Бактеріальна адгезія та антиадгезія до слизової оболонки, клітин епітелію та інших клітин

Реферат: Винахід належить до набору та способів детектування, ідентифікації і вимірювання адгезії бактерій до слизу і клітин епітелію. Зокрема, винахід забезпечує способи аналізу з метою детектування та ідентифікації наявності або відсутності адгезії бактерій до слизу і клітин епітелію (наприклад, присутніх у кишечнику) або інших частин тіла тварини, де можуть бути присутні бактерії, і способи ідентифікації та дослідження (наприклад, ефективності) UA 107194 C2 (12) UA 107194 C2 модуляторів адгезії бактерій до слизу і клітин епітелію або інших частин тіла тварини, де можуть бути присутні бактерії. UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресне посилання на споріднені заявки Ця заявка заявляє пріоритет згідно з попередньою заявкою США № 61/223,755, поданою 8 липня 2009 р., зміст якої повністю включено в цей документ за допомогою посилання. Галузь техніки Цей винахід у цілому відноситься до способів детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу і клітин епітелію. Зокрема, цей винахід забезпечує способи аналізу для детектування та ідентифікації наявності або відсутності адгезії бактерій до слизу і клітин епітелію (наприклад, присутніх у кишечнику) або інших частин тіла тварини, де можуть бути присутні бактерії, і способи ідентифікації та визначення характеристик (наприклад, ефективності) модуляторів адгезії бактерій до слизу і клітин епітелію або інших частин тіла тварини, де можуть бути присутні бактерії. Рівень техніки Клітини епітелію тонкого кишечнику, дихальних шляхів, сечовивідних шляхів і статевих шляхів тварин покриті відносно густим шаром слизу, який містить муцин, велику кількість невеликих зв'язаних білків, глікопротеїнів, ліпідів і гліколіпідів. Клітини епітелію та слиз містять рецептори, що розпізнають специфічні білки адгезії бактерій. Адгезія або тісний зв'язок бактерій з клітинами епітелію може вносити вклад у колонізацію, а також патогенність бактерій. Крім того, адгезія бактерій до слизу та епітелію кишечнику представляється важливою для індивідуальної стабільності в мікрофлорі. Короткий опис винаходу Цей винахід у цілому відноситься до способів детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії і анти-адгезії бактерій до слизу і клітин (наприклад, клітин епітелію). Зокрема, цей винахід забезпечує способи аналізу для детектування та ідентифікації адгезії бактерій до слизу (наприклад, слизової кишечнику) і клітин епітелію, і способів ідентифікації адгезії бактерій до слизу і клітин епітелію. Ці способи аналізу нерадіоактивні, мікробіологічно безпечні, їх компоненти стабільні й прості в транспортуванні і зберіганні. Відповідно, у деяких варіантах реалізації цей винахід забезпечує набори, що реалізують способи нерадіоактивного твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) для аналізу адгезії бактерій до слизу і/або клітин епітелію. Ці набори не обмежуються конкретними компонентами. У деяких варіантах реалізації ці набори включають твердий носій, покритий слизом або епітеліальними клітинами, зразок, що містить бактерії, первинне антитіло, специфічне до бактерій, і вторинне антитіло обладнане міткою, що детектується, специфічне до первинного антитіла, пов'язаного з бактеріями. У деяких варіантах реалізації ці набори включають субстрат, який забезпечує візуалізацію антитіл, обладнаних міткою, що детектується, . У деяких варіантах реалізації вторинне антитіло обладнане міткою, що детектується, містить ферментну мітку. У деяких варіантах реалізації субстрат являє собою композицію для забезпечення колориметричного, флуориметричного або хемілюмінесцентного сигналу в присутності ферментної мітки. У деяких варіантах реалізації вторинне антитіло обладнане міткою, що детектується, включає імуноглобуліни свині до IgG, кон'юговані з пероксидазою. У деяких варіантах реалізації колориметрична композиція являє собою 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. У деяких варіантах реалізації твердий носій являє собою 96-ямковий планшет. У деяких варіантах реалізації бактерії являють собою бактерії E. coli. Приклади слизу включають слиз проксимального відділу клубової кишки свині, слиз дистального відділу товстої кишки свині, слиз дванадцятипалої кишки м'ясного курчати і слиз сліпої кишки м'ясного курчати, але не обмежуються ними. Приклади первинних антитіл включають кон'юговані з ПХ поліклональні антитіла до антигенних серотипів О і K E. coli, поліклональні антитіла до антигенних серотипів О і K E. coli, але не обмежуються ними. Приклади вторинних антитіл включають афінно очищені кон'юговані з ПХ антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з лужною фосфатузою антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з FITC поліклональні антитіла до IgG кози (H&L), стрептавідинлужну фосфатузу з Streptomyces avidinii і стрептавідин-пероксидазу з Streptomyces avidinii, але не обмежуються ними. У деяких варіантах реалізації цей винахід забезпечує способи вимірювання адгезії та антиадгезії між бактеріями і слизом та бактеріями і епітеліальними клітинами. Ці способи не обмежуються конкретними методиками вимірювання адгезії між бактеріями і слизом та бактеріями і епітеліальними клітинами. У деяких варіантах реалізації ці способи включають забезпечення зразка, що містить бактерії та слиз, і об'єднання зразка, що містить бактерії та слизи в нерадіоактивному колориметричному аналізі в умовах для вимірювання адгезії між бактеріями та слизом. У деяких варіантах реалізації цей нерадіоактивний колориметричний аналіз являє собою твердофазний імуноферментний аналіз. У деяких варіантах реалізації ці умови включають додавання первинних антитіл, специфічних до бактерій, пов'язаних зі слизом, 1 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітин епітелію або інших клітини, і додавання антитіл обладнаних міткою, що детектується, специфічних до первинних антитіл, пов'язаних з бактеріями. У деяких варіантах реалізації способи включають додавання субстрату, який забезпечує візуалізацію антитіл, обладнаних міткою, що детектується, пов'язаних з первинними антитілами. У деяких варіантах реалізації слиз наносять на титраційний мікропланшет. У деяких варіантах реалізації вторинне антитіло обладнане міткою, що детектується, містить ферментну мітку. У деяких варіантах реалізації субстрат являє собою композицію для забезпечення колориметричного, флуориметричного або хемілюмінесцентного сигналу в присутності ферментної мітки. У деяких варіантах реалізації вторинне антитіло обладнане міткою, що детектується, включає імуноглобуліни свині до IgG, кон'юговані з пероксидазою. У деяких варіантах реалізації колориметрична композиція являє собою 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. У деяких варіантах реалізації бактерії являють собою бактерії E. coli. Ці способи не обмежуються конкретними первинними або вторинними антитілами. У деяких варіантах реалізації приклади первинних антитіл включають кон'юговані з ПХ поліклональні антитіла до антигенних серотипів О і K E. coli і поліклональні антитіла до антигенних серотипів О і K E. coli, але не обмежуються ними. Приклади вторинних антитіл включають афінно очищені кон'юговані з ПХ антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з лужною фосфатузою антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з FITC поліклональні антитіла до IgG кози (H&L), стрептавідин-лужну фосфатузу з Streptomyces avidinii і стрептавідин-пероксидазу з Streptomyces avidinii, але не обмежуються ними. У деяких варіантах реалізації цей винахід забезпечує способи ідентифікації агента, що модулює адгезію між бактеріями і слизом, що включають забезпечення зразка, який містить бактерії, слиз і агент, і об'єднання цього зразка, що містить бактерії, слизи і агента в нерадіоактивному колориметричному аналізі в умовах для вимірювання адгезії між бактеріями та слизом. Крім того, ці способи включають порівняння адгезії бактерій у присутності і під час відсутності агента, та ідентифікацію агента як модулятора адгезії між бактеріями і слизом, якщо виміряна адгезія більше або менше адгезії між бактеріями та слизом під час відсутності агента. У деяких варіантах реалізації зазначений нерадіоактивний колориметричний аналіз являє собою твердофазний імуноферментний аналіз. У деяких варіантах реалізації ці умови включають додавання первинних антитіл, специфічних до бактерій, пов'язаних зі слизом. У деяких варіантах реалізації ці умови включають додавання антитіл, обладнаних міткою, що детектується, специфічних до первинних антитіл, пов'язаних з бактеріями. У деяких варіантах реалізації умови включають додавання субстрату, який забезпечує візуалізацію антитіл, обладнаних міткою, що детектується, пов'язаних з первинними антитілами. У деяких варіантах реалізації слиз наносять на титраційний мікропланшет. У деяких варіантах реалізації вторинне антитіло обладнане міткою, що детектується, містить ферментну мітку. У деяких варіантах реалізації субстрат являє собою композицію для забезпечення колориметричного, флуориметричного або хемілюмінесцентного сигналу в присутності ферментної мітки. У деяких варіантах реалізації вторинне антитіло обладнане міткою, що детектується, включає імуноглобуліни свині до IgG, кон'юговані з пероксидазою. У деяких варіантах реалізації колориметрична композиція являє собою 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. У деяких варіантах реалізації бактерії являють собою бактерії E. coli. Приклади первинних антитіл включають кон'юговані з ПХ поліклональні антитіла, специфічні до антигенних серотипів О і K E. coli, поліклональні антитіла, специфічні до антигенних серотипів О і K E. coli, але не обмежуються ними. Приклади вторинних антитіл включають афінно очищені кон'юговані з ПХ антитіла кролика до IgG кози, афінно очищені антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з лужною фосфатузою, поліклональні антитіла до IgG кози, кон'юговані з FITC (H&L), стрептавідин-лужну фосфатузу з Streptomyces avidinii і стрептавідин-пероксидазу з Streptomyces avidinii, але не обмежуються ними. У деяких варіантах реалізації агент вибирають зі списку, що складається з природних молекул, синтетичних молекул і рекомбінантних молекул. У деяких варіантах реалізації цей винахід забезпечує композиції, що включають агент, який є модулятором адгезії бактерій до слизу, і при цьому зазначений агент ідентифікований способом, що включає забезпечення 1) зразка, що містить бактерії, 2) слизу, 3) агента; об'єднання зазначеного зразка, що містить бактерії, слизи і агента в нерадіоактивному колориметричному аналізі в умовах для вимірювання адгезії між бактеріями та слизом; порівняння адгезії бактерій у присутності і під час відсутності агента; та ідентифікацію агента як модулятора адгезії між бактеріями і слизом, якщо виміряна адгезія більше або менше адгезії між бактеріями та слизом під час відсутності агента. У деяких варіантах реалізації ця композиція входить до складу кормів, прийнятних для споживання суб'єктом, що обирається із групи, яка складається з сільськогосподарських тварин, свійських тварина, риб і молюсків та ракоподібних. Опис креслень 2 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фігурі 1 показаний вплив концентрації слизу (мг білка/мл) на адгезію E. coli ALI 84 і ALI446 згідно з вимірюваннями з використанням радіоактивно мічених бактерій. На Фігурі 2 показаний вплив первинних антитіл на адгезію E. coli ALI84 згідно з вимірюваннями на сцинтиляційному лічильнику з використанням радіоактивно мічених бактерій. Первинні антитіла: ПХ=Кон'юговані з ПХ антитіла до E. coli; BP2022=некон'юговані антитіла до E. coli, біотин=антитіла до E. coli, кон'юговані з біотином. На Фігурі 3 показаний вплив первинних антитіл на адгезію E. coli ALI446 згідно з вимірюваннями на сцинтиляційному лічильнику з використанням радіоактивно мічених бактерій. Первинні антитіла: ПХ=Кон'юговані з ПХ антитіла до E. coli; BP2022=некон'юговані антитіла до E. coli, біотин=антитіла до E. coli, кон'юговані з біотином. На Фігурі 4 показаний розвиток забарвлення трьох різних субстратів для твердофазного ІФА на основі 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) при інкубуванні з бактеріями E. coli (штами ALI84 і ALI446). На Фігурі 5 показаний розвиток забарвлення субстратів для твердофазного ІФА - Pнітрофенілфосфату (pNPP) і 2,2'-азин-біс(3-етилбензотіазолін-6-сульфонової кислоти) (AzBTS) при інкубуванні зі штамами E. coli ALI84 і ALI446. E = підсилювач ABTS для мікролунок. На Фігурі 6 показаний розвиток забарвлення різних субстратів для твердофазного ІФА при інкубуванні в лунках, покритих слизом. Фотографія зроблена в момент часу 60 хв, слабкий сигнал спостерігали в шести позитивних (жовтих) лунках у момент часу 15 хв. На Фігурі 7 показана розмітка планшета при тестуванні неспецифічного зв'язування антитіл зі слизом або планшетом. BP2022 = первинне антитіло до E. coli; BP2022HRP = первинне антитіло до E. coli, кон'юговане з ПХ; Біотин = первинне антитіло до E. coli, кон'юговане з біотином. ПХ = вторинне антитіло, кон'юговане з пероксидазою; Стр-ПХ = стрептавідин, кон'югований з пероксидазою. ЛФ = вторинне антитіло, кон'юговане з лужною фосфатузою; СтрЛФ = вторинне антитіло, кон'юговане зі стрептавідином. Цей експеримент виконували без використання бактерій. На Фігурі 8 показано зв'язування антитіл зі слизом або планшетом. Розмітка планшета описана на Фігурі 7. На Фігурі 9 показаний тест неспецифічного зв'язування з використанням первинних і вторинних антитіл. Первинні антитіла: ПХ = первинне антитіло, кон'юговане з ПХ; BP2022 = некон'юговане поліклональне первинне антитіло до E. coli; Біотин = первинне антитіло до E. coli, кон'юговане з біотином. Вторинні антитіла: ПХ = IgG, кон'югований з пероксидазою; Стр-ПХ = стрептавідин, мічений ПХ. Цей експеримент виконували без використання бактерій. На Фігурі 10 показаний тест блокування неспецифічного зв'язування з використанням первинних і вторинних антитіл. Розмітка планшета описанана Фігурі 9. Первинні антитіла: ПХ = первинне антитіло, кон'юговане з ПХ; BP2022 = некон'юговане поліклональне антитіло до E. coli; Біотин = антитіло до E. coli, кон'юговане з біотином. Вторинні антитіла: ПХ = IgG, кон'югований з пероксидазою; Стр-ПХ = стрептавідин, мічений ПХ. На Фігурі 11 показана таблиця, що описує умови, використані для оптимізації розведення антитіл, і кількість бактерій / лунку. Первинні антитіла: Кон'юговані з ПХ первинні антитіла, вторинних антитіл немає. На Фігурі 12 показані дані, отримані при тестуванні розведення антитіл, і оптимальна кількість бактерій / лунку. Первинні антитіла: Кон'юговані з ПХ первинні антитіла, вторинних антитіл немає. Розмітка планшета показана на Фігурі 11. На Фігурі 13 показана таблиця, що описує умови, використані для оптимізації розведення антитіл, і кількість бактерій / лунку. Первинні антитіла: антитіла до E. coli, кон'юговані з біотином, вторинні антитіла: стрептавідин, кон'югований з ПХ. На Фігурі 14 показані дані, отримані при тестуванні розведення антитіл, і оптимальна кількість бактерій / лунку. Первинні антитіла: антитіла до E. coli, кон'юговані з біотином, вторинні антитіла: стрептавідин, кон'югований з ПХ. 6 8 На Фігурі 15 показано поглинання у твердофазному ІФА при внесенні 10 -10 бактерій у лунки. Додана логарифмічна лінія тренда. На Фігурі 16 показано поглинання у твердофазному ІФА при внесенні 0-106 бактерій у лунки. На Фігурі 17 показано А) дія різних концентрацій Bio-Mos на адгезію бактерій. Ефект показаний у відсотках від значення поглинання під час відсутності Bio-Mos; і Б) дія Bio-Mos на адгезію штаму E. coli ALI84 згідно з вимірюванням на сцинтиляційному лічильнику з використанням радіоактивно мічених бактерій. На Фігурі 18 показані дані експериментів по дослідженню кількості бактерій/лунку з метою визначення оптимального рівня для детектування зміни адгезії/зв'язування (наприклад, з використанням Bio-Mos). 3 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фігурі 19 показані дані експериментів по тестуванню кількості бактерій/лунку з метою визначення оптимального рівня для детектування впливу зміни адгезії/зв'язування (наприклад, з використанням Bio-Mos). На Фігурі 20 показані дані, що відносяться до розведення первинних антитіл для детектування відмінностей між різними концентраціями Bio-Mos. На Фігурі 21 показаний вплив Bio-Mos на твердофазний ІФА при використанні різних типів слизу і декількох концентрацій Bio-Mos. На Фігурі 22 показано порівняння дії Bio-Mos на аналіз зв'язування радіоактивної мітки і процедуру твердофазного ІФА. Як значення погрішностей показані стандартні помилки середнього для повторюваних зразків. На Фігурі 23 показана адгезія бактерій, інактивованих у різні способи, до планшетів, покритих слизом. Адгезію вимірювали в присутності та під час відсутності Bio-Mos. Дані для бактерій, інактивованих УФ і ДМСО, не показані. На Фігурі 24 показана адгезія бактерій до слизу на свіжопокритих планшетах згідно з твердофазним ІФА. На Фігурі 25 показана дія концентрацій етанолу в рідині для зберігання E. coli на адгезію бактерій до слизу. На Фігурі 26 показана адгезія бактерій до планшетів, що покриті слизом і зберігалися у різні способи, у присутності та під час відсутності Bio-Mos. На Фігурі 27 показаний вплив Bio-Mos на адгезію E. coli, інактивованих етанолом, на планшетах, покритих слизом і висушених повітрям. Як значення погрішностей показані стандартні помилки середнього для повторюваних зразків. На Фігурі 28 показані абсолютні значення розкиду між планшетами для різних досліджених рівнів Bio-Mos. Повторні аналізи (лунки) того самого зразка показані у вигляді груп стовпчиків гістограми. На Фігурі 29 показані абсолютні значення розкиду між планшетами для різних досліджених рівнів Bio-Mos. Чотири графіка на Фігурі представляють аналізи, проведені в чотири різні дати, але з однією періодичною культурою E. coli. Повторні аналізи (лунки) того самого зразка показані у вигляді груп стовпчиків гістограми. На Фігурі 30 показані абсолютні значення розкиду між планшетами для різних досліджених рівнів Bio-Mos на різних графіках. Чотири групи стовпчиків на кожному графіку представляють аналізи, проведені в чотири різні дати, але з однією періодичною культурою E. coli. На Фігурі 31 показані відносні значення розкиду між планшетами для різних досліджених рівнів Bio-Mos. Стовпчики являють собою середні значення в повторюваних лунках аналізу, а показники розкиду показують значення стандартної помилки середнього. Аналізи виконували в чотири різні дати, але з однією періодичною культурою E. coli. На двох графіках показані ті самі дані, але відображені у різні способи для акцентування розкиду між планшетами (верхній графік) або дії Bio-Mos (нижній графік). На Фігурі 32 показані відносні значення розкиду дії Bio-Mos від культивування до культивування. Стовпчики на верхньому графіку являють собою середні значення в повторюваних лунках аналізу, а показники розкиду показують значення стандартної помилки середнього. Аналізи виконували незалежно один від одного, починаючи з виготовлення середовищ і буферів і культивування E. coli. На верхньому графіку показані значення виміряного сигналу, а на нижньому графіку - значення у порівнянні з контрольними лунками. На Фігурі 33 показана кількість повторюваних лунок, необхідна для детектування зазначених відмінностей між тестами за допомогою розробленої аналітичної методики. На Фігурі 34 показані сигнали, виміряні для п'яти (5) незалежних періодичних культивувань бактеріального препарату в присутності та під час відсутності Bio-Mos (2 нг/мл). На Фігурі 35 показані сигнали, виміряні для п'яти (5) незалежних партій планшетів зі слизом у присутності та під час відсутності Bio-Mos (2 нг/мл). На Фігурі 36 показані сигнали тесту через 1 і 2 тижні зберігання. На Фігурі 37 показаний планшет і ампула відповідно одному з варіантів реалізації винаходу у вакуумній упаковці. Визначення Для кращого розуміння винаходу нижче наведено визначення ряду термінів. У цьому описі термін "слиз" відноситься до відносно густого секрету, що виробляється і покриває частини травного тракту (наприклад, такого, що виробляється епітеліальними клітинами кишечнику і покриває їх). Слиз може містити один або кілька компонентів, наприклад, муцин, білки, глікопротеїни, ліпіди та гліколіпіди. Слиз також може включати один або кілька типів рецепторів (наприклад, такі, що розпізнають специфічні адгезивні білки). Адгезія і/або 4 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тісний зв'язок бактерій до слизу і/або клітин епітелію (наприклад, через шар слизу) може вносити вклад в адгезію бактерій до слизу і/або епітелію кишечнику (наприклад, за рахунок цього впливаючи на популяції бактерій, що населяють кишечник). Цей винахід не обмежується яким-небудь певним типом слизу або слизом, отриманим з якого-небудь певного джерела (наприклад, виду тварин) або області (наприклад, частини травного тракту (наприклад, клубової кишки (наприклад, проксимального, дистального відділів і т.д.), дванадцятипалої кишки, сліпої кишки, товстої кишки або інших частин травного тракту)). У цьому описі терміни "пептид", "поліпептид" і "білок" відносяться до первинної послідовності амінокислот, з'єднаних ковалентними "пептидними зв'язками". У загальному випадку пептид містить невелику кількість амінокислот, звичайно 2-50 амінокислот, і є більш коротким, ніж білок. Термін "поліпептид" включає пептиди і білки. У деяких варіантах реалізації пептид, поліпептид або білок є синтетичними, а в інших варіантах реалізації пептид, поліпротеїн або білок мають рекомбінантну або природне походження. Синтетичний пептид являє собою пептид, отриманий штучним шляхом in vitro (тобто не продукований in vivo). Терміни "зразок" і "проба" використовують у їх найбільш широкому значенні; вони включають зразки і проби, отримані з будь-якого джерела. У цьому описі термін "зразок" використовують стосовно біологічних зразків, отриманих з організму тварин (включаючи людину); він включає рідини, тверді речовини, тканини і гази. У деяких варіантах реалізації цього винаходу біологічні зразки включають цереброспінальну рідину (ЦСР), серозну рідину, сечу, слину, кров і препарати крові, наприклад, плазму, сироватку і т.п. У той же час, ці приклади не слід розглядати як приклади, що обмежують типи зразків, що знаходять застосування в рамках цього винаходу. У цьому описі терміни "хазяїн" і "суб'єкт" відносяться до будь-якої тварини, включаючи людину і тварини, які не є людиною (наприклад, собак, кішок, корів, коней, овець, домашніх птахів, риб, ракоподібних і т.д.), які є об'єктами дослідження, аналізу, тестування, діагностики або лікування, але не обмежуючись ними В цьому описі терміни "хазяїн", "суб'єкт" і "пацієнт" використовують на взаємозамінній основі, якщо не зазначено інше. У цьому описі термін "антитіло" (або "антитіла") відноситься до будь-якого імуноглобуліну, що специфічно зв'язується з антигенною детермінантою і специфічно зв'язується з білками, ідентичними або структурно подібними до антигенної детермінанти, що стимулювала їх продукцію. Таким чином, антитіла можна використовувати в аналітичних процедурах для детектування антигену, що стимулював їх продукцію. Моноклональні антитіла походять з одиночного клону B-лімфоцитів (тобто B-клітин) і в загальному випадку є однорідними за структурою і антигенною специфічністю. Поліклональні антитіла походять з множинних різних клонів клітин, що продукують антитіла, і, таким чином, є різнорідними за структурою та епітопною специфічністю, але розпізнають той самий антиген. У деяких варіантах реалізації моноклональні та поліклональні антитіла використовували у вигляді неочищених препаратів, у той час як у кращих варіантах реалізації ці антитіла очищали. Наприклад, у деяких варіантах реалізації використовували поліклональні антитіла, що містяться в неочищеній антисироватці. Крім того, припускають, що термін "антитіло" включає будь-який імуноглобулін (тобто IgG, IgM, IgA, IgE, IgD і т.д.), отриманий з будь-якого джерела (наприклад, людини, гризунів, нелюдиноподібних приматів, зайцеподібних, козлів, биків, коней, баранів і т.д.). У цьому описі термін "антиген" використовують стосовно будь-якої речовини, здатної розпізнаватися антитілом. Припускають, що цей термін включає будь-який антиген та "імуноген" (тобто речовина, що викликає утворення антитіл). Таким чином, у результаті імуногенної реакції відбувається продукція антитіл у відповідь на присутність антигену або фрагмента антигену. Терміни "антиген" та "імуноген" використовують по відношенню в окремій макромолекулі або до гомогенної або гетерогенній популяції антигенних макромолекул. Припускають, що терміни "антиген" та "імуноген" включають білкові молекули або фрагменти білкових молекул, що містять один або декілька епітопів. У багатьох випадках антигени також є імуногенами, таким чином, термін "антиген" часто використовують на взаємозамінній основі з терміном "імуноген". У деяких кращих варіантах реалізації імуногенні речовини використовують як антигени в аналітичних методиках для детектування присутності відповідних антитіл у сироватці імунізованої тварини. У цьому описі терміни "фрагмент антигену" і "частина антигену" і т.п. використовують стосовно частини антигену. Фрагменти або частини антигенів звичайно мають різний розмір від невеликої у відсотковому відношенні частини повнорозмірного антигену до значної частини, що не становить, однак, 100 % від розміру антигену. Однак ситуація, коли зазначено на "щонайменше частина" антигену, також передбачає можливість присутності повнорозмірного антигену (тобто не мається на увазі, що зразок, який тестується, містить тільки частини 5 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигенів). У деяких варіантах реалізації фрагменти і/або частини антигенів включають "епітоп", що розпізнається антитілом, у той час як в інших варіантах реалізації ці фрагменти і/або частини не включали епітоп, що розпізнається антитілом. Крім того, у деяких варіантах реалізації фрагменти і/або частини антигенів не були імуногенними, а в кращих варіантах реалізації фрагменти і/або частини антигенів є імуногенними. Терміни "антигенна детермінанта" і "епітоп" у цьому описі відносяться до тієї частини антигену, яка вступає в контакт з варіабельною областю конкретного антитіла. Якщо для імунізації тварини-хазяїна використовують фрагмент (або частину) білка, різні області білка, імовірно, індукують продукцію антитіл, що специфічно зв'язуються з даною областю або тривимірною структурою білка (ці області і/або структури називають "антигенними детермінантами"). У деяких умовах антигенні детермінанти конкурують із інтактним антигеном (тобто "імуногеном", використаним для стимуляції імунної відповіді) за зв'язування з антитілом. Терміни "специфічне зв'язування" і "що специфічно зв'язується" відповідно до взаємодії між антитілом і антигеном описують взаємодію, що залежить від присутності певної структури (наприклад, антигенної детермінанти або епітопа) у складі антигену. Інакше кажучи, антитіло розпізнає і зв'язується з білковою структурою, унікальною для антигену, але не здійснює зв'язування з усіма білками в цілому (тобто неспецифічне зв'язування). У цьому описі термін "імуноаналіз" відноситься до аналізу, у якому використовується щонайменше одне специфічне антитіло для детектування або визначення кількості антигену. Імуноаналіз включає вестерн-блоттінг, твердофазний ІФА, радіоімуноаналіз та імунофлуоресцентний аналіз. У цьому описі термін "твердофазний ІФА" (ELISA) відноситься до твердофазного імуноферментного аналізу. Відомі різні способи і варіанти застосування твердофазного ІФА, описані в багатьох джерелах (див., наприклад, Crowther, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", in Molecular Biomethods Handbook, Rapley et al. (eds.), pp. 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, N.J. (1998); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)). Крім того, існують численні доступні для придбання тестсистеми на основі твердофазного ІФА. У цьому описі терміни "репортерний реагент", "репортерна речовина", "субстрат, що детектує" і "реагент, що детектує" використовують відносно реагентів, що забезпечують можливість детектування і/або кількісного визначення антитіла, пов'язаного з антигеном. Наприклад, у деяких варіантах реалізації репортерний реагент є колориметричним субстратом для ферменту, кон'югованого з антитілом. Додавання прийнятного субстрату до кон'югату антитіло-фермент приводить до утворення колориметричного або флуориметричного сигналу (наприклад, після зв'язування кон'югованого антитіла з цільовим антигеном). Інші репортерні реагенти включають радіоактивні сполуки, але не обмежуються ними. Це визначення також включає використання сполук на основі біотину та авідину (наприклад, включаючи нейтравідин і стрептавідин, але не обмежуючись ними) як компоненти системи детектування. У цьому описі термін "сигнал" використовують у цілому відносно будь-якого процесу, що піддається детектуванню і вказує на виникнення реакції, наприклад, зв'язування антитіла з антигеном. Припускають, що в рамках цього винаходу можуть застосовуватися сигнали у вигляді радіоактивності, флуориметричних або колориметричних продуктів/реагентів. У різних варіантах реалізації відповідно до цього винаходу виконують якісну оцінку сигналу, у той час як в альтернативних варіантах реалізації сигнал оцінюють кількісно. У цьому описі термін "твердий носій" використовують відносно будь-якого твердого або стаціонарного матеріалу, до якого приєднують такі реагенти, як антитіла, антигени та інші компоненти аналізу. Наприклад, у методиці твердофазного ІФА твердим носієм є лунки титраційних мікропланшетів. Інші приклади твердих носіїв включають предметне скло для мікроскопії, покривне скло, гранули, частинки, колби для культивування клітин, а також багато інших прийнятних об'єктів. У цьому описі термін "ефективна кількість" відноситься до кількості композиції, достатньої для досягнення сприятливих або бажаних результатів. Ефективну кількість можна вводити і/або поєднувати з іншим матеріалом під час одного або декількох введень, нанесень або дозувань; воно не повинно обмежуватися конкретним складом або шляхом введення. У цьому описі терміни "введення" і "що вводиться" відносяться до внесення лікарського засобу, проліків або іншого агента, або терапевтичного засобу (наприклад, агента, ідентифікованого як модулятор адгезії бактерій до слизу за допомогою використання способів згідно з цим винаходом) в організм суб'єкта (наприклад, власне суб'єкта або в клітини, тканини та органі in vivo, in vitro або ex vivo). Типові шляхи введення можуть полягати у введенні через 6 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 очі (офтальмічно), рот (перорально), шкіру (місцево або трансдермально), ніс (назально), легені (шляхом інгаляції), слизову рота (буккально), вуха, ректально, вагінально, за допомогою ін'єкції (наприклад, внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньотуморально, внутрішньочеревнево і т.д.) і т.п. У цьому описі терміни "спільне введення" або "що спільно вводиться" відносяться до введення щонайменше двох агентів (наприклад, агента, ідентифікованого як модулятор адгезії бактерій до слизу за допомогою використання способів згідно з цим винаходом та одного або декількох інших агентів (наприклад, терапевтичного засобу для лікування розладів, викликаних патогенними бактеріями) в організм суб'єкта і/або в матеріал (наприклад, корм (наприклад, для годівлі тварин))). У деяких варіантах реалізації спільне введення двох або декількох агентів або терапевтичних засобів є одночасним. В інших варіантах реалізації перший агент/терапевтичний засіб вводили до введення другого агента/терапевтичного засобу. Фахівцям зрозуміло, що склади і/або шляхи введення різних агентів або терапевтичних засобів можуть різнитися. Адекватне дозування для спільного введення може легко визначити фахівець. У деяких варіантах реалізації, якщо агенти або терапевтичні засоби вводили спільно, відповідні агенти, або терапевтичні засоби вводили і/або становили в більш низьких дозуваннях у порівнянні з адекватними дозуваннями по їх роздільному введенню і/або складанні. Таким чином, спільне введення є особливо бажаним у варіантах реалізації, де спільне введення / спільне складання агентів або терапевтичних засобів знижує необхідне дозування потенційно шкідливого (наприклад, токсичного) агента(ів) і/або якщо спільне введення двох або декількох агентів або терапевтичних засобів приводить до підвищенні чутливості суб'єкта до сприятливої дії одного із цих агентів у результаті спільного введення другого агента. У цьому описі "лікування після колонізації" або "пост-нанесення" відноситься до лікування після усунення інфекційного захворювання. У цьому описі "попереднє нанесення" і/або "профілактичне лікування" відноситься до лікування, що використовується як попереджувальний захід (наприклад, для запобігання інфекції і/або захворювання). У цьому описі терміни "захворювання" і "патологічний стан" використовують взаємозамінно для опису стану, ознак і/або симптомів, асоційованих з порушеннями нормального стану живої тварини або будь-якого з її органів або тканин, який порушує або змінює виконання нормальних функцій і може бути відповіддю на вплив факторів навколишнього середовища (наприклад, недостатнє харчування, виробничий ризик або клімат), специфічних інфекційних агентів (наприклад, хробаків, бактерій або вірусів), вроджений дефект організму (наприклад, різні генетичні аномалії або їх комбінації та інші фактори). У цьому описі термін "що страждає захворюванням" відноситься до суб'єкта (наприклад, тварини або людини), що переносить певне захворювання. Не передбачається, що цей винахід обмежується якими-небудь певними ознаками, симптомами або захворюванням. Таким чином, передбачається, що цей винахід включає суб'єктів, що страждають захворюванням будь-якого ступеня важкості (наприклад, від доклінічних проявів до розгорнутої картини захворювання), де у суб'єкта проявляються щонайменше деякі з проявів (наприклад, ознак або симптомів), асоційованих з певним захворюванням. У цьому описі термін "токсичний" відноситься до будь-якого шкідливого або ушкоджуючого впливу на суб'єкт, клітину або тканину у порівнянні з тою ж клітиною або тканиною до введення токсичного агента. У цьому описі термін "функціональний харчовий інгредієнт" або "функціональна харчова добавка" відноситься до комбінації активного агента (наприклад, агента, ідентифікованого як модулятор адгезії бактерій до слизу) з інертним або активним носієм, що робить композицію особливо прийнятною для діагностичного або терапевтичного застосування in vitro, in vivo або ex vivo. У цьому описі термін "носій" відноситься до будь-яких стандартних носіїв, включаючи фізіологічний розчин з фосфатним буфером, воду, емульсії (наприклад, емульсії типу олія/вода або вода/олія), різні типи зволожувачів, усілякі розчинники, диспергуючі середовища, покриття, лаурилсульфат натрію, ізотонічні агенти та агенти, що затримують усмоктування, розпушувачі (наприклад, картопляний крохмаль або карбоксиметилкрохмаль натрію), серцевину кукурудзяних качанів, сушену барду, пшеничні висівки, дріжджі (наприклад, відпрацьовані дріжджі), компоненти дріжджів (наприклад, екстракт клітинної стінки дріжджів) і т.п., але не обмежується ними. Композиції також можуть включати стабілізатори і консерванти. Приклади носіїв, стабілізаторів і ад'ювантів див., наприклад, у роботі Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1975), включеної в цей документ за допомогою посилання). 7 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цьому описі термін "травлення" відноситься до перетворення їжі, кормів або інших органічних сполук в усмоктувальну форму; до розм'якшення, розкладання або руйнування під дією температури, вологості або хімічного впливу. У цьому описі "травна система" відноситься до системи (включаючи шлунково-кишковий тракт), у якій може відбуватися або відбувається травлення. У цьому описі термін "корми" відноситься до матеріалу(ів), що споживаються тваринами і служать джерелом енергії і/або живильних речовин у раціоні тварин. Приклади кормів включають повну кормову суміш (TMR), фураж, кормові гранули, концентрат(и), кормову(і) суміш(і), зерно, барду, мелясу, клітковину, грубі корми, траву(и), сіно, ядра горіхів, листи, борошно, розчинне(і) речовину(и) і добавку(и), але не обмежується ними. У цьому документі термін "тварина" відноситься до представників царства Тварин. Він включає худобу, сільськогосподарських тварин, свійських тварина, кімнатних тварин, морських і прісноводних тварин та диких тварин. У цьому описі термін "фармацевтично прийнятна сіль" відноситься до будь-якої солі (наприклад, отриманої в ході реакції з кислотою або основою) сполуки відповідно до цього винаходу (наприклад, включаючи життєздатні клітини дріжджів або компоненти клітинної стінки згідно з винаходом), фізіологічно стерпної суб'єктом-мішенню (наприклад, ссавцем, людиною, птахами, биками, свинями, вівцями, козлами, псовими, котячими, рибами, верблюдами, видами гризунів, а також суб'єктами-рибами і ракоподібними та молюсками, і/або клітинами, тканинами або органами in vivo або ex vivo). "Солі" сполук відповідно до цього винаходу можна одержати з неорганічних або органічних кислот і основ. Приклади кислот включають соляну, бромводневу, сірчану, азотну, хлорну, фумарову, яблучну, фосфорну, гліколеву, молочну, саліцилову, бурштинову, толуол-p-сульфонову, винну, оцтову, лимонну, метансульфонову, етансульфонову, мурашину, бензойну, малонову, сульфонову, нафталін-2-сульфонову, бензолсульфонову кислоту і т.п., але не обмежуються ними. Інші кислоти, наприклад, щавлева, хоча й не є фармацевтично прийнятними самі по собі, можуть бути використані при виготовленні солей, прийнятних як інтермедіати при одержанні сполук згідно з винаходом і їх фармацевтично прийнятних солей приєднання кислоти. Приклади основ включають гідроксиди лужних металів (наприклад, натрію), гідроксиди лужноземельних металів (наприклад, магнію), аміак і сполуки формули NW 4+, де W являє собою C1-4-алкіл, і т.п., але не обмежуються ними. Приклади солей включають ацетат, адипінат, альгінат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бісульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропіонат, диглюконат, додецилсульфат, етансульфонат, фумарат, глюкогептонат, гліцерофосфат, гемісульфат, гептаноат, гексаноат, хлорид, бромід, йодид, 2гідроксиетансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталінсульфонат, нікотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенілпропіонат, пікрат, півалат, пропіонат, сукцинат, тартрат, тіоцианат, тозилат, ундеканоат і т.п., але не обмежуються ними. Інші приклади солей включають аніони сполук відповідно до цього винаходу, об'єднані з прийнятним катіоном, наприклад, Na+, NH4+ і NW 4+ (де W являє собою C C1-4-алкільну групу) і т.п. Для терапевтичних цілей припускають, що солі сполук згідно з цим винаходом є фармацевтично прийнятними. Однак солі кислот і основ, які не є фармацевтично прийнятними, також можуть знаходити застосування, наприклад, при одержанні або очищенні фармацевтично прийнятної сполуки. Для терапевтичних і/або профілактичних цілей припускають, що солі сполук згідно з цим винаходом є фармацевтично прийнятними. Однак солі кислот і основ, які не є фармацевтично прийнятними, також можуть знаходити застосування, наприклад, при одержанні або очищенні фармацевтично прийнятної сполуки. У цьому описі термін "культура клітин" відноситься до будь-якої культури клітин in vitro. Цей термін включає стабільні клітинні лінії (наприклад, з іморталізованим фенотипом), первинні клітинні культури, трансформовані клітинні лінії, клітинні лінії, що перевиваються (наприклад, нетрансформовані клітини), і будь-яку іншу популяцію клітин, підтримувану in vitro. У цьому описі термін "еукаріот" відноситься до організмів, що відрізняються від "прокаріот". Припускають, що цей термін включає всі організми, клітини яких мають типові характеристики еукаріот, наприклад, наявністю справжнього ядра, оточеного ядерною мембраною, усередині якого розташовуються хромосоми, наявністю мембранозв'язаних органоїдів та іншими характеристиками, що звичайно спостерігаються в еукаріотических організмах. Так, цей термін включає такі організми, як гриби, найпростіші і тварини (наприклад, людина), але не обмежується ними. У цьому описі термін "in vitro" відноситься до штучного оточення і до процесів або реакцій, що відбуваються в штучному оточенні. Середовища in vitro можуть складатися із пробірки і 8 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинної культури, але не обмежуються ними. Термін "in vivo" відноситься до природного оточення (наприклад, клітині або організму тварини) і до процесів або реакцій, що відбуваються в природному оточенні. У цьому описі термін "зразок" використовують у його найбільш широкому значенні. У деякому сенсі, мають на увазі, що він включає пробу або культуру, отриману з будь-якого джерела, а також біологічні зразки і зразки з навколишнього середовища. Біологічні зразки можна одержати з тварин (включаючи людину) і включають рідини, тверді речовини, тканини та гази. Біологічні зразки включають препарати крові, наприклад, плазму, сироватку і т.п. Зразки з навколишнього середовища включають матеріал з навколишнього середовища, наприклад, матеріал поверхні, ґрунт, воду, кристали та промислові зразки. Однак такі приклади не слід розглядати як обмежуючі типи зразків, що застосовуються в рамках цього винаходу. У цьому описі термін "діагностичний набір" відноситься до упакованого набору матеріалів. У цьому описі "модулятори анти-адгезії" відносяться до модуляторів, що блокують адгезію (наприклад, що блокують адгезію сполук до фімбрій і/або що блокують адгезію бактерій до слизу, клітин епітелію і/або до інших типів клітин). Докладний опис винаходу Показано, що аналіз зв'язування з використанням радіоактивних речовин дозволяє вимірювати адгезію бактерій до слизу кишечнику, і деякі агенти ефективно запобігають такій адгезії (див., наприклад, роботу Conway, et al., 1990, Infection and Immunity 58:3178-3182, зміст якої повністю включено в цей документ за допомогою посилання). Зокрема, аналіз зв'язування з використанням радіоактивних речовин, що дозволяє вимірювати адгезію бактерій до слизу кишечнику, також показав дію Bio-Mos, манопротеїну клітинної стінки Saccharomyces cerevisiae, у відношенні інгібування адгезії бактерій. У той же час, розповсюджені способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу без використання радіоактивних речовин відсутні. Способи і композиції відповідно до цього винаходу долають ці обмеження, представляючи способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу без використання радіоактивних речовин. Зокрема, цей винахід забезпечує просту і точну методику імуноаналізу для вимірювання адгезії бактерій до слизу і для тестування дії продуктів, що модулюють (наприклад, що пригнічують, стимулюють) адгезію. У деяких варіантах реалізації ця методика імуноаналізу являє собою вестерн-блоттінг. У деяких варіантах реалізації ця методика імуноаналізу являє собою радіоімуноаналіз. У деяких варіантах реалізації ця методика імуноаналізу являє собою імунофлуоресцентний аналіз. У деяких варіантах реалізації ця методика імуноаналізу являє собою аналіз на основі твердофазного ІФА. Спосіб на основі твердофазного ІФА є привабливою альтернативою радіоактивному аналізу внаслідок гнучкості у використанні за рахунок різних комбінацій первинних і вторинних антитіл і різних колориметричних систем детектування для різних видів мікроорганізмів. Відповідно, цей винахід забезпечує способи на основі твердофазного ІФА для детектування та ідентифікації адгезії бактерій до слизу (наприклад, слизової кишечнику). Таким чином, у деяких варіантах реалізації цей винахід забезпечує колориметричний аналіз без використання радіоактивних речовин для моніторингу і/або дослідження характеристик взаємодії (наприклад, зв'язування, приєднання, афінності і т.д.) між слизом і бактеріальними клітинами. У деяких варіантах реалізації аналіз без використання радіоактивних речовин є настільки ж чутливим і/або більш чутливим, ніж радіоактивний аналіз, що використовується для аналогічного моніторингу і/або дослідження характеристик. У деяких варіантах реалізації колориметричний аналіз без використання радіоактивних речовин згідно з винаходом використовують для моніторингу і/або опису активності одного або декількох агентів, що тестуються, змінювати (наприклад, пригнічувати або підсилювати) взаємодію бактеріальних клітин (наприклад, зв'язування, приєднання, афінності і т.д.) зі слизом. Наприклад, у деяких варіантах реалізації цей винахід забезпечує імуносорбент, пов'язаний з ферментом, як спосіб аналізу (твердофазного ІФА) для моніторингу і/або дослідження характеристик взаємодії (наприклад, зв'язування, приєднання, афінності і т.д.) між слизом і бактеріальними клітинами (наприклад, згідно з описом у Прикладах 1-16). У деяких варіантах реалізації аналіз виконують при кімнатній температурі. У деяких варіантах реалізації аналіз виконують при 37 °C. У деяких варіантах реалізації аналіз оптимізують згідно з описом у Прикладах 2-15. У деяких варіантах реалізації планшети (наприклад, титраційні мікропланшети (наприклад, планшети MAXISORP (наприклад, що містять 6, 12, 24, 48, 96, 128 або більше лунок))) покривають слизом. Це дослідження не обмежується певними типами, джерелами або кількістю слизу. У деяких варіантах реалізації слиз, що використовується, являє собою слиз тварин. У деяких варіантах реалізації слиз одержують зі свині, курчати, корови, коня, собаки, 9 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кішки або іншої тварини. У деяких варіантах реалізації слиз одержують з однієї або декількох частин травного тракту. Наприклад, у деяких варіантах реалізації слиз одержують з клубової кишки (наприклад, проксимальної клубової кишки, дистальної клубової кишки і т.д.), дванадцятипалої кишки, сліпої кишки, товстої кишки і/або інших частин травного тракту. Цей винахід не обмежується відносно кількості слизу, що використовується для покриття планшетів (наприклад, залежно від кількості і/або розміру лунок на планшеті. У деяких варіантах реалізації слиз розбавляють у буфері для імобілізації і потім використовують для покриття планшетів. У деяких варіантах реалізації буфер для імобілізації являє собою розчин, що містить 1 літр води, у якому розчиняють 1,6 г Na2CO3, 2,94 г NaHCO3 і 0,2 г азиду Na, а pH доводять до значення 9,6, або аналогічний буфер. У деяких варіантах реалізації для покриття кожної лунки планшета використовують буфер для імобілізації, що містить приблизно 0,001-0,2 мг білка слизу на мл буфера для імобілізації, хоча можна використовувати більш високі (наприклад, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,75 мг/мл, 1,0 мг/мл або більше) або менші (наприклад, 0,0005 мг/мл або менше) кількості. У деяких варіантах реалізації для покриття кожної лунки використовують приблизно 300 мкл суспензії для імобілізації, хоча можна використовувати більші (наприклад, 400 мкл, 500 мкл, 600 мкл, 700 мкл або більш) або менші (наприклад, 200 мкл, 100 мкл, 50 мкл, 25 мкл або менше) об'єми суспензії для імобілізації (наприклад, залежно від розміру лунки, бажаного рівня сигналу або інших факторів (наприклад, адгезії бактерій)). Після внесення розчину для імобілізації в лунки слиз інкубують у кожній лунці протягом певного періоду часу (наприклад, приблизно 1 годину, приблизно 2 години, приблизно 3 години, приблизно 6 годин, приблизно 12 годин, приблизно 24 години або більше) при постійній температурі (наприклад, 4 °C, кімнатній температурі або вище (наприклад, 37 °C)). У деяких варіантах реалізації планшети покривають під час інкубації (наприклад, для запобігання випаровування розчину для імобілізації). Іноді під час періоду імобілізації готують досліджуваний агент (наприклад, агент, який слід протестувати на здатність змінювати (наприклад, пригнічувати і/або підсилювати) зв'язування бактерій зі слизом). Досліджуваний агент розбавляють у будь-якому прийнятному буфері (наприклад, у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (ФБР) (наприклад, розчині ФБР, отриманому шляхом розчинення 8,0 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,4 г Na 2HPO4 × 2H2O, 0,2 г KH2PO4 в 1 л води і доведення pH до 7,4). Це дослідження не обмежується певними типами агентів, що тестуються. Фактично різноманіття агентів, що тестуються, можна відслідковувати і/або описувати за допомогою способів згідно з винаходом, включаючи способи, описані в цьому документі, але не обмежуючись ними. Після завершення покриття розчин для імобілізації видаляють з лунок (наприклад, без перемішування вмісту лунок) і промивають кожну лунку відповідним об'ємом (наприклад, 100 мл, 200 мл, 300 мл, 400 мл або більше) розчину, що промиває (наприклад, ФБР). Бактерії, для як слід викона моніторинг і/або дослідження взаємодії зі слизом, підготовлювали, збираючи бактерії за умов, що не ушкоджують. Це дослідження не обмежується яким-небудь певним типом бактерій або якою-небудь певною фазою росту бактерій. Фактично різноманіття бактерій можна відслідковувати і/або описувати за допомогою аналітичної методики згідно з винаходом, включаючи види бактерій, описані в цьому документі, але не обмежуючись ними. Після збору (наприклад, шляхом центрифугування з метою осадження бактеріальних клітин) бактерії ресуспендують у буфері (наприклад, ФБР) до бажаної концентрації, що залежить від бажаної кількості бактерій на лунку. У деяких варіантах реалізації кількість бактерій, внесених на лунку, становить приблизно 107, хоча в кожну лунку можна вносити більше (наприклад, 108, 109, 1010) або менше (наприклад, 106, 105, 104) кількість бактерій. Після кінцевого промивання планшетів у лунки вносять бактерії. У деяких варіантах реалізації до суспензії бактерій безпосередньо перед внесенням у лунки додають розчин агента, що тестується. Кількість агента, що тестується, і кількість клітин могла змінюватися згідно з описом у цьому документі. Після внесення в лунки бактерії і/або бактерії у комбінації з агентом, що тестується, інкубують у лунках протягом заданого часу (наприклад, 1 години, 2 годин, 4 годин, 8 годин або більше). Після інкубації лунки промивають (наприклад, один, два, три або більше разів ФБР). Після промивання в кожну лунку вносять блокувальний буфер (наприклад, ембріональну бичачу сироватку (FBS), бичачий сироватковий альбумін (БСА), молоко або інший прийнятний блокувальний агент (наприклад, 10 % FBS, розведену ФБР), наприклад, використовуючи об'єм блокувального буфера, що рівний об'єму, використаному при покритті лунок слизом. Блокувальний розчин інкубують у лунках протягом заданого часу (наприклад, приблизно 1 години, приблизно 2 годин, приблизно 3 годин або більше) при постійній температурі (наприклад, 4 °C, кімнатній температурі або вище (наприклад, 37 °C)). Блокувальний буфер видаляли, після чого в лунки вносять первинні антитіла (наприклад, антитіла зі специфічною афінністю до бактерій, у відношенні яких виконують моніторинг або 10 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дослідження). Первинні антитіла розбавляють (наприклад, 1:500, 1:1000, 1:2500, 1:5000 або більше) блокувальним буфером. У лунки вносять від приблизно 100 мкл до приблизно 400 мкл (наприклад, 200 мкл) розведених первинних антитіл та інкубують їх у лунках протягом заданого часу (наприклад, приблизно 1 години, приблизно 2 годин, приблизно 3 годин або більше) при постійній температурі (наприклад, 4 °C, кімнатній температурі або вище (наприклад, 37 °C)). Цей винахід не обмежується у відношенні первинних антитіл, що використовуються. Фактично можна використовувати будь-які антитіла зі специфічною афінністю до виду бактерій, у відношенні яких виконують моніторинг і/або дослідження. У деяких варіантах реалізації первинні антитіла є поліклональними антитілами. У деяких варіантах реалізації первинні антитіла є моноклональними антитілами. У деяких варіантах реалізації первинні антитіла являють собою фрагменти антитіл. У деяких варіантах реалізації первинні антитіла є кон'югованими антитілами. Наприклад, у деяких варіантах реалізації первинні антитіла кон'юговані з біотином. У деяких варіантах реалізації первинні антитіла є поліклональними антитілами до E. coli, кон'югованими з біотином. Після інкубації з первинними антитілами лунки промивали (наприклад, один, два, три або більше разів) буфером, що промиває (наприклад, ФБР). Буфер, що промиває, видаляли, після чого в лунки вносять вторинні антитіла (наприклад, антитіла зі специфічною афінністю до первинних антитіл). Вторинні антитіла також розбавляють (наприклад, 1:500, 1:1000, 1:2500, 1:5000 або більше) блокувальним буфером. Цей винахід не обмежується у відношенні вторинних антитіл, що використовуються. У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла були поліклональними антитілами. У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла були моноклональними антитілами. У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла являють собою фрагменти антитіл. У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла є кон'югованими антитілами. У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла кон'юговані зі стрептавідином. У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла кон'юговані з ферментом (наприклад, пероксидазою, фосфатузою і т.д.). У лунки вносять від приблизно 100 мкл до приблизно 400 мкл (наприклад, 200 мкл) розведених вторинних антитіл та інкубують їх у лунках протягом заданого часу (наприклад, приблизно 1 години, приблизно 2 годин, приблизно 3 годин або більше) при постійній температурі (наприклад, 4 °C, кімнатній температурі або вище (наприклад, 37 °C)). Після інкубації лунки промивали (наприклад, два, три, чотири, п'ять або більше разів) буфером, що промиває (наприклад, ФБР). Після останнього промивання в лунки вносять колориметричний субстрат. Це дослідження не обмежується відносно типу використовуваного субстрату. Типові субстрати включають 3,3",5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ) (наприклад, для вторинних антитіл, кон'югованих з пероксидазою), P-нітрофенілфосфат (pNPP) (наприклад, для антитіл, кон'югованих з фосфатузою), і т.д.), але не обмежуються ними. Фарбування, що розвивається в лунках, детектують і/або вимірюють (наприклад, за допомогою спектрофотометра). Розвиток забарвлення можна зупинити шляхом додавання кислого буфера (наприклад, 2M H2SO4) у будь-який момент (наприклад, для запобігання одержання сильного кольорового сигналу (наприклад, з метою кількісної оцінки приєднання бактерій)). Це дослідження не обмежується відносно способу на основі твердофазного ІФА для детектування, ідентифікації і вимірювання адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації запропоновані способи, у яких 1) планшети для використання в аналітичній методиці на основі твердофазного ІФА покривають зразком слизу; 2) на планшети, покриті слизом, наносять бактерії; 3) вносять первинні антитіла проти бактерій; 4) вносять вторинні антитіла проти первинних антитіл; 5) вносять рідкий субстрат і 6) вимірюють адгезію бактерій. У деяких варіантах реалізації між однією або декількома стадіями вводять стадії промивання. У деяких варіантах реалізації між однією або декількома стадіями вносять блокувальний розчин. Ці способи не обмежуються певними типами або видами зразків слизу, бактерій, первинних антитіл, вторинних антитіл, рідкого субстрату і/або методик вимірювання адгезії бактерій. Способи детектування, ідентифікації і вимірювання адгезії бактерій до слизу не обмежуються певним типом бактерій. Фактично, у цьому винаході можна використовувати будьякі типи бактерій. Приклади бактерій включають Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes/Chlorobi, Chlamydiae/Verrucomicrobia, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria, і Thermotogae, але не обмежуються ними. У деяких варіантах реалізації бактерії були патогенними бактеріями, наприклад, Bordetella (наприклад, Bordetella pertussis), Borrelia (наприклад, Borrelia burgdorferi), Brucella (наприклад, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis), Campylobacter (наприклад, Campylobacter jejuni), Chlamydia (наприклад, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis), Clostridium (наприклад, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, 11 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Clostridium perfringens, Clostridium tetani), Corynebacterium (наприклад, Corynebacterium dipHtheriae), Enterococcus (наприклад, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecum), Escherichia (наприклад, Escherichia coli), Francisella (наприклад, Francisella tularensis), Haemophilus (наприклад, Haemophilus influenzae), Helicobacter (наприклад, Helicobacter pylori), Legionella (наприклад, Legionella pneumophila), Leptospira (наприклад, Leptospira interrogans), Listeria (наприклад, Listeria monocytogenes), Mycobacterium (наприклад, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis), Mycoplasma (наприклад, Mycoplasma pneumoniae), Neisseria (наприклад, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis), Pseudomonas (наприклад, Pseudomonas aeruginosa), Rickettsia (наприклад, Rickettsia rickettsii), Salmonella (наприклад, Salmonella typHi, Salmonella typHimurium), Shigella (наприклад, Shigella sonnei), Staphylococcus (наприклад, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus sapropHyticus), Streptococcus (наприклад, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes), Treponema (наприклад, Treponema pallidum), Vibrio (наприклад, Vibrio cholerae), and Yersinia (наприклад, Yersinia pestis). У деяких варіантах реалізації бактерії вибирають з певних штамів E. coli, для яких показана сильна адгезія до слизу свині (наприклад, E. coli ALI84 і/або ALI446). Це дослідження не обмежується певним способом підготовки і/або використання бактерій у рамках способів на основі твердофазного ІФА для детектування, ідентифікації і вимірювання адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації бактерії інактивують до використання (наприклад, для цілей зберігання) і активують під час тестування. Ці способи не обмежуються певним способом інактивації бактерій. Приклади інактивації бактерій включають заморожування бактерій, суспендування бактерій з етанолом, суспендування бактерій з глутаральдегідом, суспендування бактерій з формаліном, опромінення бактерій ультрафіолетом, суспендування бактерій з диметилсульфоксидом і нагрівання бактерій перед зберіганням в охолодженому виді. Ці способи не обмежуються певним способом активації інактивованих бактерій для цілей тестування. У деяких варіантах реалізації бактерії активують (наприклад, збирають) за допомогою методик центрифугування. Ці способи не обмежуються певним способом інактивації бактерій етанолом. У деяких варіантах реалізації бактерії до інактивації (наприклад, за добу до інактивації) етанолом вирощують і переносять у свіже середовище (наприклад, 10 % інокулят). Потім бактерії інактивують і фіксують шляхом додавання етанолу безпосередньо до бактеріальної культури (наприклад, до кінцевої концентрації, приблизно рівної 40 % об/об (наприклад, 20 % об/об; 30 % об/об; 33 % об/об; 35 % об/об; 37 % об/об; 40 % об/об; 42 % об/об; 45 % об/об; 50 % об/об; 60 % об/об). У деяких варіантах реалізації бактерії, інактивовані етанолом (наприклад, у кінцевій концентрації приблизно 40 % об/об), зберігають при приблизно +4 °C (наприклад, 2 °C; 3 °C; 4 °C; 5 °C; 6 °C). У деяких варіантах реалізації бактерії, інактивовані етанолом (наприклад, у кінцевій концентрації приблизно 40 % об/об) (наприклад, що зберігалися при приблизно +4 °C), активують (наприклад, збирали) шляхом центрифугування. У деяких варіантах реалізації бактерії суспендують у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (наприклад, ФБР) (наприклад, 8,0 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,4 г Na2HPO4 × 2H2O, 0,2 г KH2PO4, з додаванням 1000 мл MilliQ H2O, pH 7,4). Способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу не обмежуються певним типом слизу. Фактично, у цьому винаході можна використовувати слиз будь-якого типу. У деяких варіантах реалізації слиз, що використовують, одержують зі свині (наприклад, слиз із товстої кишки свині) (наприклад, слиз із кишечнику свині (наприклад, зіскоблена з проксимального відділу клубової кишки однорічної свині)). Це дослідження не обмежується певним способом підготовки і/або використання зразків слизу (наприклад, слизу свині) у рамках способів на основі твердофазного ІФА для детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації зразки слизи суспендують у буфері для імобілізації. Ці способи не обмежуються певним складом буфера для імобілізації. У деяких варіантах реалізації буфер для імобілізації містив 1,6 г Na2CO3 (сухого), 2,94 г NaHCO3, 0,2 г азиду Na, 11 H2O при pH 9,6 (кінцевий pH після змішування компонентів повинен скласти 9,7). У деяких варіантах реалізації зразки слизу наносять на планшети (наприклад, у лунки) (наприклад, 96-ямкові планшети) (наприклад, 96-ямкові планшети MaxiSorp) для використання в аналітичних методиках на основі твердофазного ІФА. Зразки слизу не обмежуються певним способом нанесення на планшети для використання в аналітичних методиках на основі твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації зразки слизу просто наносять на планшети безпосередньо перед тестуванням. У деяких варіантах реалізації зразки планшети попередньо покривають слизом з метою тривалого зберігання перед тестуванням. Ці способи не 12 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмежуються певними способами попереднього покриття планшетів для використання в аналітичних методиках на основі твердофазного ІФА зразками слизу (наприклад, слизу з кишечнику свині). У деяких варіантах реалізації попереднє покриття планшетів для використання в аналітичних методиках на основі твердофазного ІФА зразками слизу здійснюють шляхом покриття планшетів зразками слизу з наступним заморожуванням покритих планшетів. У деяких варіантах реалізації попереднє покриття планшетів для використання в аналітичних методиках на основі твердофазного ІФА зразками слизу здійснюють шляхом покриття планшетів зразками слизу з наступним висушуванням покритих планшетів повітрям. Ці способи не обмежуються певним способом розмочування зразків слизу, попередньо нанесених на планшети для використання в аналітичних методиках на основі твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації розмочування здійснюють шляхом обробки фізіологічним розчином з фосфатним буфером (наприклад, ФБР) (наприклад, 8,0 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,4 г Na2HPO4 × 2H2O, 0,2 г KH2PO4, з додаванням 1000 мл MilliQ H2O, pH 7,4) на зразки. Способи детектування, ідентифікації і вимірювання адгезії бактерій до слизу не обмежуються певним типом первинних антитіл. У деяких варіантах реалізації первинні антитіла являють собою антитіла до бактерій, адгезію яких досліджували раніше. У деяких варіантах реалізації первинні антитіла представляють собою поліклональні антитіла до антигенних серотипів О і K E. coli кон'юговані з ПХ (номер у каталозі Acris BP2022HRP). У деяких варіантах реалізації первинні антитіла являють собою поліклональні антитіла до антигенних серотипів О і K E. coli (номер у каталозі Acris BP2022). У деяких варіантах реалізації первинні антитіла являють собою поліклональні антитіла до антигенних серотипів О і K E. coli, кон'юговані з біотином (номер у каталозі Acris BP1021B). Способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу не обмежуються певним типом вторинних антитіл. У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла призначені для детектування зв'язування первинного антитіла з бактеріями, зв'язаними зі слизом. У силу цього в деяких варіантах реалізації вторинні антитіла спрямовані проти первинних антитіл. У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла являють собою афінно очищені антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з ПХ (номер у каталозі Acris R1317HRP). У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла являють собою афінно очищені антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з ЛФ (номер у каталозі Acris R1317AP). У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла являють собою поліклональні антитіла до IgG кози, кон'юговані з FITC (H&L) (номер у каталозі Acris R13 17F). У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла являють собою стрептавідин-лужну фосфатузу з Streptomyces avidinii (номер у каталозі Sigma S2890). У деяких варіантах реалізації вторинні антитіла являють собою стрептавідин-пероксидазу з Streptomyces avidinii (номер у каталозі Sigma S5512). У деяких варіантах реалізації первинні та вторинні антитіла розбавляють блокувальним розчином. Ці способи не обмежуються певним типом блокувального розчину. У деяких варіантах реалізації блокувальний розчин являє собою молоко. У деяких варіантах реалізації блокувальний розчин являє собою ембріональну бичачу сироватку (FBS). У деяких варіантах реалізації блокувальний розчин являє собою бичачий сироватковий альбумін (БСА). Способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу не обмежуються певним типом рідкого субстрату. У деяких варіантах реалізації рідкий субстрат являє собою 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) (номер у каталозі Sigma T4319) для детектування зв'язування первинних антитіл і/або вторинних антитіл під час аналізу. У деяких варіантах реалізації рідкий субстрат являє собою форму ТМБ з повільною кінетикою (далі ТМБ повільний) (номер у каталозі Sigma T0440). У деяких варіантах реалізації рідкий субстрат являє собою надчуттєву форму ТМБ (далі ТМБ супер) (номер у каталозі Sigma T0440). У деяких варіантах реалізації рідкий субстрат являє собою P-нітрофенілфосфат (номер у каталозі Sigma N7653). У деяких варіантах реалізації рідкий субстрат являє собою 2,2’-азин-біс(3етилбензотіазолін-6-сульфонову кислоту) (AzBTS; номер у каталозі Sigma A3219) + підсилювач ABTS для мікролунок (номер у каталозі Sigma AI227). Способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу не обмежуються певною методикою вимірювання адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації адгезію бактерій до слизу вимірюють візуально (наприклад, за допомогою зображення і/або фотографії). У деяких варіантах реалізації адгезію бактерій до слизу вимірюють за допомогою зчитувального обладнання планшетів для твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації методика, що використовується для вимірювання адгезії бактерій до слизу, виявляла, вимірювала і кількісно оцінювала, наприклад, поглинання, інтенсивність флуоресценції, люмінесценції, дозволеної у часі флуоресценції і/або поляризації флуоресценції. 13 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах реалізації способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу (наприклад, способи на основі твердофазного ІФА) використовують для ідентифікації агентів, що модулюють адгезію бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу згідно з винаходом використовують для одержання і/або ідентифікації оптимізованої композиції (наприклад, другого, третього, четвертого або подальших поколінь) (наприклад, що демонструвала більш високу ефективність (наприклад, у плані запобігання адгезії бактерій) у порівнянні з композицією більш раннього покоління). Ці способи не обмежуються певною методикою ідентифікації агентів, що модулюють адгезію бактерій до слизу і/або клітин (наприклад, клітин епітелію). У деяких варіантах реалізації разом зі зразком бактерій на планшет, покритий слизом і/або клітинами (наприклад, епітеліальними клітинами) (наприклад, слизом або епітеліальними клітинами свині) наносять потенційний модулятор адгезії бактерій до слизу і/або клітин (наприклад, клітин епітелію), і послідовно вносять первинні та вторинні антитіла і рідкий субстрат. У деяких варіантах реалізації дослідження, що модулює активності агента здійснюють шляхом порівняння адгезії бактерій у присутності та під час відсутності цього агента. Наприклад, агенти, що підсилюють адгезію бактерій до слизу і/або клітин (наприклад, клітин епітелію) описують, наприклад, як стимулятори адгезії між специфічним видом бактерій і специфічним типом слизу і/або клітин (наприклад, епітеліальних клітин). Агенти, що знижують адгезію бактерій до слизу і/або клітин (наприклад, клітин епітелію) описують, наприклад, як інгібітори адгезії між специфічним видом бактерій і специфічним типом слизу і/або клітин (наприклад, епітеліальних клітин). Ці способи не обмежуються потенційним агентом певного типу або виду. У деяких варіантах реалізації агент являє собою, наприклад, природну речовину, синтетичну речовину або рекомбінантну речовину. У деяких варіантах реалізації ці способи включають попереднє внесення одного або декількох відомих агентів-модуляторів адгезії бактерій до слизу або клітин епітелію як профілактичний або попереджувальний захід. Наприклад, у деяких варіантах реалізації ці способи включають попереднє внесення одного або декількох відомих агентів-інгібіторів адгезії бактерій до слизу. Способи згідно з цим винаходом не обмежуються певним типом відомих агентів-інгібіторів адгезії бактерій до слизу і/або клітин (наприклад, клітин епітелію). Наприклад, у деяких варіантах реалізації відомий агент-інгібітор адгезії бактерій до слизу являє собою BioMos (наприклад, манопротеїн клітинної стінки Saccharomyces cerevisiae), хоча цей винахід не обмежується їм. У деяких варіантах реалізації відомий агент-інгібітор адгезії бактерій до слизу ідентифікують з використанням способів згідно з цим винаходом на основі твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації ці способи включають спільне внесення одного або декількох відомих агентів-підсилювачів адгезії бактерій до слизу. Ці способи не обмежуються певним типом відомих агентів-підсилювачів адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації відомий агент-підсилювач адгезії бактерій до слизу ідентифікують способами згідно з цим винаходом на основі твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації ці способи включають спільне внесення одного або декількох відомих агентів-модуляторів адгезії бактерій до слизу. Наприклад, у деяких варіантах реалізації ці способи включають спільне внесення одного або декількох відомих агентів-інгібіторів адгезії бактерій до слизу. Ці способи не обмежуються певним типом відомих агентів-інгібіторів адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації відомий агент-інгібітор адгезії бактерій до слизу являє собою Bio-Mos (наприклад, манопротеїн клітинної стінки Saccharomyces cerevisiae). У деяких варіантах реалізації відомий агент-інгібітор адгезії бактерій до слизу ідентифікують способами згідно з цим винаходом на основі твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації ці способи включають спільне внесення одного або декількох відомих агентів-підсилювачів адгезії бактерій до слизу. Ці способи не обмежуються певним типом відомих агентівпідсилювачів адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації відомий агент-підсилювач адгезії бактерій до слизу ідентифікують способами згідно з цим винаходом на основі твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації ці способи включають внесення одного або декількох відомих агентів-модуляторів адгезії бактерій до слизу або клітин епітелію після усунення інфекційного захворювання. Наприклад, у деяких варіантах реалізації ці способи включають внесення одного або декількох відомих агентів-інгібіторів адгезії бактерій до слизу і/або клітинами (наприклад, клітин епітелію) після усунення інфекційного захворювання). Ці способи не обмежуються певним типом відомих агентів-інгібіторів адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації відомий агент-інгібітор адгезії бактерій до слизу являє собою Bio-Mos (наприклад, манопротеїн клітинної стінки Saccharomyces cerevisiae). У деяких варіантах реалізації відомий агент-інгібітор адгезії бактерій до слизу ідентифікують способами згідно з цим винаходом на основі 14 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації ці способи включають спільне внесення одного або декількох відомих агентів-підсилювачів адгезії бактерій до слизу. Ці способи не обмежуються певним типом відомих агентів-підсилювачів адгезії бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації відомий агент-підсилювач адгезії бактерій до слизу ідентифікують способами згідно з цим винаходом на основі твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації аналітичні методики згідно з винаходом використовують для ідентифікації і/або опису характеристик сполук, що пригнічують адгезію бактерій травного тракту або сечовивідних шляхів (наприклад, бактерій, що населяють поверхню слизової травного тракту і/або сечовивідних шляхів). У деяких варіантах реалізації ідентифікують сполуки, що пригнічують адгезію, які використовують для запобігання і/або лікування захворювань і/або ознак і/або симптомів цього захворювання (наприклад, сальмонельозу, метриту і т.д. (наприклад, у тварин (наприклад, таких репродуктивних тварин, як молочні корови, свиноматки і т.д.))). У деяких варіантах реалізації аналітичні методики згідно з винаходом можна виконувати в будь-якому місці, де можна використовувати обладнання зчитування для мікропланшетів, включаючи лабораторію (наприклад, навчальну, приватну, суспільну або лабораторію іншого типу), польові умови (наприклад, скотарське господарство, ферму або територію користувача аналітичної методики) і т.д., але не обмежуючись ними. У деяких варіантах реалізації аналітичні набори і/або їх компонента продають на комерційній основі і використовуються кінцевим користувачем (наприклад, покупцем аналітичного набору) у його лабораторії (наприклад, для перевірки ефективності, продуктивності і/або відповідності продукту (наприклад, сполуки, що пригнічує адгезію)). Таким чином, цей винахід забезпечує композиції та способи, що дозволяють користувачам аналітичного набору виконувати власне дослідження якості сполук (наприклад, сполук, що пригнічують адгезію) на своїй території (наприклад, території використання сполуки, що пригнічує адгезію (наприклад, BIO-MOS)). У деяких варіантах реалізації збирають інформацію (наприклад, про ефективність, якість, відповідність і т.д.), що відноситься до сполуки, що пригнічує адгезію і отриману за допомогою аналітичних методик згідно з винаходом. У деяких варіантах реалізації інформацію збирають за допомогою бази даних (наприклад, оперативної бази даних) або обробки поштових відправлень. У деяких варіантах реалізації зібрану інформацію і/або дані, що відносяться до сполуки, яка пригнічує адгезію (наприклад, про її ефективність, якість, відповідність і т.д.), використовують у програмі контролю якості. У деяких варіантах реалізації зібрану інформацію і/або дані, що відносяться до сполуки, яка пригнічує адгезію (наприклад, про її ефективність, якість, відповідність і т.д.), використовував постачальник або виробник сполуки, що пригнічує адгезію, для моніторингу активності цієї сполуки. У деяких варіантах реалізації зібрану інформацію і/або дані, що відносяться до сполуки, яка пригнічує адгезію (наприклад, про її ефективність, якість, відповідність і т.д.), використовують разом з даними про стан здоров'я тварини на місці використання сполуки, що пригнічує адгезію (наприклад, для представлення інформації про продуктивність тварини). У деяких варіантах реалізації кращою фізичною формою агента, ідентифікованого за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом (наприклад, ідентифікованого як модулятор адгезії бактерій до слизу) був сухий вільнотекучий порошок, придатний для прямого введення в корми для тварин або як пряма кормова добавка для тварин. В інших варіантах реалізації кращою фізичною формою агента, ідентифікованого за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом (наприклад, ідентифікованого як модулятор адгезії бактерій до слизу) була рідина або паста, яку вводять після кормових гранул або з питною водою. Композицію згідно з винаходом, що включає агент, ідентифікований за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом (наприклад, ідентифікований як модулятор адгезії бактерій до слизу), можна додавати до будь-якого доступного для придбання кормового продукту для худоби, свійських тварина, риб і ракоподібних і молюсків, включаючи повну кормову суміш (TMR), фураж, кормові гранули, концентрат(и), кормову(і) суміш(і), зерно, барду, мелясу, клітковину, грубі корми, траву(и), сіно, ядра горіхів, листи, борошно, розчинне(і) речовину(и) і добавку(и), але не обмежуючись ними. Композицію згідно з винаходом, що включає агент, ідентифікований за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом (наприклад, ідентифікований як модулятор адгезії бактерій до слизу), безпосередньо включають у корми для тварин (наприклад, гранульовані корми, доступні для придбання). При включенні в корми для тварин композиції, що включають агент, ідентифікований за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом, можна додавати в кормові продукти для тварин, риб, ракоподібних і молюсків у кількостях від приблизно 0,0125 % до приблизно 0,4 % від маси корму. У деяких варіантах реалізації композицію додають до кормових продуктів для 15 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тварин, риб, ракоподібних і молюсків від приблизно 0,025 % до приблизно 0,2 % від маси корму. Як альтернатива, композиції згідно з винаходом безпосередньо використовують як кормову добавку для тварин (наприклад, у кількості від приблизно 2,5 до приблизно 20 грамів на тварину на добу). Фахівець може оцінити, що кількість композиції, що вводиться, змінюється залежно від виду та розміру тварини і типу кормового продукту, у який додають композицію згідно з винаходом. Композиції згідно з винаходом, що включає агент, ідентифікований за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом (наприклад, ідентифікований як модулятор адгезії бактерій до слизу), можна включати в корми для будь-якої тварини, включаючи види жуйних і коней, але не обмежуючись ними. При змішуванні з кормами або введенні як кормової добавки композиції згідно з винаходом, що включають агент, ідентифікований за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом (наприклад, ідентифікований як модулятор адгезії бактерій до слизу), регулюють (наприклад, збільшують або зменшують, залежно від агента) адгезію бактерій до слизу в організмі тварини, поліпшуючи його продуктивність і здоров'я та знижуючи захворюваність. У деяких варіантах реалізації цей винахід представляв способи лікування розладів, викликаних патогенними бактеріями шляхом введення суб'єктові відомого агента, що модулює (наприклад, що інгібує, стимулює) адгезію бактерій до слизу. У деяких варіантах реалізації цей агент ідентифікують способами згідно з цим винаходом на основі твердофазного ІФА. У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний Bacillus anthracis (наприклад, шкірна форма, легенева форма, кишкова форма сибірської виразки), і в деяких варіантах реалізації цей спосіб включав спільне введення пеніциліну, доксицикліну і/або ципрофлоксацину. У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний Bordetella pertussis (наприклад, коклюш, вторинна бактеріальна пневмонія), і в деяких варіантах реалізації цей спосіб включав спільне введення макролідних антибіотиків (наприклад, азитроміцину, еритроміцину, кларитроміцину). У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний Borrelia burgdorferi (наприклад, хвороба Лайма), і в деяких варіантах реалізації цей спосіб включав спільне введення цефалоспоринів, амоксициліну і/або доксицикліну. У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний патогенними бактеріями Brucella (наприклад, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis) (наприклад, бруцельоз), і в деяких варіантах реалізації цей спосіб включав спільне введення доксицикліну, стрептоміцину і/або гентаміцину. У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний Campylobacter jejuni (наприклад, гострий ентерит), і в деяких варіантах реалізації цей спосіб включав спільне введення ципрофлоксацину. У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний Chlamydia pneumoniae (наприклад, позалікарняна респіраторна інфекція), і в деяких варіантах реалізації цей спосіб включав спільне введення доксицикліну і/або еритроміцину. У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний Chlamydia psittaci (наприклад, орнітоз), і в деяких варіантах реалізації цей спосіб включав спільне введення тетрацикліну, доксицикліну і/або еритроміцину. У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний Chlamydia trachomatis (наприклад, негонококовий уретрит (NGU), трахома, кон'юнктивіт немовлят з включеннями (ICN), венерична лімфогранулема (LGV)), і в деяких варіантах реалізації цей спосіб включав спільне введення азитроміцину, еритроміцину, тетрациклінів і/або доксицикліну. У деяких варіантах реалізації розлад був викликаний Clostridium botulinum (наприклад, ботулізм), Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani (наприклад, правець), Corynebacterium dipHteriae (наприклад, дифтерія), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecum, Escherichia coli, Francisella tularensis (наприклад, туляремія), Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila (наприклад, легіонельоз), Leptospira interrogans, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae (наприклад, хвороба Хансена), Mycobacterium tuberculosis (наприклад, туберкульоз), Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Salmonella typHi, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus sapropHyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae і Yersinia pestis (наприклад, чуму). У деяких варіантах реалізації цей винахід представляв діагностичні набори, що дозволяють користувачеві здійснити способи згідно з цим винаходом (наприклад, способи детектування, ідентифікації та вимірювання адгезії бактерій до слизу). У деяких варіантах реалізації ці набори включають один або кілька наступних інгредієнтів - зразки слизу, планшети, покриті зразками слизу, бактерії, первинні антитіла, вторинні антитіла, рідкий субстрат, промивні розчини, обладнання для інтерпретації аналізів на основі твердофазного ІФА, інструкції, відомий агент, що знижує адгезію бактерій до слизу (наприклад, Bio-Mos) (наприклад, агент, ідентифікований за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом), 16 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відомий агент, що підвищує адгезію бактерій до слизу (наприклад, агент, ідентифікований за допомогою використання способів на основі твердофазного ІФА згідно з цим винаходом), і додаткові терапевтичні агенти (наприклад, антибіотики). Експериментальна частина Наступні приклади наведені як демонстрація і додаткової ілюстрації певних кращих варіантів реалізації цього винаходу та не повинні розглядатися як обмежуючі його рамки. Приклад 1 Матеріали і Методи, використані при колориметричному твердофазному ІФА у порівнянні з радіоактивним детектуванням адгезії бактерій до вмісту кишечнику. Штами бактерій. Для роботи в цьому проекті було обрано два штами E. coli: E. coli ALI84 і ALI446. Перший штам первісно виділили з хворих птахів, а другий - зі свині, що страждає діареєю. Ці штами вибрали у зв'язку з адгезією до слизу свині, що проявляється ними. Бактерії вирощували в середовищі LB і переносили у свіже середовище (культура:середовище 1:10) за добу до експериментів. Кількість бактерій оцінювали, виходячи з часу культивування. Антитіла. Антитіла придбали в Acris Antibodies GmbH, Німеччина і Sigma Aldrich, Німеччина. Первинні антитіла включали: поліклональні антитіла до антигенних серотипів O і K E. coli, кон'юговані з ПХ (номер у каталозі Acris BP2022HRP); поліклональні антитіла до антигенних серотипів O і K E. coli (номер у каталозі Acris ВР2022); і поліклональні антитіла до антигенних серотипів O і K E. coli, кон'юговані з біотином (номер у каталозі Acris BP 1021B). Вторинні антитіла включають: афінно очищені Кон'юговані з ПХ антитіла кролика до IgG кози (номер у каталозі Acris R1317HRP); афінно очищені антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з лужною фосфатузою (номер у каталозі Acris R1317AP); поліклональні антитіла до IgG кози, кон'юговані з FITC (H&L) (номер у каталозі Acris R1317F); стрептавідин-лужну фосфатузу з Streptomyces avidinii (номер у каталозі Sigma S2890); стрептавідин-пероксидазу з Streptomyces avidinii (номер у каталозі Sigma S5512). Субстрати для твердофазного ІФА придбали у вигляді розчинів, готових до вживання, у Sigma-Aldrich, Німеччина: 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) (номер у каталозі Sigma T4319); форма ТМБ з повільною кінетикою (далі ТМБ повільний) (номер у каталозі Sigma T0440); надчуттєвий ТМБ (далі ТМБ супер) (номер у каталозі Sigma T4444); Pнітрофенілфосфат (номер в каталозі Sigma N7653); 2,2’-азин-біс(3-етилбензотіазолін-6сульфонову кислоту) (AzBTS; номер у каталозі Sigma A3219) + підсилювач ABTS для мікролунок (номер у каталозі Sigma A1227). Буферні розчини. У вихідному варіанті для промивання лунок використовували HEPESбуфер Хенкса (pH 7,4), за винятком кінцевого промивання, під час якого використовували ФБР, щоб уникнути перешкод під час твердофазного ІФА з боку HEPES-буфера Хенкса, пофарбованого в червоний колір. У деяких варіантах реалізації на всіх стадіях використовували ФБР (фізіологічний розчин у фосфатному буфері, рН 7,4) замість HEPES-буфера Хенкса. Планшети. В експериментах з твердофазним ІФА використовували 96-ямкові імунологічні планшети (MaxiSorp, Nunc, Данія, далі в цьому документі "планшети MaxiSorp"). Для сцинтиляційних експериментів використовували поліетилентерефталатні титраційні мікропланшети (96-ямкові ПЕТ-планшети для зразків, 1450-401; Wallac Oy, Турку, Фінляндія; що у цьому документі називаються "гнучкими планшетами") для використання в сцинтиляційному лічильнику. Традиційний аналіз зв'язування/приєднання з використанням радіоактивних міток, описаний нижче, використовували як контроль для колориметричного твердофазного ІФА. Радіоактивне мічення бактерій для радіоактивного аналізу зв'язування. Бактерії вирощували протягом ночі при +37 °C, суспензію бактерій, розведену 1:10, переносили в нове середовище LB і додавали метил-1, -2, 3H-тімідин (117 мкКи/ммоль; Amersham). Бактерії інкубували протягом 2 год. при +37 °C і збирали центрифугуванням протягом 5 хв при 3000 g. Осад бактерій ресуспендували в HEPES-буфері Хенкса або ФБР і використовували в ході аналізу зв'язування. Радіоактивний аналіз зв'язування. У лунки титраційних мікропланшетів додавали 200 мкл розведеної суспензії бактерій та інкубували планшети протягом 1 години при +37 °C. Клітини, що не зв'язувалися, видаляли триразовою промивкою 300 мкл HEPES-буфера Хенкса Додавали 250 мл сцинтиляційної рідини і вимірювали радіоактивність на сцинтиляційному лічильнику. Виділення та імобілізація слизу. На планшети наносили різні концентрації слизу з різних тварин. Якщо не зазначено інше, використовували слиз з проксимального відділу клубової кишки однорічної свині. Слиз зіскрібали з поверхні клубової кишки та промивали. Неопрацьований екстракт слизу зберігали при -80 °C до використання. Для імобілізації концентрацію білка в слизі доводили до 0,0-0,2 мг/мл за допомогою натрій-карбонатного 17 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буфера (буфер для імобілізації, рН 9,6) і оцінювали оптимальну концентрацію слизу для адгезії бактерій. Розчин слизу імобілізували на планшетах, вносячи 300 мкм або 200 мкл слизу в кожну 350-мкл лунку. Потім планшет інкубували при +4 °C протягом ночі. Надлишок слизу видаляли з лунок титраційного мікропланшета дворазовим промиванням 300 мкл HEPES-буфера Хенкса або ФБР. Для оцінки розвитку неспецифічного фарбування, викликаного взаємодією E. coli з субстратами твердофазного ІФА, використовували спосіб мікроцентрифугування. Свіжовиращену культуру E. coli (~108 бактерій/мл) вносили в мікроцентрифужні пробірки (~107/пробірку). Пробірки центрифугували при 3000 об/хв протягом 5 хвилин і видаляли надосадову рідину. Бактерії суспендували в 700 мкл субстрату твердофазного ІФА. Поглинання суспензії зчитували на спектрофотометрі при довжині хвилі 370, 405 і 630 нм через п'ять хвилин і потім через кожні 15 хвилин протягом 3 годин. Для тестування специфічності первинних антитіл використовували FITC. Специфічність первинних антитіл (поліклональні антитіла до E. coli, BP2022, сумісні з вторинними антитілами, кон'югованими з FITC) тестували за допомогою флуоресцентної мікроскопії. 108 бактерій вносили в кожну мікроцентрифужну пробірку і тричі промивали 1 мл ФБР (і центрифугували між промиваннями при 3000 g протягом 5 хв). Первинні антитіла, розведені 1 % БСА/ФБР у співвідношенні 1:100, 1:500, 1:1000, вносили в кожну пробірку та інкубували при кімнатній температурі протягом 45 хв. Як негативний контроль використовували 1 % БСА/ФБР. Бактерії тричі промивали ФБР і вносили вторинні антитіла (антитіла кролика до IgG кози, кон'юговані з FITC), розведені 1 % БСА/ФБР у співвідношенні 1:100, 1:500 і 1:1000. Пробірки інкубували при кімнатній температурі протягом 1 год. Бактерії двічі промивали ФБР і фільтрували через мембрани Whatman BLACK NUCLEPORE з розміром пор 0,2 мкм. Фільтри двічі промивали ФБР, переносили на предметне скло та герметизували краплею імерсійної олії. Скло зберігали в темряві. Основний протокол твердофазного ІФА. Нижче описаний основний протокол, однак точні умови для кожного експерименту описані в контексті результатів, описаних нижче. Від 0 до 107 бактерій, суспендованих у буфері, вносили в лунки, покриті слизом. Якщо не зазначено інше, використовували концентрацію слизу 0,1 мг/мл і 107 бактерій/лунку. У деяких експериментах разом з бактеріями, розведеними ФБР, вносили Bio-Mos (Alltech, Ніколасвіль, штат Кентуккі, США) у концентраціях, описаних нижче. Планшети інкубували при +37 °C або кімнатній температурі протягом 1 год. Планшети тричі промивали буфером (ФБР або HEPES-буфер Хенкса, 300 мкл). Неспецифічне зв'язування блокували молоком, ембріональною бичачою сироваткою або БСА (бичачим сироватковим альбуміном) у ФБР. Планшети інкубували протягом 1 години при +37 °C або кімнатній температурі. Видаляли блокувальний буфер і вносили первинні антитіла в співвідношеннях 1:200 і 1:100000. Антитіла розбавляли блокувальним буфером. Планшети повторно інкубували протягом 1 години при +37 °C або кімнатній температурі і тричі промивали ФБР або HEPESбуфером Хенкса. Вторинні антитіла вносили в співвідношеннях 1:1000 і 1:100000 у блокувальному буфері. Планшети інкубували протягом 1 години при +37 °C або кімнатній температурі. Після останньої інкубації планшети п'ятикратно промивали ФБР (300 мкл/лунку) для повного видалення всіх вільних вторинних антитіл. Додавали субстрат і фотографували і/або зчитували планшет на зчитувальному обладнанні для твердофазного ІФА. Приклад 2 Концентрація слизу кишечнику Для визначення концентрацій слизу в суспензії для імобілізації лунки покривали суспензіями з різними концентраціями слизу. Концентрація слизу являлася змінною, що визначається, важливою з погляду надійності аналізу (наприклад, якщо концентрація слизу занадто мала, бактерії можуть зв'язатися з планшетом замість слизу). Основний спосіб: Радіоактивний аналіз приєднання (див. вище Матеріали і Методи). Планшети: 96-ямкові ПЕТ-планшети (гнучкі планшети); слиз: слиз проксимального відділу клубової кишки свині, 0,0-0,2 мг білка/мл буфера для імобілізації; бактерії: штам E. coli ALI84 на одному планшеті, штам E. coli ALI446 на іншому планшеті; 107 бактерій/лунку. Буфер: HEPES-буфер Хенкса; блокування: відсутнє; первинні антитіла: відсутні; вторинні антитіла: відсутні; температура інкубації: +37 °C. На Фігурі 1 показана дія концентрації слизу на E. coli ALI84 і ALI446 згідно з вимірюваннями з використанням радіоактивно мічених бактерій. Фігура 1 означає, що бактерії проявляли оптимальну адгезію до лунок, що не містять слизу. Для перевірки того, що бактерії приєднувалися до слизу, а не до планшета, для наступних експериментів визначили і вибрали порівняно високу концентрацію слизу (0,1 мг білка/мл буфера для імобілізації). Таким чином, у деяких варіантах реалізації цього винаходу 18 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовували прийнятні концентрації слизу для імобілізації в лунках (наприклад, кількість, яка послабляла і/або усувала зв'язування бактерій з лунками планшета). Приклад 3 Аналіз впливу інгібування адгезії бактерій первинними антитілами Для оцінки впливу первинних антитіл на адгезію бактерій бактерії в лунках, покритих слизом, інкубували з антитілами, розведеними в діапазоні співвідношень від відсутності антитіл до 1:200. Основний спосіб: Радіоактивний аналіз приєднання (див. Матеріали і Методи). Планшети: 96-ямкові ПЕТ-планшети (гнучкі планшети); слиз: слиз проксимального відділу клубової кишки свині, 0,0-0,2 мг білка/мл буфера для імобілізації; бактерії: штам E. coli ALI84 на одному планшеті, штам E. coli ALI446 на іншому планшеті. 107 бактерій/лунку; буфер: HEPES-буфер Хенкса; блокування:відсутнє; первинні антитіла: ПХ=антитіла до E. coli, кон'юговані з ПХ; BP2022=некон'юговані антитіла до E. coli, Біотин=антитіла до E. coli, кон'юговані з біотином; вторинні антитіла: відсутні; температура інкубації: +37 °C. Згідно з описом на Фігурах 2 і 3, два різні перші первинні антитіла підсилювали адгезію бактерій до слизу при низьких концентраціях (розведення у співвідношенні 1:20000), але значно послабляли адгезію при розведенні у співвідношенні 1:200. Можливо, Fc-область цих двох перших антитіл вільно зв'язувалася зі слизом, у той час як зв'язування цієї області третього антитіла зі слизом було блоковано біотином. При низьких концентраціях два перші антитіла могли діяти, з'єднуючи бактерії та слиз (при зв'язуванні Fab-області з бактеріями і Fc-області зі слизом). При більш високих концентраціях (розведення 1:200) зв'язування бактерій зі слизом було ослаблено, оскільки антитіла, очевидно, блокували сайти зв'язування слизу з поверхнею бактерій (або сайти зв'язування бактерій зі слизом). Антитіла, кон'юговані з біотином, чинили вкрай незначну дію; очевидно, вони мали підвищену адгезію. Більше того, у цьому експерименті первинні антитіла додавали разом з бактеріями, однак в описаних нижче способах колориметричного твердофазного аналізу приєднання бактерії спочатку інкубували самі по собі протягом 1 години. Таким чином, у деяких варіантах реалізації дія антитіл на адгезію/зв'язування бактерій (наприклад, антитіл, що фактично підсилюють або послаблюють адгезію бактерій) ослаблену і/або усунуту при приєднанні бактерій до слизу (наприклад, під час відсутності антитіл). Крім того, у деяких варіантах реалізації для блокування неспецифічного зв'язування можна використовувати ембріональну бичачу сироватку або інший блокувальний агент. Таким чином, у деяких варіантах реалізації цей винахід показував, що кон'юговані з ПХ і некон'юговані первинні антитіла змінювали (наприклад, підсилювали або пригнічували) адгезію бактерій до слизу в ході традиційного радіоактивного аналізу приєднання, і що колориметричний аналіз відповідно до цього винаходу не страждав від такої зміни. Більше того, оскільки всі випробувані антитіла виявилися прийнятними для способів, описаних у цьому документі, це дослідження також показало, що в методиці аналізу зв'язування/приєднання згідно з винаходом можна використовувати широкий спектр антитіл (наприклад, некон'югованих і кон'югованих антитіл). Приклад 4 Розвиток неспецифічного фарбування, викликаного взаємодією E. coli з субстратами твердофазного ІФА. Оцінювали здатність двох обраних штамів E. coli здійснювати неспецифічну кольорову реакцію з субстратами твердофазного ІФА. Експеримент виконували в мікроцентрифужних пробірках, інкубуючи бактерії з субстратами. Використовували спосіб мікроцентрифугування (див. Приклад 1, Матеріали і Методи). Як показано на Фігурах 4 і 5, фарбування, викликане бактеріями, було мінімальним і порівнянним з розвитком фарбування в субстраті без додаткових компонентів. У межах від 5 до 30 хвилин у жодному з субстратів не виникало значної кольорової реакції. Таким чином, у деяких варіантах реалізації це дослідження продемонструвало, що кожний з субстратів твердофазного ІФА, описаних у цьому документі, прийнятний для використання при аналізі адгезії/приєднання згідно з винаходом. Приклад 5 Розвиток неспецифічного фарбування, викликаного взаємодією слизу з субстратами твердофазного ІФА. П'ять зразків слизу однорічної свині тестували на здатність здійснювати неспецифічну кольорову реакцію з субстратами твердофазного ІФА. Твердофазний ІФА здійснювали згідно з описом у Прикладі 1, Матеріали і Методи. Планшет: гнучкий планшет; слиз: з проксимального, середнього та дистального відділів клубової кишки та проксимального і дистального відділів товстої кишки свині; бактерії: відсутні; антитіла: відсутні; буфер: ФБР; блокування: 1 % БСА/ФБР, 1 година; температура інкубації: +37 °C; субстрат: усі шість субстратів, показаних на 19 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігурі 6. Як показано на Фігурі 6, слиз з клубової кишки (але не товстої кишки) давав кольорову реакцію з пара-нітрофенілфосфатом (pNPP). Інші субстрати не реагували зі слизом. Утворення офарблення в присутності pNPP могло бути обумовлене присутністю фосфату в слизі клубової кишки. Таким чином, у деяких варіантах реалізації це дослідження продемонструвало, що слиз з клубової кишки (але не товстої кишки) здійснював кольорову реакцію з паранітрофенілфосфатом (pNPP). Інші субстрати не реагували зі слизом. Приклад 6 Тестування специфічності первинних антитіл: Специфічність первинних антитіл тестували за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Коротко, бактерії блокували БСА, інкубували спочатку з первинними, а потім з вторинними антитілами, кон'югованими з FITC. Флуоресценцію спостерігали за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Використовували FITC-спосіб згідно з описом у розділі Матеріали і Методи Прикладу 1. У всіх зразках у присутності вторинних антитіл спостерігали флуоресценцію, навіть якщо первинні антитіла були відсутні, і найбільш помітні відмінності між зразками полягали в концентрації вторинних антитіл. Таким чином, це дослідження продемонструвало, що в деяких варіантах реалізації неспецифічне зв'язування можна послабляти і/або пригнічувати за допомогою ембріональної бичачої сироватки (FBS) і/або бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Приклад 7 Неспецифічне зв'язування антитіл зі слизом або планшетом Для оцінки неспецифічного зв'язування антитіл з планшетом або слизом без бактерій у планшет, покритий слизом, вносили первинні та вторинні антитіла. Використовували твердофазний ІФА згідно з описом у Прикладі 1. Для блокування неспецифічного зв'язування використовували БСА. Планшет: планшет MaxiSorp; слиз: з проксимального відділу клубової кишки свині; бактерії: відсутні; блокування: 1 % БСА у ФБР; буфер: ФБР; первинні антитіла: див. Таблицю 1; 200 мкл різних розведень в 1 % розчині БСА у ФБР; вторинні антитіла: див. Таблицю 1; 200 мкл різних розведень в 1 % розчині БСА у ФБР; температура інкубації: +37 °C; субстрати: ТМБ (для втор. антитіл, кон'югованих з ПХ), pNPP (для втор. антитіл, кон'югованих зі ЛФ). На Фігурах 7 і 8 показана розмітка планшета при тестуванні неспецифічного зв'язування антитіл зі слизом або планшетом і результати неспецифічного зв'язування, відповідно. Цей експеримент виконували без використання бактерій. Таким чином, у деяких варіантах реалізації це дослідження продемонструвало міцне неспецифічне зв'язування антитіл зі слизом або планшетом. У деяких варіантах реалізації БСА не був прийнятним блокувальним агентом для аналізу зв'язування згідно з винаходом. Приклад 8 Тестування запобігання неспецифічного зв'язування антитіл за допомогою блокувальних агентів Вторинні антитіла міцно зв'язувалися зі слизом/планшетом при відсутності бактерій або первинних антитіл (див. Фігуру 8). Тому для блокування неспецифічного зв'язування замість БСА тестували молоко та ембріональну бичачу сироватку. Використовували основний спосіб твердофазного ІФА згідно з описом у Прикладі 1. Планшет: планшет MaxiSorp; слиз: з проксимального відділу клубової кишки свині; блокування: 5 % знежирене сухе молоко у ФБР або 10 % ембріональна бичача сироватка у ФБР протягом 1 год. при +37 °C; буфер: ФБР; первинні антитіла: див. Таблицю 2; 200 мкл різних розведень у блокувальному буфері; вторинні антитіла: див. Таблицю 2; 200 мкл різних розведень у блокувальному буфері; вторинні антитіла, кон'юговані зі стрептавідином, використовували при розведенні у співвідношеннях 1:1000 і 1:10000 згідно з рекомендаціями виробника. Температура інкубації: +37 °C; субстрат: ТМБ. На Фігурі 9 показана розмітка планшета для аналізу. Первинні антитіла: ПХ = первинне антитіло, кон'юговане з ПХ; BP2022 = некон'юговане поліклональне первинне антитіло до E. coli; Біотин = первинне антитіло до E. coli, кон'юговане з біотином. Вторинні антитіла: ПХ = IgG, кон'югований з пероксидазою; Стр-ПХ = стрептавідин, мічений ПХ. Цей експеримент виконували без використання бактерій. Як показано на Фігурі 10, ембріональна бичача сироватка блокувала неспецифічне зв'язування ефективніше, ніж молоко. Неспецифічне зв'язування було найменшим при використання комплексу біотин-стрептавідин і найбільш міцним при використанні первинних антитіл BP2022. На основі цього експерименту для блокування в подальших експериментах вибрали 10 % ембріональну бичачу сироватку у ФБР. Таким чином, це дослідження продемонструвало, що 10 % ембріональна бичача сироватка була прийнятним блокувальним 20 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 агентом для використання в аналізі приєднання згідно з винаходом. Приклад 9 Зв'язування бактерій з планшетами, покритими слизом Оптимізацію протоколу твердофазного ІФА (що включає як слиз, так і бактерії) почали з оптимізації розведення антитіл і кількості бактерій / лунку. Використовували основний спосіб твердофазного ІФА згідно з описом у Прикладі 1. Планшет: планшет MaxiSorp; слиз: з проксимального відділу клубової кишки свині; бактерії: штами E. coli ALI84 і ALI446, кількість бактерій/лунку зазначена на Фігурі 11. Буфер: HEPES-буфер Хенкса/ФБР; блокування: 10 % ембріональна бичача сироватка у ФБР; первинні антитіла: 200 мкл, різні розведення в блокувальному буфері (Фігури 11 і 13); вторинні антитіла: 200 мкл, різні розведення в блокувальному буфері (Фігура 13); температура інкубації: +37 °C; субстрат: ТМБ. Як показано на Фігурах 12 і 14, комплекс біотин-стрептавідин був більш специфічним, ніж первинні антитіла, кон'юговані з ПХ. Неспецифічного зв'язування не спостерігали (див. Фігура 14, контролі, два окремі рядки). Цей факт підтверджував результати, отримані в Прикладі 8. Таким чином, було вирішено продовжувати експерименти, використовуючи тільки комбінацію біотин-стрептавідин. На Фігурі 14 показано, що розведення в співвідношенні 1: 1000 забезпечувало протікання реакції в присутності навіть меншої кількості бактерій, і тому це розведення вибрали для додаткових експериментів. Крім того, оптимізували розведення первинних антитіл. На Фігурі 14 показано, що розведення вторинних антитіл (стрептавідин-пх) у співвідношенні 1:10000 було занадто мало і не забезпечувало виявлення невеликої кількості бактерій (тому в деяких варіантах реалізації використовували розведення у співвідношенні 1:1000). Комбінацію біотин-стрептавідин, що мала більшу специфічність, ніж інші антитіла використовували в подальших експериментах. Таким чином, це дослідження продемонструвало, що в деяких варіантах реалізації 107 бактерій є оптимальною кількістю бактерій для використання в аналізі приєднання згідно з винаходом, хоча також можна використовувати більші (наприклад, більш 107 бактерій/лунку (наприклад, 108 бактерій, 109 бактерій, 1010 бактерій або більше)) або менші кількості (наприклад, менше 107 бактерій/лунку (наприклад, 106 бактерій, 105 бактерій, 104 бактерій або менше)). Розведення первинних антитіл у степені 1:1000-1:10000 було оптимальним для даного експерименту, однак кількість первинних антитіл могла бути вище або нижче цього діапазону. У деяких варіантах реалізації кількість первинних антитіл вибрали таким, щоб вона не була лімітуючим чинником кольорової реакції. Приклад 10 Лінійність твердофазного ІФА при кількісному виявленні бактерій Для оцінки лінійного діапазону твердофазного ІФА виконували твердофазний ІФА при різній кількості бактерій/лунку. Використовували основний спосіб твердофазного ІФА згідно з описом у Прикладі 1. Планшет: планшет MaxiSorp; слиз: з проксимального відділу клубової кишки свині; бактерії: штам E. coli ALI84, 107 бактерій/лунку; буфер: ФБР; Bio-Mos: відсутній; блокування: 10 % ембріональна бичача сироватка; первинні антитіла: первинні антитіла, кон'юговані з біотином, розведення у співвідношенні 1: 1000 у блокувальному буфері; вторинні антитіла: стрептавідин, кон'югований з ПХ, розведення у співвідношенні 1: 1000 у блокувальному буфері; температура інкубації: +37 °C для одного планшета, кімнатна температура для іншого планшета; реагенти при кімнатній температурі; субстрат: ТМБ. Будували графік поглинання при 620 нм як функцію від кількості бактерій. При кількості бактерій до 106 бактерій/лунку залежність була лінійною (див. Фігуру 16), але від 106 до 108 найбільш адекватною апроксимацією була логарифмічна (див. Фігуру 15). Таким чином, це дослідження продемонструвало, що при певній кількості бактерій/лунку здатність слизу зв'язуватися з бактеріями знижувалася в міру насичення сайтів зв'язування. Таким чином, у деяких варіантах реалізації аналіз згідно з винаходом був лінійним у 6 діапазоні кількості бактеріальних клітин/лунку (наприклад, від 0 до приблизно 10 бактерій на лунку). У деяких варіантах реалізації цей винахід забезпечував високочутливий розрахунок приєднаних бактерій на лунку. У деяких варіантах реалізації способи згідно з винаходом були стандартизованими (наприклад, для одержання відтворених, порівнянних результатів). Приклад 11 Вплив Bio-Mos на адгезію бактерій Для перевірки лінійності і роздільної здатності твердофазного ІФА використовували різні концентрації Bio-Mos для блокування адгезії бактеріальних клітин до слизу. Результати, отримані за допомогою основного колориметричного твердофазного ІФА, описані в Прикладі 1, порівнювали з результатами, отриманими за допомогою радіоактивного аналізу приєднання, 21 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 також описаними в Прикладі 1. Планшет: планшет MaxiSorp і гнучкий планшет; слиз: з 7 проксимального відділу клубової кишки свині; бактерії: штами E. coli ALI84 і ALI446, ~10 бактерій/лунку. Ту саму суспензію радіоактивно мічених бактерій використовували з обома планшетами, щоб забезпечити ідентичність планшетів; Буфер: HEPES-буфер Хенкса, ФБР; BioMos: концентрації 0-20 г/л, розведений ФБР; блокування (тільки планшетів MaxiSorp): 10 % ембріональна бичача сироватка у ФБР; первинні антитіла (тільки на планшетах MaxiSorp): первинні антитіла, кон'юговані з біотином (1:1000 у блокувальному буфері); вторинні антитіла (тільки на планшетах MaxiSorp): стрептавідин, кон'югований з ПХ (1:1000 у блокувальному буфері); температура інкубації: +37 °C; субстрат: ТМБ. Як показано на Фігурах 17А и 17B, радіоактивний аналіз виявив відмінності в адгезії бактерій при використанні різних концентрацій Bio-Mos. Після виконання твердофазного ІФА обоє планшета вимірювали на сцинтиляційному лічильнику (5 хв/лунку). На Фігурі 17B показано, що число сцинтиляцій зменшувалося після виконання твердофазного ІФА, що вказує на вимивання бактерій під час твердофазного ІФА. У той же час спостерігали чистий ефект Bio-Mos. Проведені експерименти продемонстрували несподівану особливість колориметричного способу твердофазного ІФА, що полягає в можливості детектування відмінностей приєднання між лунками, що не містили бактерій (контрольними) і лунками, що містили найбільші концентрації Bio-Mos (при найменшій кількості бактерій) (див. Фігуру 17А), у той час як число сцинтиляцій у лунках, що містили найбільші концентрації Bio-Mos, було близьке до такого в контролях, що не містили бактерій (Фігура 15). Таким чином, цей винахід у деяких варіантах реалізації представляв спосіб твердофазного ІФА, здатний виявляти відмінності приєднання/адгезії між лунками з найбільшою концентрацією Bio-Mos (з найменшою кількістю бактеріальних клітин) і лунками, що не містили бактерій (контрольними) (наприклад, колориметричний аналіз був значно чутливішим за радіоактивний аналіз в цьому діапазоні концентрацій). Приклад 12 Кількість бактерій важлива для детектування змін адгезії Метою цього експерименту було визначення кількості бактерій/лунку для детектування впливу Bio-Mos. Основний спосіб: твердофазний ІФА (див. Матеріали і Методи); планшет: планшет MaxiSorp; слиз: з проксимального відділу клубової кишки свині; бактерії: штам E. coli ALI84, 0-108 /лунку; Bio-Mos: концентрації 0-20 г/л, розведення ФБР; буфер: ФБР; блокування: 10 % ембріональна бичача сироватка; первинні антитіла: первинні антитіла, кон'юговані з біотином, розведення у співвідношенні 1: 1000 у блокувальному буфері; вторинні антитіла: стрептавідин, кон'югований з ПХ, розведення у співвідношенні 1: 1000 у блокувальному буфері; температура інкубації: +37 °C; субстрат: ТМБ. Як показано на Фігурах 18-19, у деяких варіантах реалізації кількість бактерій/лунку для одержання відмінностей, що визначаються, повинно було перевищувати 105. Явні відмінності можна було спостерігати при використанні 107 бактерій/лунку. 108 бактерій/лунку також дозволяли одержати явні відмінності, однак реакція досягала кінцевої точки дуже швидко, що могло привести до розкиду, викликаного неможливістю одночасного додавання субстрату в усі лунки. Крім того, виникала можливість, що при дуже великій кількості бактерій/лунку концентрації антитіл, субстрату або сайтів зв'язування слизи стануть факторами, що лімітують. 7 Таким чином, наступні експерименти виконували при 10 бактерій/лунку. Для обох штамів E. coli виявилося, що дуже низькі концентрації Bio-Mos підсилювали приєднання бактерій до слизу. Таким чином, у деяких варіантах реалізації при використанні аналітичних методик згідно з цим винаходом показали, що порівняно низькі рівні (наприклад, від 0,1 до приблизно 1,0 г/л) інгібуючого агента (наприклад, Bio-Mos) видаляли бактерії ефективніше, ніж більш високі кількості агента. Приклад 13 Удосконалений спосіб промивання До цього моменту для здійснення стадій промивання використовували промивний апарат для імуноаналізу Nunc, але внаслідок значного розкиду в повторних лунках було вирішено, що цей спосіб міг бути занадто грубим. Тому для мінімізації розкиду між зразками протестували інший спосіб промивання. Цей новий спосіб ґрунтувався на витрушуванні рідин. Основний спосіб: твердофазний ІФА (див. Матеріали і Методи); планшет: планшет MaxiSorp; слиз: з дванадцятипалої кишки м'ясного курчати; бактерії: штам E. coli ALI84, 107 бактерій/лунку; буфер: ФБР; Bio-Mos: концентрації 0, 0,1, 1 і 10, додані разом з бактеріями; блокування: 10 % ембріональна бичача сироватка; первинні антитіла: первинні антитіла, кон'юговані з біотином, розведення у співвідношенні 1: 1000 у блокувальному буфері; вторинні антитіла: стрептавідин, кон'югований з ПХ, розведення у співвідношенні 1: 1000 у блокувальному буфері; температура 22 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інкубації: +37 °C; субстрат: ТМБ. Як показано на Фігурі 20, новий спосіб промивання ("промивання витрушуванням") забезпечував кращі результати під час твердофазного ІФА. Загальний рівень сигналу був вище, і при різних концентраціях Bio-Mos реєстрували більш виражені відмінності. Крім того, новий спосіб був швидше і дозволяв обробляти кілька планшетів одночасно. У той же час було важливо здійснювати цей спосіб за умов, що дозволяють уникнути змішування вмісту лунок. Таким чином, цей винахід представляв новий спосіб промивання витрушуванням, що перевершував традиційні способи промивання. При способі промивання витрушуванням буфер вносили в лунку піпеткою, після чого планшет обережно струшували нагору дном, спустошуючи лунки і не дозволяючи розчину потрапити з однієї лунки в іншу. Цю процедуру повторювали стільки разів, скільки було необхідно. Приклад 14 Концентрація первинних антитіл До цього моменту в радіоактивному аналізі традиційно використовували розведення первинних антитіл у співвідношенні 1: 1000 з метою забезпечити концентрацію антитіл, яка не лімітувала чутливість твердофазного ІФА. Таким чином, якщо аналітичну методику згідно з цим винаходом необхідно буде використовувати в більшому масштабі, розведення антитіл може відігравати критичну роль при здійсненні аналізу. Тестування розведення первинних антитіл здійснювали з метою визначити можливість здійснення аналізу в більшому масштабі. Використовували основний спосіб твердофазного ІФА, описаний у Прикладі 1; планшет: планшет MaxiSorp; слиз: з проксимального відділу клубової кишки свині; Bio-Mos: концентрації 7 0, 5 і 10 г/л, розведення ФБР; бактерії: штам E. coli ALI84, ~10 бактерій/лунку; блокування: 10 % ембріональна бичача сироватка у ФБР; первинні антитіла: 200 мкл первинних антитіл, кон'югованих з біотином, у блокувальному буфері (у діапазоні 1: 1000-1: 10000); вторинні антитіла: 200 мкл стрептавідина, кон'югованого з ПХ (1: 1000 у блокувальному буфері); температура інкубації: кімнатна температура; субстрат: ТМБ. Розведення у співвідношенні 1: 1000 забезпечувало хорошу роздільну здатність між рівнями Bio-Mos, хоча використання менших розведень також було припустиме. Таким чином, для забезпечення помітних відмінностей у роздільній здатності аналізу згідно з винаходом у деяких варіантах реалізації використовували розведення у співвідношенні 1:1000 або менше (наприклад, 1:900, 1:750, 1:500 або менше). Таким чином, у деяких варіантах реалізації вибирали розведення первинних антитіл, достатнє для насичення всіх сайтів зв'язування бактерій, що тестуються у даній аналітичній методиці. У деяких варіантах реалізації при використанні аналітичної методики згідно з винаходом для детектування дії дуже невеликих кількостей (наприклад, концентрацій від приблизно 0,0001 г/л до приблизно 1,0 г/л), агента, що інгібує приєднання (наприклад, Bio-Mos) використовували ще менші розведення первинних антитіл (наприклад, 1:750, 1:500 або менше (наприклад, щоб забезпечити концентрацію антитіл, яка не була лімітуючим чинником розвитку фарбування). Як альтернатива в деяких варіантах реалізації для посилення утворення фарбування знижували кількість бактерій на лунку. Приклад 15 Обсяг реакційної суміші при аналізі Колориметричний сигнал розвивався особливо швидко в лунках з найбільшою кількістю бактерій. Тому в цьому дослідженні визначали можливість зниження інтенсивності сигналу при використанні меншої площі слизу (наприклад, площі, здатної зв'язувати меншу кількість бактерій (наприклад, знижуючи за рахунок цього інтенсивність сигналу)). Крім того, визначали можливість зниження кількості реагентів шляхом зменшення обсягу, необхідного для заповнення покритої лунки. Лунки з меншою кількістю слизу функціонували добре, межа детектування бактерій/лунку була аналогічна результатам, отриманим у попередніх прикладах. Фарбування розвивалося повільніше, чим раніше. Таким чином, це дослідження продемонструвало, що в деяких варіантах реалізації обсяг слизу в окремій лунці міг становити від приблизно 200 мкл до приблизно 300 мкл (наприклад, залежно від бажаної величини сигналу). У деяких варіантах реалізації обсяг слизу міг бути менше 200 мкл (наприклад, 150 мкл, 100 мкл або менше) або більше 300 мкл (наприклад, 350 мкл, 400 мкл або більш). У деяких варіантах реалізації це дослідження продемонструвало, що менші обсяги імобілізованого слизу дозволяли використовувати меншу кількість реагентів (наприклад, для обробки лунок, що містять 200 мкл слизу, досить приблизно половини кількості реагентів, необхідної для обробки лунки, що містить 300 мкл слизу) без втрати специфічності та функціональних можливостей аналізу (наприклад сигналу, що виявляється). Таким чином, цей винахід представляв способи та аналітичні методики для підтримки чутливості і функціональних можливостей аналізу, у той же час знижуючи витрати, пов'язані з витратою реагентів. Приклад 16 23 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Джерело слизу В експериментах, виконаних раніше (наприклад, у Прикладах 1-15), використовували слиз з проксимального відділу клубової кишки свині. Щоб визначити можливість колориметричного детектування при використанні слизу з інших джерел, виконали тестування слизу з ряду інших джерел (наприклад, проксимального відділу клубової кишки свині, дистального відділу товстої кишки свині, дванадцятипалої кишки м'ясного курчати і сліпої кишки м'ясного курчати) у контексті методики твердофазного ІФА, описаної в Прикладі 1. Планшет: планшет MaxiSorp; слиз: проксимального відділу клубової кишки та дистального відділу товстої кишки свині, дванадцятипалої і сліпої кишки м'ясного курчати; бактерії: штам E. coli ALI84, 107 бактерій/лунку; буфер: ФБР; Bio-Mos: концентрації 0, 0,1, 1 і 10, додані разом з бактеріями; блокування: 10 % ембріональна бичача сироватка; первинні антитіла: первинні антитіла, кон'юговані з біотином, розведення у співвідношенні 1: 1000 у блокувальному буфері; вторинні антитіла: стрептавідин, кон'югований з ПХ, розведення у співвідношенні 1: 1000 у блокувальному буфері; температура інкубації: +37 °C; субстрат: ТМБ. Як показано на Фігурі 21, бактерії проявляли різні рівні (наприклад, за міцністю і/або афінністю) приєднання залежно від типу використаного слизу. Наприклад, протестовані бактерії приєднувалися майже у два рази ефективніше до слизу, отриманого з дванадцятипалої кишки м'ясного курчати та сліпої кишки м'ясного курчати, ніж до слизу, отриманого з клубової кишки і товстої кишки свині. У той же час, колориметричний аналіз був досить чутливий і надійний для реєстрації різних рівнів адгезії бактерій, а також здатності блокувального агента (наприклад, Bio-Mos) інгібувати адгезію бактерій до слизу в діапазоні концентрацій блокувального агента. Таким чином, у деяких варіантах реалізації цей винахід забезпечує нерадіоактивний колориметричний аналіз, який можна використовувати зі слизом різних типів і/або з різних джерел (наприклад, різних тварин і різних частин травної системи (наприклад, кишечнику)). Приклад 17 Порівняння радіоактивного і колориметричного аналізу Для порівняння матеріалів і методів, використаних при колориметричному аналізі згідно з винаходом з матеріалами та способами, використаними при традиційному радіоактивному аналізі, і для оцінки здатності кожної аналітичної методики виявляти відмінності в адгезії бактерій, викликані дією Bio-Mos, виконали паралельний експеримент. Планшети: планшет MaxiSorp і гнучкий планшет; слиз: з проксимального відділу клубової кишки свині; Bio-Mos: 50 мкл/лунку в різних концентраціях, розведення ФБР; бактерії: ~107 бактерій/лунку. На обох планшетах для забезпечення їх ідентичності використовували ту саму суспензію радіоактивно мічених бактерій; блокування (тільки на планшеті MaxiSorp): 10 % ембріональна бичача сироватка у ФБР; первинні антитіла (тільки на планшеті MaxiSorp): 100 мкл первинних антитіл, кон'югованих з біотином (1: 1000 у блокувальному буфері); вторинні антитіла (тільки на планшеті MaxiSorp): стрептавідин, кон'югований з ПХ (1: 1000 у блокувальному буфері); температура інкубації: кімнатна температура; субстрат: ТМБ; після твердофазного ІФА обидва планшета заповнювали сцинтиляційною рідиною і вимірювали радіоактивність за допомогою сцинтиляційного лічильника. Дія Bio-Mos, що спостерігається, була дуже подібною при використанні матеріалів і методів обох аналітичних методик. Виявилося, що низькі концентрації Bio-Mos підсилювали приєднання бактерій до слизу. Хоча розкриття механізму не є необхідним для здійснення цього винаходу, і цей винахід не обмежується конкретним механізмом дії, у деяких варіантах реалізації при найменших концентраціях Bio-Mos або агент іншого типу, що інгібує, брав участь в утворенні агрегатів бактерій. Таким чином, навіть якщо найменша концентрація підсилює приєднання, згідно з вимірюваннями за допомогою аналітичних методик, агрегати, очевидно (наприклад, у контексті просвіту кишечнику), легше вимиваються з кишечнику. Таким чином, низькі концентрації Bio-Mos або інших агентів, що інгібують (наприклад, ідентифікованих і/або охарактеризованих за допомогою способів згідно з винаходом, описаних у цьому документі) фактично могли видаляти бактерії ефективніше, ніж і/або настільки ж ефективно, як більш високі концентрації. Як показано на Фігурі 22, при дуже низьких концентраціях Bio-Mos поглинання при цих двох способах в деякій мірі різнилося. Апроксимація графіка твердофазного ІФА була подібною вже на дуже ранній стадії (= низькі значення поглинання), і, таким чином, тенденція до зниження від 1,0 г/л до 0,1 г/л, імовірно, не була обумовлена обмеженими можливостями зчитувального обладнання для твердофазного ІФА. Факторами для розвитку фарбування, що лімітують, могли бути концентрації антитіл або субстрату, однак ця гіпотеза не пояснює слабкої тенденції до зниження від 1,0 г/л до 0,1 г/л. Ці результати та результати з інших прикладів показали, що найбільші значення поглинання 24 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержали або при 0,1 г/л, або при 1,0 г/л. Таким чином, це дослідження продемонструвало, що в деяких варіантах реалізації розкид був викликаний відмінностями в кількості бактерій між експериментами. Таким чином, у деяких варіантах реалізації для одержання порівнянних результатів було можна використовувати ту саму суспензію бактерій або стандартизувати спосіб культивування, щоб забезпечити однакову вихідну кількість бактерій у паралельних експериментах. Таким чином, у деяких варіантах реалізації зниження кількості бактерій могло зробити концентрацію Bio-Mos і/або іншого блокувального агента (наприклад, агента, що тестується) основним фактором, що лімітує, замість кількості сайтів зв'язування слизу, концентрації антитіл або субстрату. Приклад 18 Нерадіоактивний аналіз зв'язування бактерій Під час розробки варіантів реалізації винаходу виконували експерименти з метою подальшого тестового використання розробленого в цій заявці колориметричного твердофазного ІФА для вимірювання приєднання патогенів і оцінки ступеня впливу агентів, що тестуються, на це приєднання. Таким чином, ці експерименти виконували для визначення можливості використання аналітичної методики для порівняльного дослідження агентів, що тестуються, які можуть впливати або не впливати (наприклад, інгібувати) на приєднання бактерій до слизу. Таким чином, ці експерименти виконували для визначення можливості використання аналітичної методики для порівняльного дослідження агентів, що тестуються, які можуть впливати або не впливати (наприклад, інгібувати) на приєднання бактерій до слизу. Коротко, цей винахід забезпечує альтернативу використанню радіоактивних речовин, живих патогенів (наприклад, для аналізу згідно з винаходом не потрібно використовувати ні живі, ні радіоактивні бактерії (наприклад, цей винахід передбачає використання бактерій, інактивованих етанолом, у методиці аналізу приєднання)), а також представляє планшети, покриті слизом і висушені повітрям. Таким чином, способи, розроблені в рамках варіантів реалізації винаходу, забезпечували значні переваги перед традиційними способами, які полягали в тому, що в деяких варіантах реалізації способи, представлені в цьому документі, усували необхідність використання живих і/або радіоактивних бактерій (наприклад, патогенних бактерій), а також усували необхідність у регулюванні щільності бактерій щоразу при проведенні аналізу. Зберігання та однорідність препарату бактерій. Згідно з описом у Прикладах 9, 10 і 12, щільність препарату бактерій, використаних при аналізі приєднання, була важливою змінною для реакції. При низькій щільності бактерій сигнал був слабким, у той час як при високій щільності бактерій сигнал перебував в області вище лінійного діапазону. На основі цих даних зробили висновок, що для забезпечення точності, чутливості та порівнянності послідовних аналізів була необхідна фіксована щільність бактерій. Крім того, визначили можливість одержання стандартної суспензії бактерій (наприклад, простій для зберігання та використання і непатогенної) (наприклад, для використання в серії аналізів, що здійснюються не в один і той же час (наприклад, у різні дні, або в різні тижні або місяці)). Відробили і протестували велику кількість способів консервації та інактивації, включаючи консервацію та інактивацію хімічними фіксаторами (наприклад, етанолом, глутаральдегідом, формаліном, ДМСО), інактивацію УФопроміненням і використання замороженої суспензії живих бактерій. Консервація планшетів, покритих слизом. У раніше описаних аналітичних методиках (наприклад, у Прикладах 1-15) 96-ямкові планшети покривали слизом щоразу при проведенні аналізу. Відповідно до опису, для цієї процедури було необхідне інкубування протягом ночі. Тому виконали експерименти з метою визначення можливості заміни цього тривалого способу (наприклад, за рахунок використання заздалегідь виготовлених планшетів, покритих слизом, що допускали тривале зберігання). Протестували ряд способів, включаючи заморожування покритих планшетів, а також висушування планшетів повітрям і використання після тривалого зберігання (наприклад, з різними типами слизу). Способи. Культивування та інактивація бактерій. Бактерії вирощували в середовищі LB і переносили у свіже середовище (10 % інокулят) за добу до планованих тестів. Тестували кілька різних способів інактивації або консервації бактерій: Заморожування: вирощену культуру бактерій заморожували при -20 °C. Перед використанням культуру розморожували при кімнатній температурі. Одну партію заморожували з гліцерином для захисту клітин від ушкоджень під час заморожування, однак використання цього підходу припинили через те, що витягнення бактерій з гліцерину було проблематичним і приводило до неприйнятних результатів. Етанол: До культури бактерій у середовищі LB додавали етанол у співвідношенні 1:1, одержуючи 50 % розчин етанолу. Суспензію зберігали при 4 °C. 25 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Глутаральдегід: глутаральдегід використовували в кінцевій концентрації 4 %. Суспензію зберігали при 4 °C. Формалін: формальдегід використовували в кінцевій концентрації 4 %. Суспензію зберігали при 4 °C. УФ: культуру опромінювали УФ-лампою протягом 30-60 хвилин. Суспензію зберігали при 4 °C. Диметилсульфоксид: ДМСО додавали в культуру в концентрації 10 %. Суспензію зберігали при 4 °C. Нагрівання: Культуру нагрівали при 70 °C протягом 30 хвилин і потім зберігали при 4 °C. Бактерії збирали центрифугуванням безпосередньо перед використанням. Виготовлення та консервація планшетів, покритих слизом. Слиз, зіскоблений з кишечнику поросят, розбавляли в NaCO3-буфері (pH 9,6), одержуючи суспензію, що містила 0,1-0,3 мг білка слизу/мл. 300 мкл цієї суспензії вносили в кожну лунку 96-ямкового імунологічного планшета. Планшет інкубували при 4 °C протягом ночі. При висушуванні повітрям планшети двічі промивали ФБР і висушували в ламінарі протягом ночі. Планшети зберігали при кімнатній температурі в пластмасових пакетах. Перед використанням у кожну лунку вносили 300 мкл ФБР і виконували регідратацію слизу протягом 10 хвилин, після чого ФБР видаляли шляхом обережного струшування планшета догори дригом. При заморожуванні планшети заморожували при -20 °C разом з суспензією слизу. Перед використанням розморожували при кімнатній температурі і тричі промивали ФБР. Свіжовироблені планшети тричі промивали ФБР після імобілізації слизу протягом ночі. Результати Вихідне порівняльне дослідження способів консервації бактерій з використанням радіоактивного аналізу. Виявилося, що три способи з використанням консервованих бактерій дозволяли одержати задовільні результати у порівнянні з аналізом при використанні свіжих бактерій (див. Фігуру 23). Ці способи являли собою інактивацію етанолом, УФ-опромінення та заморожування (інші способи визнали невідповідними для цього аналізу). Дані для бактерій, інактивованих УФ і ДМСО, не показано на Фігурі 23, оскільки при їхньому одержанні використовували різні суспензії бактерій. Інактивація ДМСО в значній мірі пригнічувала адгезію бактерій, у той час як УФ-опромінення бактерій, що тестуються, давало порівняно хороші результати стосовно адгезії. Крім абсолютної адгезії, також досліджували здатність способів детектувати інгібування прикріплення під дією досліджуваних агентів. Результати, отримані при використанні способів консервації бактерій, що не включають ДМСО та УФ-опромінення, показано на Фігурі 23. Незалежно від використаного способу, аналіз дозволяв виявити інгібування адгезії E. coli за рахунок Bio-Mos. Методики твердофазного ІФА, що включають обрані способи консервації бактерій. На основі цих результатів три способи інактивації бактерій тестували в системі детектування бактерій на основі твердофазного ІФА. Хоча цей винахід не обмежується яким-небудь механізмом дії і розуміння механізму дії не є необхідною умовою для здійснення цього винаходу, представляється можливим, що фіксація бактерій відповідно до кожного з вищезгаданих способів могла змінювати антигенні характеристики бактерій, що могло привести до неможливості детектування модифікованих бактерій при використанні способів на основі антитіл. Однак виявилося, що спосіб на основі твердофазного ІФА успішно працював з препаратами бактерій, що тестуються. Серед способів інактивації бактерій УФ-інактивація та заморожування давали кращі результати з погляду абсолютної ефективності адгезії бактерій, ніж консервація з етанолом, як показано на Фігурі 24. У той же час ці способи мали великі недоліки з погляду їх практичного використання: УФ-інактивована суспензія бактерій була стабільна тільки до розгерметизації, але легко ушкоджувалася іншими бактеріями при впливі мікроорганізмів з навколишнього середовища. Заморожені бактерії, з іншого боку, зберігали життєздатність і могли почати рости або проявляти метаболічну активність після розморожування. Ці фактори впливали на точність і відтворюваність аналізу. Більше того, при роботі з живими бактеріями доводилося брати до уваги міркування безпеки. Оптимізація концентрації етанолу в суспензії бактерій. Незважаючи на те, що консервація бактерій з етанолом виявилася не ідеальною, через інші переваги, що забезпечуються цим способом, було вирішено продовжувати спроби розробки цього підходу. Спочатку використовували етанол у концентрації 50 %, ґрунтуючись на його здатності вбивати бактерії. У той же час виконали тестування інших концентрацій спирту з метою визначення дії концентрації спирту на адгезію бактерій. Згідно з цими експериментами, концентрація етанолу суттєво 26 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 впливала на ефективність адгезії бактерій. Хоча цей винахід не обмежується яким-небудь механізмом дії і розуміння механізму дії не є необхідною умовою для здійснення цього винаходу, у деяких варіантах реалізації це дослідження продемонструвало, що етанол від'єднував або руйнував фімбрії, необхідні для зв'язування, або змінював інші антигенні властивості бактерій. Виявилося, що етанол у концентрації 40 % виявляє значно кращу дію, ніж 50 % етанол, з точки зору ефективності адгезії. Нелінійну лінію тренда, показану на Фігурі 25, спостерігали неодноразово. Консервація планшетів, покритих слизом. Здатність бактерій прикріплюватися до планшетів, покритих слизом і консервованими висушуванням повітрям і заморожуванням, тестували шляхом їхнього порівняння зі свіжопокритими планшетами. У тестах з радіоактивно міченими бактеріями планшет, висушений повітрям, дозволяв одержати порівнянні зі свіжопокритим планшетом результати, у той час як заморожений планшет дозволяв одержати в якійсь мірі більш високу кількість сцинтиляцій. Кожний спосіб тестували з використанням нерадіоактивного твердофазного ІФА згідно з винаходом. Як показано на Фігурі 26, планшети, висушені повітрям, давали більш слабкий сигнал, ніж планшети, що зберігалися в замороженому стані, і свіжопокриті планшети. У той же час усі використані способи дозволяли вільно відслідковувати дію Bio-Mos на адгезію бактерій. Таким чином, цей винахід забезпечує спосіб використання заздалегідь виготовлених і прийнятних для зберігання планшетів, покритих слизом (наприклад, планшетів, висушених повітрям або таких, що зберігалися в замороженому стані). Час регідратації висушених планшетів. Регідратацію планшетів, висушених повітрям, перед початком аналізу тестували протягом проміжків часу від 1 хвилини до 12 годин. Визначили, що час регідратації впливав на результати аналізу, однак для одержання порівнянних результатів у всіх наступних аналізах використовували постійний (наприклад, рівний 10 хвилинам) час регідратації. Концентрація слизу в лунках. Концентрацію слизу в лунках тестували раніше, однак було ухвалене рішення перевірити можливість посилення адгезії бактерій за рахунок більш високих концентрацій слизу. Протестували три рівні вмісту слизу в буфері для імобілізації, що відповідали 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл і 0,3 мг/мл білка, відповідно. Адгезія бактерій явно підсилювалася при підвищенні концентрації слизу, причому використання концентрації 0,3 мг білка/мл дозволяло одержати найбільш виражену адгезію. Виявлення змін адгезії бактерій при використанні агента, що тестується (наприклад, BioMos). На основі попередніх експериментів з підрахунком сцинтиляцій і твердофазним ІФА для перевірки дії агента, що тестується (наприклад, Bio-Mos) і його здатності змінювати адгезію бактерій до слизу використовували бактерії, інактивовані етанолом, і планшети, висушені повітрям. Отримані дані показали, що підсумкова крива була в значній мірі подібною з кривою, отриманою при виконанні твердофазного ІФА з використанням свіжих бактерій і планшетів. Можливість використання інших типів слизу. Твердофазний ІФА (з використанням планшетів, що зберігалися, і бактерій, інактивованих EtOH) тестували у відношенні інших типів слизу. Твердофазний ІФА дозволяв одержати прийнятні дані при використанні різних типів слизу, включаючи слиз проксимального відділу клубової кишки свині, дистального відділу товстої кишки свині, дванадцятипалої кишки м'ясного курчати і сліпої кишки м'ясного курчати. Це дослідження продемонструвало, що твердофазний ІФА при використанні планшетів, що зберігалися, і бактерій, що зберігалися, інактивованих EtOH, дозволяв одержати прийнятні дані відносно джерела слизу, а дія агента, що тестується, здатного блокувати приєднання/адгезію бактерій (наприклад, Bio-Mos), була подібною незалежно від джерела слизу. Таким чином, цей винахід забезпечує композиції (наприклад, бактерії, інактивовані етанолом і планшети, покриті слизом і висушені повітрям) і способи (наприклад, нерадіоактивний твердофазний ІФА) для моніторингу та дослідження приєднання/адгезії бактеріальних клітин до слизу, що відрізняються простотою у використанні та безпекою, і матеріали, які легко зберігати і транспортувати. Подальше дослідження нерадіоактивного аналізу зв'язування бактерій. Під час розробки винаходу виконали експерименти з метою оцінки вірогідності, відтворюваності та розкиду результатів нерадіоактивних аналітичних методик, представлених у цьому документі. Тестували розкид між різними партіями бактерій і планшетами та визначали відтворюваність аналізу (наприклад, при виконанні аналізу в різні дати (розкид між планшетами) і моніторинг розкиду серед повторюваних зразків всередині планшета). Методи Культивування та інактивація бактерій. Бактерії вирощували в середовищі LB і переносили у свіже середовище (10 % інокулят) за добу до інактивації етанолом. Бактерії інактивували і консервували шляхом внесення етанолу безпосередньо в культуру, вирощену протягом ночі, у 27 UA 107194 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 кінцевій концентрації 40 % (об/об). Суспензію зберігали при 4 °C і збирали центрифугуванням безпосередньо перед використанням. Осад ресуспендували у вихідному об'ємі середовища LB, одержуючи суспензію, що містила приблизно 108 бактерій/мл. Виготовлення і консервація планшетів, покритих слизом. Слиз, зіскоблений з кишечнику поросят, розбавляли в NaCO3-буфері (pH 9,6), одержуючи суспензію, що містила 0,3 мг білка слизу/мл. 300 мкл цієї суспензії вносили в кожну лунку 96-ямкового імунологічного планшета. Планшет інкубували при 4 °C протягом ночі. Потім планшети двічі промивали ФБР, висушували в ламінарі протягом ночі та зберігали в пластмасових пакетах при кімнатній температурі. Перед використанням у кожну лунку вносили 300 мкл ФБР і виконували регідратацію слизу протягом 10 хвилин, після чого ФБР видаляли шляхом обережного струшування планшета догори дригом. Спосіб твердофазного ІФА. Покриті слизом і висушені повітрям планшети піддавали регідратації протягом 10 хвилин у ФБР, після чого додавали 100 мкл суспензії бактерій і або 100 мкл суспензії Bio-Mos у ФБР, або 100 мкл чистого ФБР. Зразки для випробувань у випадковий спосіб розподіляли по лунках, щоб уникнути систематичних помилок. Планшет інкубували протягом 1 год. при кімнатній температурі, захищали від світла та випаровування. Після інкубації планшети трикратно промивали ФБР і вносили блокувальний буфер (10 % ембріональну бичачу сироватку). Планшет інкубували, як описано вище, і спустошували. Додавали первинні антитіла, планшет інкубували та промивали, як описано вище. Додавали вторинні антитіла, планшет інкубували та промивали, як описано вище. В кінці в лунки додавали ТМБ-субстрат та інкубували для розвитку фарбування протягом 15-30 хвилин. Реакцію зупиняли сірчаною кислотою і вимірювали поглинання при довжині хвилі 450 нм. Статистичний аналіз. Для значень, які масштабували таким чином, що середнє за нульовими значенням для кожного планшета становило 100 %, оцінювали коефіцієнти варіації. Оцінки коефіцієнтів варіації всередині планшета і між планшетами розраховували для цих масштабованих значень 1 і 2 рівнів, використовуючи середньоквадратичні помилки однофакторного дисперсійного аналізу для оцінки дисперсій між варіантами випробувань і всередині варіанта випробувань. Ці оцінки виконували роздільно для різних рівнів Bio-Mos. Аналіз потужності виконували для одержання оцінки того, скільки повторних зразків необхідно для детектування відмінностей між двома випробуваннями. Використовували рівень ризику u=0,05 і статистичну потужність = 0,8 або 0,9. Результати Розкид вимірювали за повторюваними зразками, дослідженими на одному планшеті. Для оцінки продукту важливо, щоб аналіз декількох повторюваних зразків у тому самому планшеті був відтворений і, таким чином, являє собою надійний тест з відомою і достатньою для практичного використання межею детектування. Для цих цілей аналіз виконували на планшеті, покритому гомогенним слизом, з використанням одиночної партії препарату бактерій. На Фігурі 28 показано, що існує деякий розкид від лунки до лунки, однак дія внесеного Bio-Mos, що інгібує адгезію, була явною і відтвореною. Порівняння з контрольними лунками показало, що рівні BioMos 1 мг/мл і 2 мг/мл відрізнялися від контролю зі значенням p < 0,0001. Однак, як показано на Фігурі 28, ці два рівні Bio-Mos не відрізнялися один від одного. Коефіцієнти варіації розраховували окремо для кожного варіанта випробувань. Розкид вимірювали на основі чотирьох різних планшетів зі слизом. Для цілей оцінки продукту важливо, щоб аналіз був відтворений. Для визначення відтворюваності аналізу (наприклад, у різний час при використанні тих самих реагентів) експеримент, дані якого показано на Фігурі 28, повторювали 4 рази в чотири різні дати. Кожну серію тестів виконували в різні дати і з використанням різних планшетів, але одного препарату бактерій. Результати представлені на чотирьох графіках на Фігурі 29. Середній розкид всередині різних планшетів склав 14 %, 14 % і 13 % для планшетів 1, 2 і 3, відповідно, і 22 % для планшета 4. CV, розраховані для кожного тесту всередині кожного планшета, показані нижче в Таблиці 1. Виявилося, що існувала тенденція, згідно з якою значення CV у контрольних лунках були нижче, ніж у присутності Bio-Mos. Середнє значення CV, розраховане для всіх чотирьох планшетів, що тестуються, і всіх випробувань, склало 16 % ( Таблиця 1 Тест Bio-Mos відсутній Bio-Mos 1 мг/мл CV, виміряні для зазначених повторних зразків, що тестуються Планшет 1 Планшет 2 Планшет 3 Планшет 4 Середнє 1% 8% 8% 23 % 1% 13 % 12 % 15 % 24 % 16 % 55 28