Інгібітори апоптозу та їх застосування

Реферат: Винахід стосується фрагментів DAXX протеїнів, які інгібують клітинний апоптоз, зокрема клітинний апоптоз, опосередкований Fas рецептором. Винахід, крім того, стосується похідних зазначених антиапоптозних фрагментів, кон'югатів, які містять зазначені фрагменти, фармацевтичних композицій, які містять зазначені фрагменти, та медичних застосувань зазначених фрагментів, похідних, кон'югатів та їх фармацевтичних композицій в лікуванні або попередженні захворювань або станів, пов'язаних з апоптозом. UA 112420 C2 (12) UA 112420 C2 UA 112420 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Споріднена заявка Представлена заявка на патент заявляє про пріоритет міжнародної заявки на патент №. PCT/IB2010/003158, зареєстрованої 18 листопада 2010, яка є включеною в даний документ шляхом посилання на неї в повному об'ємі. Галузь винаходу Винахід стосується інгібіторів апоптозу та їх застосування, а саме в консервативних лікуваннях. Передумови створення винаходу Ішемічна хвороба серця є основною причиною смерті в усьому світі, що становить 3,8 мільйона смертей серед чоловіків та 3,4 мільйона смертей серед жінок на рік. Оскільки зростає вік населення, то й супутні захворювання (наприклад, ожиріння та метаболічний синдром) стають все більш поширеними, а саме, за останні роки, величезне навантаження на громадську охорону здоров'я, викликане ішемічною хворобою серця, ймовірно, рівномірно зростатиме й далі (огляд в Yellon et al, N Engl J Med, 2007; 357: 1121-1135). Ішемічна хвороба серця відноситься до недостатності коронарного кровообігу, що обумовлює відповідне кровопостачання серцевого м'яза та навколишніх тканин. Найбільш загальною причиною розвитку ішемічної хвороби серця є накопичення атеросклеротичних бляшок (тобто жирових відкладень) на стінах коронарних артерій. Непрохідність коронарної артерії обмежує кровоток до серця, призводить до ішемії клітин міокарда (тобто клітинне голодування другорядне до нестачі кисню) та в результаті може призвести до смерті клітини міокарда, яке називається інфарктом міокарду (ІМ) або гострим інфарктом міокарду (ГІМ) широко відомий як серцевий напад. ГІМ є лідируючою причиною смерті як в Європі, так і Сполучених Штатах, та залишається частим (більше ніж 1,5 мільйона нових випадків у рік в Сполучених Штатах) та таким, що робить непрацездатним, (що призводить до серцевої недостатності) захворюванням. Розмір інфаркту є основним чинником, що визначає функціональне відновлення міокарда та смертність після ГІМ. В даний момент, найбільш ефективним способом обмеження розміру інфаркту є зробити реперфузію міокарду, що знаходиться в зоні ризику, якомога швидше з використанням коронарної ангіопластики або тромболізису та, щоб запобігти повторному закупорюванню коронарної артерії застосовують антитромбоцитарну терапію. Реперфузії або відновлення кровотоку до ішемічного міокарду досягається за допомогою тромболітичної терапії, яка розчиняє тромб або шляхом розширення закупореної артерії за допомогою черезшкірної коронарної ангіопластики. Реперфузії є необхідною для порятунку клітин міокарда та серцевої функції в цілому. Тим не менш, реперфузія ініціює каскад подій, які призводять до "реперфузійного пошкодження". Крім того, відбувається наступне відновлення після кардіоплегічної зупинки серця під час операції шунтування. Реперфузійного пошкодження характеризується аритмією, ендотеліальною дисфункцією, що призводять до феномену порушення мікроциркуляції обструктивного генезу та постішемчного порушення функції скорочення міокарду (оборотні втрати скорочувальної здатності міокарда). Реперфузійне ушкодження досягає найвищої точки в апоптозну смерть клітин серця, які були життєздатними безпосередньо перед реперфузією міокарду. Задіяність високо регульованої форми смерті клітин під час ішемії міокарду/реперфузії може призвести до нових терапевтичних втручань у фазі реперфузії. Тим не менш, апоптозні сигнальні шляхи, які задіяні під час ішемії міокарду/реперфузії ще не були повністю окреслені in vivo. Пошук нових способів лікування для інгібування апоптозу (тобто, "запрограмованої смерті клітини"), та зокрема, для лікування інфаркту міокарда та реперфузійного ушкодження, таким чином, являє собою реальну проблему для захисту серцевої функції та для порятунку життів. Короткий опис суті винаходу Винахід ґрунтується на виявленні того, що є можливим для зниження апоптозу серцевих клітин після інфаркту міокарду за рахунок інгібування Fas сигнального шляху. Fas рецептор тримеризується при зв'язуванні з FasL (Fas ліганд) таіндукує апоптоз через цитоплазматичний домен, який називають DD (домен загибелі), який взаємодіє з сигнальними адапторами, такими як FAF-1 (Fas-асоційований фактор-1), FADD (Fas-асоційований домен загибелі), DAXX (протеїн, асоційований з доменом загибелі), FAP-1, FLASH (FLICE-асоційований гігант) та RIP (протеїн, що взаємодіє з рецептором). DAXX та FADD незалежно зв'язуються з Fas, та активують певний апоптозний шлях. DAXX може посилювати Fas-опосередкований апоптоз за рахунок активування JNK кіназного каскаду, що є завершальним в фосфорилюванні та активації факторів транскрипції, таких як c-Jun. На відміну від цього, FADD тригери через каскад сигнальних каспаз здійснюють вивільнення мітохондріальних про-апоптозних факторів 1 UA 112420 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аналогічних CytoC (цитохрому-C) та SMAC (вторинний мітохондріального походження активатор каспаз), який також називають Diablo. Винахідники показали, що інгібування взаємодії Fas рецептору з DAXX (SEQ ID NO: 1) або з FADD (SEQ ID NO: 8) призводить до сильного зниження апоптозу серцевих клітин після інфаркту міокарду. Більш того, дані винахідники неочікувано виявили, малі фрагменти DAXX та FADD акумулюють анти-апоптозну здатність від цілих протеїнів DAXX та FADD, відповідно. Відповідно, представлений винахід стосується пептиду, що складається з: - фрагменту 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24 послідовних амінокислотних залишків DAXX протеїну з SEQ ID NO: 1, де вказаний фрагмент містить амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 5, або - фрагменту 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 послідовних амінокислотних залишків FADD протеїну з SEQ ID NO: 8, де вказаний фрагмент містить амінокислотну послідовність, зазначену в SEQ ID NO: 12, де згаданий пептид є здатним до інгібування клітинного апоптозу. В конкретних втіленнях анти-апоптозний пептид відповідно до винаходу представляє собою фрагмент DAXX протеїну, що складається з амінокислотної послідовності, зазначеної в SEQ ID NO: 5. В інших втіленнях, анти-апоптозний пептид представляє собою фрагмент DAXX, що складається з амінокислотної послідовності, зазначеної в будь-якій одній з SEQ ID NO: 21-44. В інших втіленнях, анти-апоптозний пептид відповідно до винаходу представляє собою фрагмент FADD протеїну, що складається з амінокислотної послідовності, зазначеної в SEQ ID NO: 12 або SEQ ID NO: 9. В інших втіленнях, анти-апоптозний пептид представляє собою фрагмент FADD, що складається з амінокислотної послідовності, зазначеної в будь-якій одній з SEQ ID NO: 45-57. В іншому аспекті представлений винахід стосується пептидоміметика анти-апоптозного пептиду відповідно до винаходу. В ще іншому аспекті представлений винахід передбачає кон'югат, який містить антиапоптозний пептид або пептидоміметик відповідно до винаходу, зв'язаний з клітиннопроникаючим пептидом. Клітинно-проникаючим пептидом може бути Tat, RXR, Bpep або Pip2b. В конкретних втіленнях клітинно-проникаючий пептид зв'язується з пептидом або пептидоміметиком через лінкер. В конкретних втіленнях клітинно-проникаючий пептид вибирають з групи, що складається з Tat, RXR, Bpep та Pip2b. Зокрема, в конкретних переважних втіленнях кон'югат складається з амінокислотної послідовності, зазначеної в SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 або SEQ ID NO: 61. В ще іншому аспекті представлений винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить, щонайменше, один фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт та ефективну кількість, щонайменше, одного пептиду або, щонайменше, одного пептидоміметика, або, щонайменше, одного кон'югату відповідно до винаходу. В конкретних втіленнях фармацевтична композиція відповідно до винаходу, крім того, містить щонайменше один додатковий біологічно активний агент. Зокрема, біологічно активний агент може бути вибраний з групи, що складається з циклоспорину A, BH4 та їх комбінацій. В ще іншому аспекті представлений винахід передбачає пептиди, пептидоміметики, кон'югати та фармацевтичні композиції відповідно до винаходу для застосування в способі лікування організму людини або тварини, а саме, для застосування в способі інгібування клітинного апоптозу в організмі людини або тварини. В конкретних втіленнях, пептиди, пептидоміметики, кон'югати та фармацевтичні композиції, відповідно до винаходу, застосовують в способі лікування гострого інфаркту міокарду (ГІМ), ішемічного інсульту, трансплантацій органів, кардіологічних втручань (екстракорпоральна циркуляція та тимчасова непрохідність судин) або гострі кровообігові розлади (стан нападу), в організмі людини або тварини. В інших втіленнях пептиди, пептидоміметики, кон'югати та фармацевтичні композиції відповідно до винаходу застосовують в способі лікування ішемії, а саме, серцевої ішемії, ниркової ішемії, ішемічного коліту, мезентеріального тромбозу, мозкової ішемії, ішемії кінцівок або ішемії шкіри, в організмі людини або тварини. В ще інших втіленнях пептиди, пептидоміметики, кон'югати та фармацевтичні композиції відповідно до винаходу застосовують в способі лікування реперфузійного пошкодження в організмі людини або тварини. В спорідненому аспекті представлений винахід, крім того, передбачає спосіб лікування захворювання або стану, пов'язаного з апоптозом у суб'єкта, який включає стадію: введення згаданому суб'єкту ефективної кількості, щонайменше, одного пептиду, або, щонайменше, 2 UA 112420 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одного пептидоміметика, або, щонайменше, одного кон'югата, або, щонайменше, однієї фармацевтичної композиції відповідно до винаходу. В конкретних втіленнях, спосіб додатково включає стадію введення згаданому суб'єкту, щонайменше, одного додаткового біологічно активного агенту, вибраного з групи, яка складається з циклоспорину A, BH4 та їх комбінацій. Як вказано вище, в даних способах лікування захворювання або стан, пов'язаний з апоптозом може бути вибраний з групи, яка складається з гострого інфаркту міокарда (ГІМ), ішемічного інсульту, трансплантацій органів, кардіологічних втручань, гострих розладів кровообігу, реперфузійного пошкодження та ішемії. Ці та інші об'єкти, переваги та особливості представленого винаходу стануть очевидними для кваліфікованого спеціаліста в даній галузі, який прочитає наступний детальний опис переважних втілень винаходу. Короткий опис креслень Фігура 1: Визначення DAXX епітопу за допомогою SPOT синтезу. (A) Амінокислотну послідовність DAXX розсікали в масивах пептиду, що перекриваються (пепскан; 15 мірні пептиди із зсувом на 3 амінокислоти) та аналізували шляхом блоттінгу з ферментною міткою. Чорний прямокутник показує чотири найбільш яскраві плями з відповідною послідовністю епітопу. Умови інкубування: His-мічений внутрішньоклітинна ділянка Fas рецептору [10 мкг/мл]; антитіла: анти-His-(мишачий) (Sigma H1029; 1:6,000) / анти-мишачий-HRP (Calbiochem 401207; 1:2,000), період витримки: 1 хвилина. (B) Вирівнювання DAXX послідовності людини, яка включає 16-мірний KKSRKEKKQTGSGPLG (=DAXXp з SEQ ID NO: 5) із DAXX послідовностей інших видів (миші, щура, собаки (CANFA) та зеленої мавпи (CHLAE)). Фігура 2: Визначення оптимальної довжини DAXX епітопу (=DAXXp) шляхом SPOT синтезу. (A) Петиди DAXXp-211 та DAXXp-209 (з SEQ ID NO: 2 та SEQ ID NO: 3, відповідно) були успішно укороченні за рахунок одного амінокислотного залишку на N-кінці, на C-кінці та як на N- так і на C-кінцях, та проаналізовані, використовуючи блоттінг з ферментною міткою. Вказані стрілочкою плями продемонстрували найвищу інтенсивність сигналу (BLU). Інкубаційні умови: His-мічена внутрішньоклітинна ділянка Fas рецептору [10 мкг/мл]; антитіла: анти-His-(мишаче) (Sigma H1029; 1:6,000) / анти-мишачий-HRP (Calbiochem 401207; 1:2,000), період витримки: 1 хвилина. (B) Вирівнювання обох пептидних послідовностей DAXXp-211 та DAXXp-209; що відповідає найяскравішим плямам, щоб визначити оптимальну DAXX пептидну послідовність. Фігура 3: Визначення здатності Tat-DAXXp та Pip2b-DAXXp протеази. (A) Вимірювання стабільності Tat-DAXXp та Pip2b-DAXXp кон'югатів в ембріональній бичачій сироватці (FBS, BioWest) та (B) свіжо приготовлена мишача сироватка (MS). Пептиди інкубували з 20 % сироваткою при 37 °C протягом 0 год., 1 год., 2 год., 4 год., 8 год., 24 год. та 48 год., та 50 мкл інкубаційної суміші осаджували 100 мкл 10 % дихлороцтової кислоти (DCA) в H2O/CH3CN (50/50). Зразки змішували та зберігали при -20 °C. Осаджені протеїни сироватки відокремлювали центрифугуванням (14 000 обертів на хвилину, 10 хвилин) та супернатант аналізували, використовуючи ВЕРХ з оберненою фазою (вимірювання площі піку в мВ*сек). n2 для кожного стану. Після інкубації протягом 2 годин в мишачій сироватці, більше ніж 70 % пептидів є все ще інтактними, тоді як через 24 години всі пептиди є зруйнованими. Фігура 4: Клітинне розподілення в залежності від періоду інкубації. Первинні кардіоміоцити інкубували з 1 мкМ розчином CF-мічених Tat-DAXXp кон'югатів (зелена флуоресценція) протягом 1 год., 4 год. або 6 год. Ядра клітин фарбували барвником хьохст (блакитний). Білі смужки представляють собою 10 мкм. Внутрішньоклітинне розподілення CF-Tat-DAXXp після 1 год. інкубації показало підкреслену конфігурацію в цитозолі (яка є характерною для ендосомального захоплення пептидів після інтерналізації через ендоцитоз) та ніякої ядерної локалізації не було виявлено. Після 4 годин інкубації, виглядає, що CF-Tat-DAXXp є здатним, щоб вирватися з ендосомальних бульбашок, що обумовлює більше дифузійне мічення зразку. Більш того, спостерігається ядерне накопичення. Після більш довгого періоду інкубації (6 годин), CF-мічений пептид був інкапсульованим у великих бульбашках (білі стрілки) та виводився з клітин. Фігура 5: Визначення іn vitro анти-апоптозної активності CPP та CPP-кон'югатів. Послідовність операцій та кількісне визначення фрагментації ДНК в (A) C2C12 клітинах, (B) первинних кардіоміоцитах, (C) H9c2 клітинах та (D) NG108-15 клітинах. Дані нормалізували до 100 % STS. Представлені дані є середніми значеннями ± SEM, з n5. Клітини висівали в 24лункові планшети та культивували протягом ночі. На наступний день, клітини інкубували тільки з STS або з STS+1 мкМ пептиду (в OptiMEM) (концентрація STS та час інкубування для кожних клітин представлено на фігурі). Після цього, розчини видаляли, замінювали на повне середовище та додатково інкубували протягом 40 годин. Після фази регенерації, клітини 3 UA 112420 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лізували та визначали фрагментацію ДНК відповідно до інструкцій виробника (набір для PLUS виявлення загибелі клітин ELISA -Roche Diagnostics). Фігура 6: Анти-апоптозна активність варіантів Tat-DAXXp послідовності на первинних кардіоміцитах. Як описано в підписі до фігури 5, різні аналоги DAXXp послідовності (дивись таблицю 2) були досліджені на анти-апоптозні властивості проти STS (набір для виявлення PLUS загибелі клітин ELISA -Roche Diagnostics). Жоден з аналогів не був здатним до захисту первинних кардіоміоцитів – факт, який підтверджує, що 16-мірний DAXXp має оптимальну довжину та послідовність щодо найбільш високого кардіозахисного ефекту. Фігура 7: Порівняння мишачого/щурячого DAXXp з DAXXp послідовністю людини на основі анти-апоптозної активності на C2C12 клітинах, первинних кардіоміоцитах та H9c2. Мишачу DAXXp послідовність, кон'юговану з Tat (Tat-mDAXXp – SEQ ID NO: 61), яка є ідентичною до щурячої DAXXp послідовності (дивись фігуру 1B), порівнювали з конструктом людини (TatDAXXp) на основі анти-апоптозних властивостей проти STS (набір для виявлення загибелі PLUS клітин ELISA -Roche Diagnostics). Використані C2C12 клітини та первинні кардіоміоцити були від мишей та H9c2 клітинами від щура. У всіх клітинах, спостерігали посилення антиапоптозного ефекту, використовуючи мишачу Tat-mDAXXp послідовність, обумовлене мишачими або щурячими типами клітин. Фігура 8: Визначення FADDp15 та його анти-апоптозного ефекту в кардіоміоцитах. (A) Протеїнові послідовності FADD розсікали в масивах пептиду, що перекриваються (пепскан; 15 мірні пептиди із зсувом на 3 амінокислоти) та аналізували, використовуючи блоттінг з ферментною міткою. Чорний прямокутник показує три найбільш яскраві плями з відповідними послідовністями епітопу, кількість плям та інтенсивності сигналів (BLU), наведені нижче. (B) Пептидна послідовність FADDp-11 (= FADDp15=SEQ ID NO: 9) була успішно укорочена за рахунок одного амінокислотного залишку на C-кінці, N-кінці, або як на C-кінці, так і на N-кінці, та проаналізована, використовуючи блоттинг з ферментною міткою. Плями, показані стрілкою, продемонстрували найбільш високі інтенсивності сигналів (BLU). Найкоротший FADD епітоп (9мірний з послідовністю KRKLERVQS (=FADDp=SEQ ID NO: 12)) відповідав плямі No. 24. Інкубаційні умови: His-мічена внутрішньоклітинна ділянка Fas рецептору [10 мкг/мл]; антитіла: анти-His-(мишачий) (Sigma H1029; 1:6000) / анти-мишачий-HRP (Calbiochem 401207; 1:2,000), період витримки: 1 хвилина. Фігура 9: Порівняння FADDp конструктів з Tat-DAXXp на основі анти-апоптозної активності на первинних кардіоміоцитах та на H9c2 клітинах. Кількісне визначення фрагментації ДНК на (A) первинних кардіоміцитах та (B) H9c2 клітинах. Дані були нормалізовані до 100 % STS. Представлені дані є середніми значеннями ± SEM, з n≥ 5. Клітини висівали в 24-лункові планшети та культивували протягом ночі. На наступний день, клітини інкубували тільки з STS або з STS+1 мкМ пептиду (в OptiMEM) (концентрація STS представлена на фігурі та час інкубування представлений на фігурі 5). Після цього, розчини видаляли, замінювали на повне середовище та додатково інкубували протягом 40 годин. Після фази регенерації, клітини лізували та визначали фрагментацію ДНК відповідно до інструкцій виробника (набір для PLUS виявлення загибелі клітин ELISA -Roche Diagnostics). Виявлено, що коротка Tat-FADDp послідовність є менш ефективною ніж Tat-DAXXp, а довша Tat-FADDp15 демонструвала однаковий (на H9c2) або підвищений анти-апоптозний ефект (на первинних кардіоміоцитах). Фігура 10: Порівняння самостійних Tat-DAXXp та Tat-FADDp15 та в комбінації на первинних кардіоміоцитах та на H9c2 клітинах. Знайдено, що інкубування як з 0,5 мкМ Tat-DAXXp, так і з 0,5 мкМ Tat-FADDp15 в результаті призводить до однакового або навіть більш високого антиапоптозного ефекту, коли порівнювали виключно з пептидом в кількості 1 мкМ. Більш того, інкубування з обома пептидами в кількості 1 мкМ призвели до найбільш високого захисту обох типів клітин, що наводить на думку, що комбінація Tat-DAXXp та Tat-FADDp15 могла б мати багатообіцяюче застосування. Фігура 11: Експериментальний протокол іn vivo. C57Bl6 миші піддавали хірургічному протоколу ішемічній реперфузії (IR) міокарду. Чорний стовпчик представляє собою період ішемії, на якому миші були представлені на огляд. Розмір інфаркту або визначення кількості мертвих клітин виконували в кінці оперативного втручання для кожного протоколу (позначено ↑). IR60': 40 хвилин ішемії, 60 хвилин реперфузії. IR24год.: 40 хвилин ішемії та 24 години реперфузії. Фігура 12: Кардіозахисні ефекти Tat-DAXXp (1 мг/кг - IV) на мишах, яких піддавали IR60'. Розмір інфаркту (у % від зони ризику) та міжнуклеосомну фрагментацію ДНК, визначену за допомогою ELISA, кількісно визначали у мишей, яких піддавали IR 60' та лікували Tat, Tat-DAXXp або Tat-scrDAXXp (1 мг/кг), а також DAXXp (10 мг/кг) (внутрішньовенна ін'єкція (IV) за 5 хвилин до реперфузії). Середні значення  SEM наносили графічно для (A): зона ризику/LV маса (лівого шлуночка), (B): Розмір інфаркту (у % від зони ризику) та (C): (співвідношення I/NI), яке 4 UA 112420 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідає співвідношенню розчинного нуклеосому в ішемічній частині в порівнянні з неішемічною частиною LV тканини. Статистичний аналіз виконували, використовуючи однофакторний дисперсійний аналіз ANOVA з післяекспериментальним тестом НьюманаКейлса для багаторазових порівнянь (програмне забезпечення – GraphPad Prism). P