують з ДНК, що кодує поліпептид десатурази. Ділянки ініціації і термінації транскрипції і трансляції одержують із різних загальнодоступних джерел, включаючи ДНК, що експресується, гени, для яких відома або передбачається здатність до експресії в цільовій системі, вектори експресії, хімічний синтез або одержання з ендогенного локусу в клітині – хазяїні. У деяких випадках існує можливість експресії в тканині і/або частини рослини, зокрема, якщо тканина або частина рослини дозрівають рано, наприклад, насіння, листи, фрукти, квіти, коріння і т.д… Експресію можна здійснювати в зазначеній частині рослини шляхом застосування певної регуляторної послідовності, наприклад, описаної в патентах США № 5,463,174, 4,943,674, 5,106,739, 5,175,095, 5,420,034, 5,188,958 і 5,589,379. Як альтернативний варіант, білок, що експресується, може являти собою фермент, що утворює продукт, який можна вводити, як прямо, так і за допомогою подальших модифікацій, у рідку складову, одержувану з рослини – хазяїна. Експресія гена Δ8-десатурази або антисмислових транскриптів Δ8-десатурази здатна змінювати рівні визначених PUFA або їх похідних, що виявляються в частинах і/або тканинах рослини. Ділянка, що кодує поліпептид Δ8-десатурази, можна експресувати як окремо, так і разом з іншими генами (наприклад, з геном, що кодує Δ9-елонгазу, геном, що кодує Δ5-десатуразу, геном, що кодує Δ17-десатуразу, геном, що кодує Δ5-елонгазу і/або геном, що кодує Δ4десатуразу), для одержання тканин і/або частин рослини з високим вмістом цільових PUFA, або поєднання PUFA у складі яких має більшу подібність з грудним молоком людини (Див., WO 95/24494). Ділянку термінації можна одержувати з 3′-ділянки гена, з якої одержували ділянку ініціації, або іншого гена. Відомо про задовільне функціонування великої кількості ділянок термінації в різних хазяїнах, що належать до одного і того ж або до різних родів і видів. Звичайно ділянку термінації вибирають скоріше з міркувань зручності, ніж на основі якої-небудь певної властивості. Як було згадано вище, рослина (наприклад, Glycine max або Brassica napus (canola)) або тканину рослини також можна використовувати як хазяїн або клітину – хазяїн, відповідно, для експресії ферменту Δ8-десатурази, який, у свою чергу, можна використовувати, наприклад, для одержання поліненасичених жирних кислот. Зокрема, цільові PUFA можна експресувати у насінні. Способи виділення олій з насінь відомі в цій галузі техніки. Отже, на додаток до одержання джерела PUFA, на компоненти олії з насінь можна впливати шляхом експресії гена Δ8-десатурази, а також генів елонгази (наприклад, Δ9-елонгази, Δ5-елонгази, і т.д.) і генів інших десатураз (наприклад, Δ5- десатурази, Δ17- десатурази, Δ4-десатурази, і т.д.), для одержання олій з насінь, які можна включати до складу харчових композицій, фармацевтичних композицій, їжі для тварин і косметичних засобів. Крім того, вектор, що містить послідовність ДНК, що кодує Δ8-десатуразу, функціонально пов'язану з промотором, вносять у тканину рослини або рослину, на період часу і в умовах, достатніх для експресії гена Δ8-десатурази. Вектор також може включати один або більше генів, що кодують інші ферменти, наприклад, Δ4-десатуразу, Δ5десатуразу, Δ6- десатуразу, Δ10- десатуразу, Δ12- десатуразу, Δ15- десатуразу, Δ17десатуразу, Δ19- десатуразу, Δ9-елонгазу, Δ6-елонгазу і/або Δ5-елонгазу. Тканина рослини або рослина може забезпечувати відповідний субстрат для дії ферментів, або в тканину рослини, клітину рослини або рослину можна вносити вектор, що кодує ферменти, що забезпечують зазначений субстрат. Також, субстрат можна наносити на тканини рослини, у яких здійснюється експресія відповідних ферментів. За допомогою різних наведених методик можна робити PUFA шляхом застосування клітини рослини, тканини рослини або рослини. Слід зазначити, що в обсяг цього винаходу також входить трансгенна рослина, що містить описаний вище вектор, експресія нуклеотидної послідовності вектора в якому приводить до утворення поліненасиченої жирної кислоти, наприклад, у насіннях трансгенної рослини. 15 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відтворення, розвиток і культивування рослин, отриманих з трансформантів одного протопласта рослини або з різних трансформованих експлантатів, добре відомо в цій галузі техніки (Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc. San Diego, Calif., (1988)). Зазначене відтворення і процес росту у звичайному випадку включають етап селекції трансформованих клітин, культивування зазначених окремих клітин у ході звичайних стадій ембріонального розвитку до стадії проростка, що має коріння. Трансгенні зародки і насіння відтворюються подібним чином. Отримані в результаті зародки, що мають коріння, саджають на відповідне середовище для росту рослин, наприклад, у ґрунт. Процеси розвитку або відтворення рослин, що містять сторонній, екзогенний ген цільової білок, що кодує, добре відомі в цій галузі техніки. Краще, рослини проходять самозапилення для одержання гомозиготних трансгенних рослин. Іншим шляхом є перехресне запилення рослин, що виросли з насіння, з агрономічно значимих ліній за допомогою пилку, отриманого від вторинної генерації рослин. І навпаки, пилок, отриманий від рослин зазначених агрономічно значимих ліній, застосовують для запилення рослин вторинної генерації. Трансгенну рослину згідно з цим винаходом, що містить цільовий поліпептид, культивують за допомогою способів, відомих фахівцеві в цій галузі техніки. Існує безліч способів відтворення рослин із тканини рослини. Конкретний спосіб відтворення буде залежати від вихідної тканини рослини і певних видів рослин, призначених для відтворення. Способи трансформації дводольних, у першу чергу, шляхом застосування Agrobacterium tumefaciens, і одержання трансгенних рослин, були опубліковані на прикладі бавовни (патент США № 5,004,863, патент США № 5,159,135, патент США № 5,518,908); соєвих (патент США № 5,569,834, патент США № 5,416,011, Mccabe et. al., Bio/Technology 6:923 (1988), Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)); Brassica (патент США № 5,463,174); арахісу (Cheng et al., Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996), Mckently et al., Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)); папайї; і гороху (Grant et al., Plant Cell Rep. 15:254-258, (1995)). Також описана трансформація однодольних за допомогою методу електропорації, бомбардування частинками і за допомогою агробактерій. Трансформацію та відтворення рослин вдалося здійснити на аспарагусі (Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:5354, (1987)); ячмені (Wan and Lemaux, Plant Physiol 104:37 (1994)); Zea mays (Rhodes et al., Science 240:204 (1988), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990), Fromm et al., Bio/Technology 8:833 (1990), Koziel et al., Bio/Technology 11: 194, (1993), Armstrong et al., Crop Science 35:550557 (1995)); вівсі (Somers et al., Bio/Technology 10:15 89 (1992)); еже сборной (Horn et al., Plant Cell Rep. 7:469 (1988)); рисі (Toriyama et al., Theorappl. Genet. 205:34, (1986); Part et al., Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, (1996); Abedinia et al., Aust. J. Plant Physiol. 24:133-141 (1997); Zhang and Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835 (1988); Zhang et al. Plant Cell Rep. 7:379, (1988); Battraw and Hall, Plant Sci. 86:191-202 (1992); Christou et al., Bio/Technology 9:957 (1991)); житі (De la Pena et al., Nature 325:274 (1987)); цукровому очереті (Bower and Birch, Plant J. 2:409 (1992)); tall fescue (Wang et al., Bio/Technology 10:691 (1992)) і пшениці (Vasil et al., Bio/Technology 10:667 (1992); патент США № 5,631,152). Були розроблені методи аналізу експресії гена на основі тимчасової експресії клонованих конструкцій нуклеїнових кислот, що застосовують введення молекул нуклеїнових кислот у клітини рослин за допомогою обробки поліетиленгліколем, електропорації або бомбардування частинками (Marcotte et al., Nature 335:454-457 (1988); Marcotte et al., Plant Cell 1:523-532 (1989); McCarty et al., Cell 66:895-905 (1991); Hattori et al., Genes Dev. 6:609-618 (1992); Goff et al., EMBO J. 9:2517-2522 (1990)). Системи з тимчасовою експресією можна застосовувати для функціонального розрізування генних конструкцій (Див., загалом, Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Слід розуміти, що кожну з молекул нуклеїнових кислот згідно з цим винаходом можна постійно або тимчасово вводити в клітину рослини у комбінації з іншими генетичними елементами, наприклад, з векторами, промоторами, енхансерами і т.д… У доповнення до описаного вище способу фахівцям, що практикують, добре відомі стандартні джерела матеріалу, що описують певні умови і способи для конструювання, маніпулювання та виділення макромолекул (наприклад, молекул ДНК, плазмід і т.д.), створення рекомбінантних організмів і скринінгу та виділення клонів (Див., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, N.Y. (1997)). 16 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як випливає з описаного вище, в обсяг цього винаходу також входять способи одержання ферменту Δ8-десатурази. Зазначені способи включають етапи: 1) виділення нуклеотидної послідовності, що містить, або щонайменше на 55 % комплементарна нуклеотидній послідовності, вибраній із групи, що складається з: SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30; 2) конструювання вектора експресії, що містить зазначену нуклеотидну послідовність; і 3) введення зазначеного вектора в клітину – хазяїна на період часу і в умовах, достатніх для утворення ферменту Δ8-десатурази. Також в обсяг цього винаходу входять способи одержання поліненасичених жирних кислот. В одному аспекті, спосіб включає: 1) виділення нуклеотидної послідовності, що містить, або щонайменше на 55 % комплементарної нуклеотидній послідовності, вибраній із групи, що складається з: SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30; 2) конструювання вектора експресії, що містить нуклеотидну послідовність з етапу 1), функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю; 3) введення зазначеного вектора в клітину – хазяїна на період часу і в умовах, достатніх для утворення ферменту Δ8-десатурази; і 4) приведення експресованого ферменту Δ8-десатурази у взаємодію з субстратом, обраним із групи, що складається з: ω6-ейкозадієнової кислоти, ω3ейкозатрієнової кислоти або як ω6-ейкозадієнової кислоти, так і ω3-ейкозатрієнової кислоти, для перетворення субстрату в першу одержувану поліненасичену жирну кислоту. Прикладами поліненасичених жирних кислот, які можна одержувати на першому етапі за допомогою зазначеного способу, є DGLA, ω3-ETA або як DGLA, так і ω3-ETA. Далі, спосіб включає етап(и) приведення у взаємодію першої отриманої поліненасиченої жирної кислоти принаймні з однією десатуразою або щонайменше з однією елонгазою і, можливо, повтор етапу (а саме, приведення у взаємодію поліненасиченої жирної кислоти, отриманої на другому або наступному етапі, з десатуразою або елонгазою (які можуть бути тими ж десатуразою і елонгазою, які застосовували на попередньому етапі, або будь-якими іншими)) для перетворення першої отриманої поліненасиченої жирної кислоти (наприклад, DGLA і/або ω3-ETA) у другу або наступну поліненасичену жирну кислоту (наприклад, третю, четверту, п'яту, шосту, і т.д.). Зазначений етап можна повторювати будь-яку необхідну кількість разів, для одержання цільової поліненасиченої жирної кислоти. Наприклад, якщо першою одержуваною поліненасиченою жирною кислотою являється DGLA, спосіб далі може включати приведення DGLA у взаємодію з Δ5-десатуразою з утворенням ARA (другої одержуваної поліненасиченої жирної кислоти, що утворюється як другий продукту). Можливе наступне приведення ARA у взаємодію з Δ17десатуразою з утворенням EPA (третьої одержуваної поліненасиченої жирної кислоти). Далі, можливе наступне приведення EPA у взаємодію з Δ5-елонгазою з утворенням DPA (четвертої одержуваної поліненасиченої жирної кислоти). Далі, можливе наступне приведення DPA у взаємодію з Δ4-десатуразою з утворенням DHA (п'ятої одержуваної поліненасиченої жирної кислоти). В іншому аспекті, спосіб включає: 1) виділення нуклеотидної послідовності, що містить, або щонайменше на 55 % комплементарна нуклеотидній послідовності, вибраній із групи, що складається з: SEQ ID NO:28 і SEQ ID NO:30; 2) конструювання вектора експресії, що містить нуклеотидну послідовність згідно з етапом 1), функціонально пов'язану з регуляторною послідовністю; 3) введення вектора згідно з етапом 2) і щонайменше однією додатковою рекомбінантною сконструйованою ДНК, що містить виділену нуклеотидну послідовність, функціонально зв'язану щонайменше з однією регуляторною послідовністю, що кодує Δ9елонгазу (Див., наприклад, патентну публікацію США № 2008/0214667, у якій описують виділену нуклеотидну послідовність, що кодує Δ9-елонгазу) у клітину - хазяїна; і 4) приведення експресованого ферменту Δ8-десатурази і Δ9-елонгази у взаємодію із субстратами, обраними із групи, що складається з: LA, ALA або LA і ALA, для перетворення субстрату в першу поліненасичену жирну кислоту. Прикладами поліненасичених жирних кислот, які можна одержувати на першому етапі за допомогою зазначеного способу, є DGLA, ω3-ETA або як DGLA, так і ω3-ETA. Зазначений спосіб може додатково включати етап(и) приведення у взаємодію першої отриманої поліненасиченої жирної кислоти щонайменше з однією десатуразою або щонайменше з однією елонгазою і, можливо, повтор етапу (а саме, приведення у взаємодію другої або наступної отриманої поліненасиченої жирної кислоти з десатуразою або елонгазою (які можуть бути тими ж десатуразою і елонгазою, які застосовували на попередньому етапі, або будь-якими іншими)) для перетворення першої отриманої поліненасиченої жирної кислоти, (наприклад, DGLA і/або ω3-ETA) у другу або наступну (наприклад, третю, четверту, п'яту, шосту, і т.д.), одержувану поліненасичену жирну кислоту. Зазначений етап можна повторювати будь-яку необхідну кількість разів, для одержання в цільової поліненасиченої жирної кислоти. Наприклад, якщо першою одержуваною поліненасиченою жирною кислотою являється DGLA, спосіб далі може включати приведення 17 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 DGLA у взаємодію з Δ5-десатуразою з утворенням ARA (другої одержуваної поліненасиченої жирної кислоти). Можливе наступне приведення ARA у взаємодію з Δ17-десатуразою з утворенням EPA (третьої одержуваної поліненасиченої жирної кислоти). Далі, можливе наступне приведення EPA у взаємодію з Δ5-елонгазою з утворенням DPA (четвертої одержуваної поліненасиченої жирної кислоти). Далі, можливе наступне приведення DPA у взаємодію з Δ4-десатуразою з утворенням DHA (п'ятої одержуваної поліненасиченої жирної кислоти). Отже, відповідно до описаного вище, Δ8-десатуразу згідно з цим винаходом можна застосовувати для одержання поліненасичених жирних кислот, які, у свою чергу, можуть бути корисні для певних цілей, або для одержання інших поліненасичених жирних кислот. D. Застосування гена Δ8-десатурази Як було згадано вище, виділений ген Δ8-десатурази і фермент Δ8-десатураза, що ним кодується, мають безліч галузей застосування. Наприклад, ген і відповідний йому фермент можна прямо або опосередковано застосовувати для одержання поліненасичених жирних кислот, наприклад, Δ8-десатуразу можна застосовувати для одержання DGLA, ARA, EPA, ω3ETrA, ω3-ETA, DPA і/або DHA. Зазначені поліненасичені жирні кислоти (тобто, кислоти, прямо або опосередковано отримані завдяки активності ферменту Δ8-десатурази) можна включати до складу, наприклад, харчових композицій, фармацевтичних композицій, косметичних засобів і кормів для тварин, усі перераховані застосування включені в обсяг цього винаходу. Зазначені галузі застосування докладно описані нижче. E. Живильні композиції Цей винахід забезпечує живильні композиції. Зазначені композиції, у контексті цього винаходу, включають будь-яку їжу або препарат, призначені для застосування людиною, включаючи ентеральне або паренетеральне застосування, які, при потраплянні в організм, (a) служать для харчування або побудови тканин або запасу енергії і/або (b) підтримують, відновлюютьабо зберігають відповідний харчовий статус або метаболічну функцію. Живильна композиція згідно з цим винаходом включає щонайменше одну олію або кислоту, отримані при прямому або опосередкованому застосуванні гена Δ8-десатурази, описаного в цій заявці, відповідно до цього винаходу, і, що перебуває або у твердій, або в рідкій формі. Також, композиція може включати харчові макронутрієнти, вітаміни і мінерали в кількостях, що відповідають певній галузі застосування. Кількість зазначених складових буде змінюватися залежно від того, чи призначена композиція для застосування здоровішими дітьми в нормальному стані, дітьми або дорослими, що мають особливі потреби, наприклад, пов'язані з певним станом метаболізму (наприклад, з порушеннями метаболізму). Приклади макронутрієнтів, що придатні для включення до складу композиції, включають, але не обмежуються зазначеними: харчові жири, вуглеводи й білки. Приклади зазначених харчових жирів включають, але не обмежуються зазначеними: кокосову олію, соєву олію та моно- і дигліцериди. Приклади зазначених вуглеводів включають, але не обмежуються зазначеними: глюкозу, харчову лактозу і гідролізований крохмаль. Також, приклади білків, які можна застосовувати в складі харчової композиції згідно з цим винаходом, включають, але не обмежуються зазначеними: білки сої, сироватку, піддану елекродиалізу, знежирене молоко, піддане електродиалізу, сироватку молока або гідролізати зазначених білків. Відносно вітамінів і мінералів, до складу живильних композицій згідно з цим винаходом можна додавати наступні: кальцій, фосфор, калій, натрій, хлор, магній, марганець, залізо, мідь, цинк, селен, йод, а також вітаміни A, E, D, C і вітаміни комплексу B. Також можна додавати інші подібні вітаміни і мінерали. Компоненти, що застосовуються в складі харчових композицій згідно з цим винаходом, повинні перебувати в очищеній або частково очищеній формі. Під частково очищеною розуміють речовину, отримана шляхом очищення природного матеріалу або шляхом синтезу. Приклади харчових композицій згідно з цим винаходом включають, але не обмежуються зазначеними: суміші для дітей, дієтичні добавки, харчові замінники і композиції для відновлення водного балансу. Харчові композиції, що представляють особливий інтерес, включають, але не обмежуються зазначеними: композиції, що застосовуються для ентерального і парентерального годування дітей, спеціалізовані суміші для дітей, харчові добавки для людей похилого віку і харчові добавки для осіб, що страждають захворюваннями шлунково-кишкового тракту і/або порушенням усмоктування. Харчову композицію згідно з цим винаходом також можна додавати до їжі у випадках, коли не потрібне доповнення дієти. Наприклад, композицію можна додавати до будь-якої їжі, включаючи, але не обмежуючись зазначеними: маргарини, модифіковані олії, сири, молоко, 18 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 йогурт, шоколад, солодощі, закуски, олії для салатів, кулінарні олії, кулінарні жири, м'ясо, рибу та напої. У кращому варіанті реалізації цього винаходу, харчова композиція являє собою харчовий продукт, призначений для ентерального застосування, ще краще, харчовий продукт, призначений для ентерального застосування дорослими або дітьми. Зазначену композицію можна вводити дорослим або дітям, що зазнають стрес або, що мають особливі потреби у зв'язку з хронічними або гострими хворобливими станами. Композиція може включати, на додаток до поліненасичених жирних кислот, зроблених відповідно до цього винаходу, макронутрієнти, вітаміни і мінерали, відповідно до описаного вище. Макронутрієнти можуть міститися в кількостях, еквівалентних кількостям, що присутні у молоці людини або в перерахуванні на енергію, що міститься, тобто, у перерахуванні на калорії, що містяться. Способи створення рідких або твердих харчових сумішей, призначених для ентерального і парентерального введення, добре відомі в цій галузі техніки. Наприклад, сполуку, призначену для ентерального введення, можна стерилізувати і згодом застосовувати як готову для споживання (RTF) або зберігати у формі концентрованої рідини або порошку. Порошок можна виготовляти шляхом сушіння розпиленням сполуки, приготовленої відповідно до описаного вище, і відновлення його шляхом регідратування концентрату. Харчові сполуки, призначені для застосуваннями дорослими і дітьми, добре відомі в цій галузі техніки та комерційно доступні (наприклад, Сімілак®, Еншур®, Джевіті® і Аліментум®, Ross Products Division, Abbott Laboratories, Columbus, Ohio). До кожної із зазначених сполук можна додавати олію або кислоту, отримані відповідно до цього винаходу. Енергетична щільність харчових композицій згідно з цим винаходом, що перебувають у рідкій формі, може варіювати приблизно від 0,6 ккал приблизно до 3 ккал на мл. Харчові добавки, складені у твердій або порошкоподібній формі, можуть містити приблизно від 1,2 до більше 9 ккал на грам, краще, приблизно від 3 приблизно до 7 ккал/г. У загальному випадку, осмолярність рідкого продукту повинна становити менше 700 міліосмоль, ще краще, менше 660 міліосмоль. Харчова сполука може включати макронутрієнти, вітаміни та мінерали, відповідно до описаного вище, на додаток до PUFA, отриманим відповідно до цього винаходу. Присутність зазначених додаткових складових допомагає задовольняти мінімальну щоденну потребу в зазначених елементах. На додаток до введення PUFA, також може бути бажаним додавання до складу композиції цинку, міді, фолієвої кислоти і антиоксидантів. Вважають, що зазначені речовини підтримують імунну систему, піддану стресу, і, отже, їх застосування приносить подальшу користь особі, що застосовує композицію. Зазначені елементи також можна додавати до складу фармацевтичної композиції. У ще кращому варіанті реалізації, харчова композиція містить, на додаток до антиоксидантів і щонайменше одній PUFA, джерело вуглеводів, при цьому щонайменше 5 відсотків вуглеводу за масою являє собою олігосахариди, що не засвоюється. У ще кращому варіанті реалізації, харчова композиція додатково містить білок, таурин і карнітин. Як було згадано вище, PUFA або їх похідні, отримані відповідно до цього винаходу, можна включати до складу дієтичних замінників або добавок, зокрема, дитячих сумішей, для пацієнтів, що перебувають на внутрішньовенному годуванні, або для запобігання або лікування виснаження або інших порушень або хворобливих станів. Як додаткова інформація, слід зазначити, що вміст жирних кислот у грудному молоці людини становить приблизно від 0,15 % приблизно до 0,36 % DHA, приблизно від 0,03 % приблизно до 0,13 % EPA, приблизно від 0,30 % приблизно до 0,88 % ARA, приблизно від 0,22 % приблизно до 0,67 % DGLA і приблизно від 0,27 % приблизно до 1,04 % GLA. Отже, такі жирні кислоти, як ARA, EPA і/або DHA, отримані відповідно до цього винаходу, можна застосовувати для зміни, наприклад, композиції дитячих сумішей для поліпшеного відтворення складової PUFA у грудному молоці людини або для зміни сполуки PUFA, звичайно присутньої в молоці ссавців, що не відносяться до роду людей. Зокрема, композиція, призначена для застосування у фармакології і як харчова добавка, краще буде містити одну або більше із ARA, EPA, DGLA, і DHA. Ще краще, олія буде включати приблизно від 0,3 до 30 % ARA і приблизно від 0,2 до 30 % DGLA. В обсяг цього винаходу входять харчові композиції, призначені для парентерального введення, що містять приблизно від 2 приблизно до 30 відсотків за масою жирних кислот у перерахуванні на тригліцериди. Можливо також включення інших жиророзчинних вітамінів, наприклад, вітамінів A, D, E і L-карнітина. За необхідністю, можна додавати такі консерванти, як альфа-токоферол, у кількості, що становить приблизно 0,1 % за масою. На додаток слід зазначити, що відношення вмісту ARA і DGLA можна варіювати залежно від певного кінцевого застосування. При оформленні композиції у вигляді замінника грудного 19 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молока, у композиції, що включає одну або більше із ARA, DGLA і GLA, відношення буде становити приблизно від 1:19:30 приблизно до 6:1:0,2, відповідно. Наприклад, відношення вмісту ARA:DGLA:GLA у грудному молоці тварин може варіювати від 1:19:30 до 6:1:0,2, що включає проміжні значення відношення, що краще становлять приблизно 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. При спільному одержанні в клітині – хазяїні, для точного контролю відношень вмісту PUFA можна застосовувати регулювання відношення і відсотка перетворення субстрату – попередника, наприклад, EDA і DGLA, в ARA. Наприклад, для одержання відношення вмісту ARA і DGLA, що становить приблизно 1:19, можна застосовувати відношення перетворення DGLA в ARA, що становить приблизно від 5 % до 10 %, тоді як для одержання відношення вмісту ARA і DGLA, що становить приблизно 6:1, можна застосовувати відношення перетворення приблизно від 75 % до 80 %. Отже, як у системі культури клітин, так і в організмі тварини – хазяїна, для модулювання рівнів і відносин PUFA можна застосовувати регуляцію експресії десатурази, а також експресії елонгаз (не обмежуючим прикладом є Δ9 елонгаза) та інших десатураз за часом, активності і специфічності. PUFA/кислоти, вироблені відповідно до цього винаходу (наприклад, ARA і EPA), згодом можна комбінувати з іншими PUFA/кислотами (наприклад, з DGLA) у бажаних концентраціях і відношеннях. Також, PUFA, отримані відповідно до цього винаходу, або клітини – хазяї, що містять їх, можна застосовувати як харчові добавки для тварин для зміни складової жирних кислот молока або тканини тварин на більш сприятливе для споживання тваринами або людиною. Приклади деяких харчових добавок, сумішей для дитячого харчування, харчових замінників та інших харчових розчинів, у яких можна застосовувати поліненасичені жирні кислоти, отримані відповідно до цього винаходу, описані нижче. I. СУМІШІ ДЛЯ ДИТЯЧОГО ХАРЧУВАННЯ A. Соєва суміш Ізоміл®, що містить залізо: Застосування: Як напій для новонароджених, дітей і дорослих, що страждають від алергії або чутливості до коров'ячого молока. Харчування для пацієнтів з порушеннями, при яких слід уникати вживання лактози: включаючи лактозну недостатність, нестерпність лактози і галактоземію. Опис: Ізолят соєвого білка, що застосовується для запобігання прояву симптомів алергії або чутливості до білка коров'ячого молока. Відсутність у складі лактози, для запобігання діареї, пов'язаної з вживанням лактози. Низька осмолярність (200 мосмоль/кг води). Парні вуглеводи (кукурудзяний сироп і сахароза), призначені для максимального підвищення усмоктування і зниження до мінімуму ризику розвитку порушення усмоктування. Сполука: 43,2 % суха кукурудзяна патока, 14,6 % ізолят білка сої, 1,5 % високомаслична олія сафлору, 10,3 % цукор (сахароза), 8,4 % соєва олію, 8,1 % кокосова олію: менше 2 %: фосфат кальцію, цитрат калію, хлорид калію, хлорид магнію, хлорид натрію, аскорбінова кислота, холіхлорид, L-метіонін, таурин, аскорбілпальмітат, сульфат заліза, м-інозитол, змішані токофероли, сульфат цинку, d-альфа-токоферил ацетат, L-карнітин, нікотинамід, пантотенат кальцію, сульфат міді, тіамінхлорид гідрохлорид, вітамін А-пальмітат, рибофлавін, піридоксину гідрохлорид, фолієва кислота, йодид калію, гідроксид калію, філохінон, біотин, селенат натрію, бета-каротінин, вітамін D3 і ціанокобаламін. B. Соєва суміш Ізоміл® DF, що застосовується при діареї: Застосування: Для дієтотерапії при діареї новонароджених і дітей 1-3 років. Опис: Перша дитяча суміш, що містить харчову клітковину, отриману на основі соєвої клітковини, призначена для терапії діареї. Клінічно доведена ефективність для зниження тривалості рідкого, водянистого випорожнення як при легкій, так і при важкій діареї новонароджених. Відсутність у складі лактози, для запобігання діареї, пов'язаної з вживанням лактози. Низька осмолярність (240 мосмоль/кг води) для зниження ризику осмотичної діареї. Сполука: 5,7 % вода, 4,8 % кукурудзяна патока, 2,6 % цукор (сахароза), 2,1 % соєва олія, 2,0 % ізолят соєвого білка, 1,4 % кокосова олія, 0,77 % соєва клітковина, цитрат кальцію, цитрат калію, фосфат кальцію, фосфат калію, хлорид калію, моно- і дигліцериди, соєвий лецитин, хлорид магнію, карагенан, аскорбінова кислота, L-метіонін, хлорид натрію, холінхлорид, таурин, сульфат заліза, м-інозитол, d-альфа-токоферил ацетат, сульфат цинку, L-карнітин, нікотинамід, пантотенат кальцію, сульфат міді, вітамін A-пальмітат, тіамінхлорид гідрохлорид, рибофлавін, піридоксину гідрохлорид, фолієва кислота, сульфат марганцю, йодид калію, філохінон, біотин, селеніт натрію, вітамін D3 і ціанокобаламін. 20 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 C. Соєва суміш Ізоміл® Едванс®, що містить залізо: Застосування: Як напій для новонароджених, дітей і дорослих, що страждають від алергії або чутливості до коров'ячого молока. Харчування для пацієнтів з порушеннями, при яких слід уникати вживання лактози: включаючи лактозну недостатність, нестерпність лактози і галактоземію. Опис: Містить DHA і ARA, дві живильні речовини, що входять до складу грудного молока, що мають значення для розумового розвитку та розвитку зорової системи. Ізолят соєвого білка, що застосовується для запобігання прояву симптомів алергії або чутливості до білка коров'ячого молока. Відсутність у складі лактози для запобігання діареї, пов'язаної з вживанням лактози. Низька осмолярність (200 мосмоль/кг води). Парні вуглеводи (кукурудзяний сироп і сахароза), призначені для максимального підвищення усмоктування і зниження до мінімуму ризику розвитку порушення усмоктування. Сполука: 43,2 % суха кукурудзяна патока, 14,6 % ізолят соєвого білка, 1,5 % високомаслична олія сафлору, 10,3 % цукор (сахароза), 8,4 % соєва олія, 7,7 % кокосова олія, олія C. cohnii, олія M. alpina, Фосфат кальцію, цитрат калію, хлорид калію, хлорид магнію, хлорид натрію, аскорбінова кислота, холінхлорид, L-метіонін, таурин, аскорбілпальмітат, сульфат заліза, мінозитол, змішані токофероли, сульфат цинку, d-альфа-токоферилацетат, L-карнітин, нікотинамід, пантотенат кальцію, сульфат міді, тіамінхлорид гідрохлорид, вітамін A-пальмітат, рибофлавін, піридоксину гідрохлорид, фолієва кислота, йодид калію, гідроксид калію, філохінон, біотин, селенат натрію, бета-каротінин, вітамін D3 і ціанокобаламін. D. Готова до застосування соєва суміш Ізоміл® Едванс® 20, що містить залізо, 20 кал/рідку унцію: Застосування: у випадках, коли бажаним є соєве харчування. Сполука: 85,9 % вода, 6,7 % кукурудзяна патока, 1,9 % ізолят соєвого білка, 1,4 % високомаслична олія сафлору, 1,3 % цукор (сахароза), 1,1 % соєва олія, 1,0 % кокосова олія, олія C. cohnii, олія M. alpina, цитрат кальцію, фосфат кальцію, цитрат калію, хлорид калію, моноі дигліцериди, соєвий лецитин, карагенан, аскорбінова кислота, L-метіонін, хлорид магнію, фосфат калію, хлорид натрію, холінхлорид, таурин, сульфат заліза, м-інозитол, d-альфатокоферилацетат, сульфат цинку, L-карнітин, нікотинамід, пантотенат кальцію, сульфат міді, вітамін A-пальмітат, тіамінхлорид гідрохлорид, рибофлавін, піридоксину гідрохлорид, фолієва кислота, сульфат марганцю, йодид калію, філохінон, біотин, селеніт натрію, вітамін D3 і ціанокобаламін. E. Суміш для дітей Сімілак®: Застосування: У випадках, коли потрібна суміш для дітей: якщо прийнято рішення про припинення грудного вигодовування до настання віку 1 рік, якщо існує потреба в добавці, крім грудного вигодовування, або якщо грудне вигодовування не підходить як регулярне годування. Порошок, концентрована рідина і форми, готові до вживання. Сполука: Вода, знежирене молоко, лактоза, високомаслична олія сафлору, соєва олія, кокосова олія, концентрат білка сироватки, цитрат калію, карбонат кальцію, аскорбінова кислота, соєвий лецитин, моногліцериди, карагенан, хлорид калію, хлорид магнію, сульфат заліза, холінхлорид, холінбітартрат, таурин, м-інозитол, сульфат цинку, нікотинамід, d-альфатокоферилацетат, пантотенат кальцію, L-карнітин, вітамін A-пальмітат, рибофлавін, сульфат міді, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, фолієва кислота, сульфат марганцю, філохінон, біотин, бета-каротин, селеніт натрію, вітамін D3, ціанокобаламін, фосфат кальцію, фосфат калію, хлорид натрію, гідроксид калію і нуклеотиди (аденозин-5′-монофосфат, цитидин5′- монофосфат, динатрійгуанозин-5′- монофосфат, динатрійуридин-5′- монофосфат). F. Суміш для дітей Сімілак® Едванс®, що містить залізо: Застосування: Для застосування як добавки або альтернативи грудному вигодовуванню. Порошок, концентрована рідина і форми, готові до вживання. Сполука: Вода, знежирене молоко, лактоза, високомаслична олія сафлору, соєва олія, кокосова олія, концентрат білка сироватки, олія C. cohnii oil, олія M. alpina, цитрат калію, карбонат кальцію, аскорбінова кислота, соєвий лецитин, моногліцериди, карагенан, хлорид калію, хлорид магнію, сульфат заліза, холінхлорид, холінбітартрат, таурин, м-інозитол, сульфат цинку, нікотинамід, d-альфа-токоферилацетат, пантотенат кальцію, L-карнітин, вітамін Aпальмітат, рибофлавін, сульфат міді, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, фолієва кислота, сульфат марганцю, філохінон, біотин, бета-каротин, селеніт натрію, вітамін D3, ціанокобаламін, фосфат кальцію, фосфат калію, хлорид натрію, гідроксид калію і 21 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нуклеотиди (аденозин-5′-монофосфат, цитидин-5′монофосфат, динатрійгуанозин-5′монофосфат, динатрійуридин-5′- монофосфат). G. Суміш для дітей Сімілак® Неошур® Едванс®, що містить залізо: Застосування: Спеціалізована суміш для застосування в таких випадках, як недоношеність. Опис: - Жирова суміш, що характеризується гарним усмоктуванням, що містить 25 % додаткових тригліцеридов із середньою довжиною ланцюга (MCT). - Підвищений вміст білка, вітамінів і мінералів на 100 ккал у порівнянні зі стандартною сумішшю. - Підвищений вміст кальцію і фосфору у порівнянні зі стандартною сумішшю. Сполука: знежирене молоко, суха кукурудзяна патока, лактоза, соєва олія, високомаслична олія сафлору, концентрат білка сироватки, тригліцериди із середньою довжиною ланцюга, кокосова олія, олія C. cohnii, олія M. alpina, цитрат калію, фосфат кальцію, м-інозитол, аскорбінова кислота, хлорид магнію, карбонат кальцію, таурин, сульфат заліза, холінбітартрат, холінхлорид, аскорбілпальмітат, L-карнітин, хлорид калію, хлорид натрію, сульфат цинку, змішані токофероли, d-альфа-токоферилацетат, цитрат натрію, нікотинамід, фосфат калію, пантотенат кальцію, сульфат міді, вітамін A-пальмітат, тіамінхлориду гідрохлорид, рибофлавін, піридоксину гідрохлорид, бета-каротин, фолієва кислота, сульфат марганцю, філохінон, біотин, селеніт натрію, вітамін D3, ціанокобаламін і нуклеотиди (аденозин-5′-монофосфат, цитидин-5′монофосфат, динатрійгуанозин-5′- монофосфат, динатрійуридин-5′- монофосфат). H. Готовий до застосування збагачувач молока людини Сімілак з низьким вмістом заліза, 24 кал/рідку унцію: Застосування: Розроблене для змішування з молоком людини або як альтернатива молоку людину для дітей, що народилися з низькою масою тіла. Сполука: Вода, знежирене молоко, суха кукурудзяна патока, лактоза, тригліцериди із середньою довжиною ланцюга, концентрат білка сироватки, соєва олія, кокосова олія, олія C. cohnii, олія M. alpina, фосфат кальцію, цитрат калію, аскорбінова кислота, карбонат кальцію, хлорид магнію, соєвий лецитин, моно- і дигліцериди, м-інозитол, цитрат натрію, карагенан, холінбітартрат, таурин, холінхлорид, нікотинамід, d-альфа-токоферилацетат, L-карнітин, сульфат цинку, хлорид калію, двохосновний фосфат калію, пантотенат кальцію, сульфат заліза, сульфат міді, рибофлавін, вітамін A-пальмітат, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, біотин, фолієва кислота, бета-каротин, сульфат марганцю, філохінон, вітамін D3, селеніт натрію, ціанокобаламін і нуклеотиди (аденозин-5′-монофосфат, цитидин-5′монофосфат, динатрійгуанозин-5′- монофосфат, динатрійуридин-5′- монофосфат). Різні PUFA згідно з цим винаходом можна заміщати і/або додавати в суміші для новонароджених, описані вище, і в інші суміші для новонароджених, відомі фахівцям у цій галузі техніки. II. ХАРЧОВІ СУМІШІ A. Еншур® Застосування: Живильона суміш ЕНШУР зі смаком вершків є джерелом повноцінного, збалансованого харчування при застосуванні як добавки між прийманнями їжі або під час приймання їжі, або як єдиного джерела їжі при тимчасовому застосуванні. Застосування ЕНШУРА може бути корисно людям, підданим ризику, пов'язаному з харчуванням, що зазнають патологічну втрату ваги, які проходять відновлення після хвороби або хірургічного втручання, або в ході модифікованих або безшлакових дієт. Для орального застосування. Для тимчасового застосування як єдиного джерела харчування. Роздрібний продукт для додаткового перорального харчування. Сполука: Вода, цукор (сахароза), кукурудзяний мальтодекстрин, ізолят білка молока, соєва олія, кукурудзяна олія, канолова олія, концентрат білка сої, цитрат калію, натуральний і штучний ароматизатор, фосфат магнію, цитрат натрію, соєвий лецитин, фосфат кальцію, хлорид магнію, сіль (хлорид натрію), холінхлорид, карагенан, аскорбінова кислота, dl-альфа-токоферилацетат, сульфат заліза, сульфат цинку, нікотинамід, пантотенат кальцію, сульфат марганцю, сульфат міді, вітамін A-пальмітат, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, рибофлавін, фолієва кислота, хлорид кульгава, біотин, молибдат натрію, селенат натрію, філохінон, йодид калію, вітамін D3 і ціанокобаламін. B. Еншур® з високим вмістом білка: Застосування: ЕНШУР З ВИСОКИМ ВМІСТОМ БІЛКА корисний для людей, що зазнають потреби в додатковому білку і харчуванні в дієті. ЕНШУР З ВИСОКИМ ВМІСТОМ БІЛКА підходить для людей, які проходять відновлення після загального хірургічного втручання або 22 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перелому стегнової або іншої кістки, і є гарним джерелом харчування для осіб, підданих ризику появи пролежневих виразок. Для додаткового перорального харчування. Сполука: Вода, цукор (сахароза), кукурудзяний мальтодекстрин, казеїнати кальцію і натрію, соєва олія, ізолят білка сої, кукурудзяна олія, цитрат калію, канолова олія, фосфат кальцію, цитрат натрію, хлорид магнію, фосфат магнію, штучний ароматизатор, сіль (хлорид натрію), соєвий лецитин, холінхлорид, аскорбінова кислота, карагенан, сульфат цинку, dl-альфатокоферилацетат, сульфат заліза, геланова камедь, нікотинамід, пантотенат кальцію, сульфат марганцю, сульфат міді, вітамін A-пальмітат, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, рибофлавін, фолієва кислота, хлорид хрому, біотин, молібдат натрію, йодид калію, селенат натрію, філохінон, вітамін D3 і ціанокобаламін. C. Еншур Плюс® Застосування: ЕНШУР ПЛЮС є джерелом повноцінного, збалансованого харчування, що забезпечує організм концентрованими калоріями і білком, що допомагає пацієнтам набрати або підтримувати здоровішу масу тіла. Його можна застосовувати одночасно з прийманням їжі або між прийманнями їжі, або як замінник їжі. Для тимчасового харчування як єдине джерело їжі. Для пацієнтів, що мають обмеження у споживанні рідини або потребують обмеження обсягів їжі, що надходить. Опис: - 650 мг омега-3 жирної кислоти ALA (40 % 1,6 г RDI) для підтримки здоров'я серця. - Чудове джерело 24 незамінних вітамінів і мінералів. - Джерело антиоксидантів, селен і вітамінів C і E для зміцнення імунної системи. - Низький рівень холестеролу. - Кошерність. - Без вмісту глютену. - Без вмісту лактози. Сполука: Ваніль: вода, кукурудзяна патока, мальтодекстрин (кукурудзяний), кукурудзяна олія, казеїнати натрію і кальцію, цукор (сахароза), ізолят білка сої, хлорид магнію, цитрат калію, трьохосновний фосфат кальцію, соєвий лецитин, природний і штучний ароматизатор, цитрат натрію, хлорид калію, холінхлорид, аскорбінова кислота, карагенан, сульфат цинку, сульфат заліза, альфа-токоферилацетат, нікотинамід, пантотенат кальцію, сульфат марганцю, сульфат міді, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, рибофлавін, вітамін A-пальмітат, фолієва кислота, біотин, хлорид хрому, молібдат натрію, йодид калію, селеніт натрію, філохінон, ціанокобаламін і вітамін D3. D. Еншур® у порошку: Застосування: ЕНШУР® У ПОРОШКУ (що ре суспендується у воді) є повноцінним, збалансованим харчуванням для застосування як добавки одночасно з прийманням їжі або між прийманнями їжі. Він може бути корисний людям, що дотримуються модифікованої дієти, підданим ризику, пов'язаному з харчуванням, що зазнають патологічної втрати ваги, які проходять відновлення після хвороби або хірургічного втручання або, що перебувають на безшлаковій дієті. Опис: - Зручність у застосуванні, легкість змішування - Слабке утворення осаду - Без вмісту лактози і глютену Сполука: кукурудзяна патока, кукурудзяний мальтодекстрин, цукор (сахароза), кукурудзяна олія, казеїнати натрію і кальцію, ізолят білка сої, штучний ароматизатор, цитрат калію, хлорид магнію, цитрат натрію, фосфат кальцію, хлорид калію, соєвий лецитин, аскорбінова кислота, холінхлорид, сульфат цинку, dl-альфа-токоферилацетат, нікотинамід, сульфат заліза, пантотенат кальцію, сульфат марганцю, сульфат міді, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, рибофлавін, вітамін A-пальмітат, фолієва кислота, біотин, хлорид хрому, молібдат натрію, йодид калію, селенат натрію, філохінон, ціанокобаламін і вітамін D3. E. Еншур® у формі пудингу Застосування: ЕНШУР У ФОРМІ ПУДИНГУ являє собою живильну альтернативу іншим закускам і десертам. Він забезпечує повноцінне збалансоване харчування в приємній, легкій для вживання формі. Він підходить для осіб зі зниженою масою тіла або тих, хто хворіє на виснаженням або перебуває на дієті з обмеженням у споживанні рідини або обмеженням обсягів їжі, що надходить. Для людей, що перебувають на дієті з модифікуванням консистенції (наприклад, що вживають м'яку їжу, пюре або винятково рідку їжу). Для людей з утрудненнями при проковтуванні. Для додаткового перорального харчування. Опис: 23 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 - Гарне джерело 24 незамінних вітамінів і мінералів. - Зручність – не вимагає заморожування. - Без вмісту глютену. - Містить 1 г фруктоолігосахаридів (FOS) в одній порції (FOS являють собою пребіотики, що стимулюють ріст корисних бактерій у кишечнику). Сполука: Ваніль: вода, цукор (сахароза), модифікований кукурудзяний крохмаль, частково гідрогенізована соєва олія, концентрат білка молока, знежирене молоко, фруктоолігосахариди, сульфат магнію, фосфат калію, фосфат натрію, стеароілактилат натрію, штучний ароматизатор, аскорбат натрію, сульфат цинку, dl-альфа-токоферилацетат, сульфат заліза, нікотинамід, сульфат марганцю, пантотенат кальцію, FD&C Жовтий #5 і #6, сульфат міді, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, вітамін A-пальмітат, рибофлавін, фолієва кислота, хлорид хрому, біотин, молібдат натрію, йодид калію, селенат натрію, філохінон, вітамін D3 і ціанокобаламін. F. Еншур® з клітковиною: Застосування: ЕНШУР З КЛІТКОВИНОЮ є джерелом повноцінного, збалансованого харчування для людей, яким може бути корисна дієта з підвищеним вмістом клітковини і живильних речовин. Суміш харчових волокон з FOS, пребіотиком, сприяє підтримці нормального функціонування травного тракту. ЕНШУР З КЛІТКОВИНОЮ придатний для людей, що не потребують безшлакової дієти. Його можна вводити перорально або через трубку. ЕНШУР З КЛІТКОВИНОЮ може бути корисний для людей, що перебувають на модифікованій дієті, підданих нутриційному ризику, що хворіють на патологічну втрату ваги або проходять відновлення після хвороби або хірургічного втручання. Для перорального приймання. Для тимчасового вживання як єдиного джерела їжі. Опис: - Включає 1 г FOS/8 рідких унцій FOS клітковини (вуглевод, що не засвоюється), що сприяє здійсненнюприродних захисних реакцій у кишечнику. - Чудове джерело 24 незамінних вітамінів і мінералів. - Забезпечує 2,8 г загальної харчової клітковини на порцію 8 рідких унцій. - Без вмісту лактози і глютену. Сполука: Ваніль: вода; кукурудзяний мальтодекстрин, цукор (сахароза), казеїнати натрію і кальцію, соєва олія, ізолят білка сої, кукурудзяна олія, вівсяна клітковина, фруктоолігосахриди, канолова олія, соєва клітковина, фосфат кальцію, хлорид магнію, цитрат калію, целюлозний гель, соєвий лецитин, фосфат калію, цитрат натрію, натуральний і штучний ароматизатор, холінхлорид, фосфат магнію, аскорбінова кислота, карбоксиметилцелюлоза, хлорид калію, карагенан, сульфат заліза, dl-альфа-токоферилацетат, сульфат цинку, нікотинамід, сульфат марганцю, пантотенат кальцію, сульфат міді, вітамін A-пальмітат, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, рибофлавін, фолієва кислота, хлорид хрому, біотин, молібдат натрію, йодид калію, селенат натрію, філохінон, вітамін D3 і ціанокобаламін. Різні харчові добавки, описані вище, а також інші, відомі фахівцям у цій галузі техніки, можна заміняти або доповнювати PUFA, зробленими відповідно до цього винаходу. G. Дієтичний продукт Оксепа™ Здатність продукту Оксепа™ модулювати запальні реакції у важкохворих, що перебувають на штучній вентиляції, пацієнтів, клінічно доведена. Він придатний для пацієнтів із сепсисом, ССЗР (синдромом систимної запальної реакції), ГУЛ (гострим ушкодженням легенів) або ГРДС (гострим респіраторним дистрес-синдромом). Для введення за допомогою трубки. Для вживання як єдиного джерела харчування. Розподіл калорій: Розподіл калорій у складі продукту оксепа наведено в таблиці C. 50 Таблиця C. Розподіл калорій у складі продукту оксепа Калорії Жир (г) Вуглевод (г) Білок (г) Вода (г) на 8 рідких унцій 355 2,2 25 14,8 186 24 на літр 1,500 93,8 105,3 62,5 785 % кал --5,2 28,1 16,7 -- UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сполука: вода, казеїнати кальцію і натрію, цукор (сахароза), канолова олія, тригліцериди із середньою довжиною ланцюга, сардинова олія, олія бурачника, хлорид магнію, фосфат кальцію, соєвий лецитин, цитрат калію, цитрат натрію, аскорбінова кислота, фосфат калію, натуральний і штучний ароматизатор, холінхлорид, таурин, d-альфа-токоферилацетат, Lкарнітин, сіль (хлорид натрію), геланова камедь, сульфат цинку, сульфат заліза, нікотинамід, пантотенат кальцію, сульфат марганцю, сульфат міді, тіамінхлориду гідрохлорид, піридоксину гідрохлорид, рибофлавін, бета-каротин, вітамін A-пальмітат, фолієва кислота, хлорид хрому, біотин, молібдат натрію, йодид калію, селенат натрію, філохінон, вітамін D3 і ціанокобаламін. Різні жирні кислоти у складі харчового продукту Оксепа™ можна заміняти і/або доповнювати PUFA, отриманими відповідно до цього винаходу. F. Фармацевтичні композиції Також в обсяг цього винаходу входить фармацевтична композиція, що містить у складі одну або більше кислот і/або олій, що утворюються в результаті, отриманих із застосуванням гена Δ8-десатурази, описаного в цій заявці, у відповідності зі способами, описаними в цій заявці. Зокрема, зазначена фармацевтична композиція може включати одну або більше кислот і/або олій, а також загальноприйнятий, добре відомий, не токсичний фармацевтично прийнятний носій, допоміжну речовину або наповнювач, наприклад, фосфатний буферний сольовий розчин, воду, етанол, багатоатомні спирти, рослинні олії, агенти, що зволожують, або емульсію, наприклад, емульсію вода в олії. Композиція може існувати як у рідкій, так і у твердій формі. Наприклад, композицію можна надавати у формі таблетки, капсули, рідини або порошку, призначених для приймання усередину, мазі або крему, призначених для приймання усередину або місцевого застосування. Відповідну плинність можна забезпечувати, наприклад, за допомогою підтримки необхідного розміру частинок у випадку дисперсій, а також шляхом застосування поверхово – активних речовин. Також може бути бажаним включення до складу композиції ізотонічних агентів, наприклад, цукрів, хлориду натрію і їм подібних. Крім зазначених інертних розріджувачів, композиція може включати допоміжні речовини, наприклад агенти, що зволожують, агенти, що емульгують та суспендують, агенти, що підсолоджують, смакові агенти та ароматизуючі агенти. Суспензії, на додаток до діючих речовин, також можуть містити суспендуючі агенти, наприклад, етоксильовані ізостеарилові спирти, сорбітолові та сорбітанові ефіри поліоксиетилену, мікрокристалічну целюлозу, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант або суміші зазначених речовин. Тверді одиниці дозування, наприклад, таблетки і капсули, можна виготовляти за допомогою технологій, відомих у цій галузі техніки. Наприклад, PUFA, отримані відповідно до цього винаходу, можна одержувати у вигляді таблеток, з такими традиційними наповнювачами, як лактоза, сахароза і кукурудзяний крохмаль, у комбінації з такими єднальними речовинами, як гуміарабік, кукурудзяний крохмаль або желатин, агентами, що поліпшують розпад, наприклад, картопляний крохмаль або альгінова кислота, і лубрикантами, наприклад, стеаринова кислота або стеарат магнію. Капсули можна виготовляти шляхом приміщення зазначених наповнювачів у желатинову капсулу разом з антиоксидантами і відповідною (відповідними) PUFA. Антиоксиданти і PUFA, що включаються до складу, повинні відповідати рекомендаціям, наведеним вище. Для внутрішньовенного введення, PUFA, отримані відповідно до цього винаходу, або їх похідні, можна включати в комерційні сполуки, наприклад, Інтраліпід™. У звичайному випадку вміст жирних кислот у плазмі крові становить від 6,64 до 9,46 % ARA, від 1,45 до 3,11 % DGLA і від 0,02 до 0,08 % GLA. Зазначені PUFA або їх попередники в метаболічних реакціях можна вводити окремо або у комбінації з іншими PUFA для досягнення нормального вмісту жирних кислот в організмі пацієнта. При бажанні, окремі складові лікарських форм можна надавати окремо, у формі набору, для однократного або багаторазового застосування. Звичайне дозування певної жирної кислоти становить від 0,1 мг до 20 г (до 100 г) щодня, краще від 10 мг до 1, 2, 5 або 10 г щодня. Можливі способи введення фармацевтичних композицій згідно з цим винаходом включають, наприклад, ентеральний (наприклад, пероральний і ректальний) і парентеральний. Наприклад, рідку сполуку можна вводити, наприклад, пероральним або ректальним шляхом. Також, гомогенну суміш можна повністю диспергувати у воді, змішаній у стерильних умовах з фізіологічно прийнятними розріджувачами, консервантами, буферами або пропелентами, для утворення спрея або засобу для інгаляції. Спосіб введення буде залежати, зрозуміло, від цільового ефекту. Наприклад, якщо композицію застосовують для лікування лущення, сухості або старіння шкіри, для лікування 25 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ушкодження або опіку шкіри або для лікування шкіри або волосся, ушкоджених у результаті захворювання або хворобливого стану, можливе місцеве застосування. Дозування композиції, що вводиться пацієнтові, повинен визначати фахівець у цій галузі техніки, і вона буде залежати від різних факторів, наприклад, маса тіла пацієнта, вік пацієнта, імунний статус пацієнта і т.д… Відносно форми, композицію можна надавати, наприклад, у вигляді розчину, дисперсії, емульсії або стерильного порошку, відновлюваного перед введенням. Також в обсяг цього винаходу входить лікування різних порушень шляхом застосування фармацевтичних і/або харчових композицій, описаних у цій заявці. Зокрема, композиції згідно з цим винаходом можна застосовувати для лікування рестинозу, що розвився у результаті пластики судин. Далі, за допомогою композицій згідно з цим винаходом також можна лікувати симптоми запалення, ревматоїдного артриту, астми і псоріазу. Також доведено, що PUFA можуть брати участь у метаболізмі кальцію; отже, композиції згідно цьому винаходу можна застосовувати, наприклад, для лікування або запобігання розвитку остеопорозу або каменів, що утворюються в нирках або сечовивідних шляхах. Також, композиції згідно з цим винаходом можна застосовувати для лікування раку. Була показана зміна складу жирних кислот у злоякісних клітинах. Доведено, що додавання жирних кислот сповільнює їх ріст, викликає смерть клітин і підвищує їх чутливість до хіміотерапевтичних агентів. Більше того, композиції згідно з цим винаходом можуть бути корисні для лікування виснаження, пов'язаного з раком. Композиції згідно з цим винаходом можна застосовувати для лікування діабетів (див. патент США № 4,826,877 і Horrobin D F et al., (1993) Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Suppl.) 732S-737S). В організмі тварин, що страждають діабетом, були показані зміни в метаболізмі і складі жирних кислот. Далі, композиції згідно з цим винаходом, що містять PUFA, отримані прямо або опосередковано шляхом застосування ферменту Δ8-десатурази, також можна застосовувати для лікування екземи, для зниження кров'яного тиску і для підвищення екзаменаційних оцінок по математиці. Також, композиції згідно з цим винаходом можна застосовувати для інгібування агрегації тромбоцитів, індукції розширення просвіту кровоносних судин, зниження рівнів холестеролу, придушення проліферації в гладком'язовій і фіброзній тканині стінок судин (Brenner et al., (1976) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, p. 85-101), зменшення або запобігання кровотечам у шлунково – кишковому тракті та інших подібних ефектів застосування нестероїдних і протизапальних препаратів (Див. патент США № 4,666,701), запобігання або лікування ендометриозу та передменструального синдрому (Див. патент США № 4,758,592), а також для лікування міалгічного енцефаломієліту та синдрому хронічної втоми після перенесення вірусних інфекцій (Див. патент США № 5,116,871). Подальші способи застосування композицій згідно з цим винаходом включають застосування їх для лікування СНІДу, множинного склерозу і запальних захворювань шкіри, а також для загальної підтримки здоров'я організму. Також, композицію згідно з цим винаходом можна застосовувати в косметичних цілях. Зазначену композицію можна додавати у вже існуючі фармацевтичні композиції, для складання суміші або як основу для композиції. G. Способи застосування у ветеринарії Слід зазначити, що описані вище фармацевтичні та харчові композиції можна застосовувати у відношенні тварин (тобто, домашніх і не домашніх), також як і у відношенні людей, оскільки тварини відчувають багато потреб і станів, подібних з такими для людей. Наприклад, олії або кислоти згідно з цим винаходом можна застосовувати в харчових добавках для тварин або для водної культури, замінниках їжі для тварин, вітамінах для тварин або у складі мазей місцевого застосування для тварин. Цей винахід можна пояснити за допомогою наступних прикладів, що не обмежують обсяг цього винаходу. Приклад 1 Розробка вироджених олігонуклеотидів для виділення Δ8-десатурази зі штаму Emiliana huxleyi CCMP 378 і складання бібліотеки кДНК У ході аналізу сполуки жирних кислот морської водорості виявили присутність значної кількості докозагексаєнової кислоти (DHA, 22:6 n-3) (40 % за масою від загального вмісту ліпідів) у штамі Emiliana huxleyi CCMP 378 (Див., таблиця 1). Також, у зазначеному організмі представлені проміжні продукти альтернативного шляху ‘Δ8-десатурази-Δ9-елонгази" (Див., Фіг 1), що вказує на активність зазначеного шляху в зазначеному організмі. Отже, припускають, що зазначений організм містить активну Δ9-елонгазу, здатну до перетворення лінолевої кислоти 26 UA 106212 C2 5 (LA, 18:2 n-6) в ейкозадієнову кислоту (EDA, 20:2 n-6) або альфа-ліноленової кислоти (ALA, 18:3, n-3) в ейкозатрієнову кислоту (ETrA, 20:3n-3), а також активну Δ8-десатуразу, що перетворює ейкозадієнову кислоту (EDA, 20:2 n-6) у дихомо-гама-ліноленову кислоту (DGLA, 20:3 n-6) або ω3- ейкозатрієнову кислоту (ω3-ETrA, 20:3n-3) в ω3-ейкозатетраєнову кислоту (ω3ETA, 20:4n-3) (Див., Фігуру 1). Таблиця 1 Сполука жирних кислот штаму Emiliana huxleyi CCMP378 Жирна Кислота 18:0 18:1 n-9 18:2 n-6 18:3 n-6 18:3 n-3 18:4 n-3 20:2 n-6 20:3 n-6 20:4 n-6 20:3 n-3 20:4 n-3 20:5 n-3 22:4 n-6 22:5 n-6 22:4 n-3 22:5 n-3 22:6 n-3 10 15 20 25 30 35 % Загального Вмісту Ліпідів 0,23 2,98 1,05 0,13 3,58 14,03 0,10 0,09 0,11 6,21 0,18 1,30 0,08 0,12 0,11 1,09 40,88 Метою даного дослідження було виділення прогнозованого повнорозмірного гена Δ8десатурази зі штаму Emiliana huxleyi CCMP 378 і перевірка його активності шляхом експресії в Saccharomyces cerevisiae. Для цього створювали бібліотеку нормалізованих кДНК для Emiliana huxleyi CCMP 378. Масу клітин Emiliana huxleyi CCMP 378 одержували в Національному Центрі морського фітопланктону Provasoli-Guillard (CCMP-Bigelow Laboratories, West Boothbay, Me.). Загальну РНК очищали за допомогою набору Qiagen RNeasy Maxi (Qiagen, Valencia, Calif.) відповідно до інструкцій виробника. Коротко, заморожену масу клітин руйнували в рідкому азоті за допомогою ступки і товкачика, суспендували в буфері RLT buffer (Qiagen RNeasy Plant Mini kit) і пропускали через Qiashredder. РНК очищали за допомогою максі-колонок RNeasy відповідно до інструкцій виробника. Бібліотеки первинних і нормалізованих кДНК для Emiliana huxleyi CCMP 378 створювали за допомогою Agencourt Biosciences (Waltham, Mass.), із застосуванням запатентованої ними технології. Agencourt застосовує кілька нестандартних і запатентованих етапів у ході першого витка, який, в остаточному підсумку, забезпечує підвищення ефективності на 25-30 % у порівнянні з методиками, що звичайно застосовуються. У ході здійснення запатентованого способу, проводять зворотну транскрипцію РНК в одноланцюгову ДНК при умовах, що застосовуються для зменшення або усунення сторонніх подій праймінгу. Комбінація наведеного процесу зі спеціалізованою програмою циклювання підвищує кількість повнорозмірних клонів. У ході другого витка синтезу, відбирають клони кДНК, розмір яких перевищує 1,2 т.зв., для зниження рівня клонування невеликих, усічених молекул кДНК. Розмір вставок для бібліотеки великих вставок становив >4 п.н., для відбору клонів із вставками більшого розміру. Після проведення відбору за розміром, кінці кДНК зачищають, і кДНК розщеплюють за допомогою "рідкорозщеплюючого" ("rare-cutter") ферменту. Рідкорозщеплюючий ("rare-cutter") фермент рестрикції, сайт для якого вводять у клони в ході етапу праймування ДНК, потім застосовують для створення клонів для спрямованого клонування у вектор pAGEN. Імовірність розщеплення клонів кДНК "рідкорозщеплюючим" ("rare-cutter") ферментом рестрикції у 20 разів менше, внаслідок чого утворюється значно більше повнорозмірних клонів у порівнянні з іншими способами створення бібліотеки кДНК, у ході яких застосовують стандартні ферменти рестрикції, що вносять розрізи у випадкових інтервалах у межах клону. Підсумком є вставка на 27 UA 106212 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5′-тупому кінці і "липкий" 3′-кінець, що утворюється в результаті застосування "рідкорозщеплюючого" ("rare-cutter") ферменту. Завдяки описаному способу, не потрібно додаткового адаптерного лігування для забезпечення спрямованого клонування. Це поліпшує загальну ефективність процесу клонування. Вектор спеціально конструюють для спрямованого клонування без застосування 5′-адапторів, що забезпечує подальше підвищення ефективності трансформації завдяки зниженню кількості маніпуляцій з кДНК у ході клонування. Після завершення створення бібліотеки первинних кДНК, її досліджують на кількість незалежних клонів, відсоток рекомбінантних клонів і середній розмір вставки. Процес нормалізації починають з поділу стандартної бібліотеки на дві популяції. Першу популяцію лінеаризиують і транскрибують із кДНК у РНК, при включенні біотинільованих нуклеотидів. Із другої популяції створюють одноланцюгові ДНК плазміди шляхом утворення фагмід. Дволанцюгову ДНК у лізаті клітин розщеплюють за допомогою ДНКази I. У такий спосіб усувають контамінацію ДНК плазмід з препарату одноланцюгової ДНК. Після цього дві популяції змішують, і будь-які перепредставлені клони із плазмід одноланцюгової ДНК вступають у реакцію гібридизації з їх партнерами у складі популяції біотиньованої РНК. Agencourt застосовує оліго-dT і праймер подовження для попереднього блокування ділянки полі-A до гібридизації. У такий спосіб запобігають гібридизації клону РНК полі-A і клону полі-U. За допомогою способу екстракції, що застосовує стрептавідин/фенол, видаляють усі біотинільовані гібридні пари та лінеаризовані біотинільовані молекули РНК, отже, залишаються одноланцюгові, перепредставлені плазміди ДНК. За допомогою олігонуклеотиду, що гібридизується тільки з клонами, що містять вставку, синтез ДНК праймують для відтворення дволанцюгових клонів ДНК. Після цього клони трансформують у бактерії для створення підсумкової бібліотеки нормалізованих кДНК. Шляхом застосування наведеного протоколу, була 7 створена бібліотека нормалізованих кДНК з титром, що становив 2,6×10 КОЕ/мл, із загальною 8 кількістю отриманих колоній, що становили 1,8×10 , і середнім розміром вставки, що становив 1,05 т.п.н… Для виділення кандидатів, схожих на ген Δ8-десатурази, з бібліотеки, розробляли вироджені олігонуклеотиди (тобто, праймери) консервативні амінокислотні мотиви, що кодують, які присутні у складі відомих Δ8-десатураз. Після цього зазначені праймери застосовували в ході реакції ПЦР для визначення фрагментів ДНК, що містять зазначені консервативні ділянки у складі прогнозованої Δ8-десатурази. Для вирівнювання і розробки праймерів застосовували відомі амінокислотні послідовності Δ8-десатурази наступних організмів: Euglena gracialis (№ доступу AF139720, SEQ ID NO:1; Фігура 3A), Pavlova lutheri CCMP 459 (WO 2007/127381A2, SEQ ID NO:2; Фігура 3B), Pavlova salina ((№ доступу DQ995518, SEQ ID NO:3; Фігура 4A), Perkinsus marinus ((№ доступу DQ508730, SEQ ID NO:4; Фігура 4B) і Acanthamoenba castellani ((№ доступу CS608483, SEQ ID NO:5; Фігура 4C). Вироджені праймери, що застосовуються, являли собою наступні: Білковий мотив 1: (SEQ ID NO: 38): D A E S Y NH3-R D A T /E /Q F /M /V /M H-COOH Праймер RO 1714 (Прямий) (SEQ ID NO:6): 5′-CGC GAC GCG ACG GAS SMG TTC RWG KYK WWS CAC-3′ Наведений праймер містив послідовність консервативного мотиву у прогнозованій ділянці цитохрому b5. Білковий мотив 2: (SEQ ID NO: 39): A Y L NH3-G W L /S H D /I /S H H-COOH Праймер RO 1715 (Прямий) (SEQ ID NO: 7): 5′-GGC TGG CTT KCK CAC GAC WWC YYG CAT CAC-3′ Наведений праймер містив послідовність консервативного мотиву "1 гістидинового боксу Білковий мотив 3: (SEQ ID NO: 40): K A T NH 3-W /R /L R H N /A H H-COOH Праймер RO 1716 (Прямий) (SEQ ID NO: 8) 5′-TGG MRS SYG CGC CAT AAC RCG CAC CAC GTG KSC AGC AAC-3′ Наведений праймер містив послідовність консервативного мотиву "2 гістидинового боксу’ Білковий мотив 4: (SEQ ID NO: 41): A A I NH 3-F /G T /G /V V V F A T H Y-COOH Праймер RO 1717 (Зворотний) (SEQ ID NO:9) 5′-ATA GTG GGT TGC AAA GAC AAC SAY SSC CGT CSC GAA-3′ Білковий мотив 5: (SEQ ID NO:42): I T NH 3-Q /T H H L F P /M M P-COOH 28