Спосіб запліднення in vitro

Реферат: Винахід належить до галузі ембріології і медицини, а саме до гінекології і репродуктології, і може бути використаний в програмах екстракорпорального запліднення (ЕКЗ), переважно групи жінок з низьким овуляторним резервом та старшої вікової групи, і забезпечує підвищення якості ооцитів, зменшення кількості введених препаратів і їхнього негативного впливу для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій), можливість UA 101744 C2 (12) UA 101744 C2 отримання вагітності із власного генетичного матеріалу, не використовуючи донорські ооцити у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом. Відповідно до способу запліднення in vitro у людини попередньо проводять відбір незрілих ооцитів, вводять ооцити в умовах in vitro в композицію для культивування, культивують ооцити в композиції, запліднюють культивовані ооцити методом ICSI, культивують ембріони в композиції і проводять ембріотрансплантацію, причому фолікули відбирають трансвагінально під УЗконтролем при досягненні ними розміру 18-20 мм на 14-15-й день циклу, після попереднього введення тригерної дози хоріогонічного гонадотропіну, незрілі ооцити відбирають на стадії GV та/або М1, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування, яка містить щонайменше D-глюкозу, динатрієву сіль, гентаміцин, гліцин, кальцію лактат, L-аланін, Lаспарагінову кислоту, L-аспарагін моногідрат, L-глутамінову кислоту, L-глутамін, L-пролін, Lсерин, L-таурин, магнію сульфат, калію дигідроортофосфат, додають людський альбумін у кількості 10-20 мг/мл і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2 упродовж 24-40 годин. UA 101744 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до області ембріології і медицини, а саме до гінекології і репродуктології, і може бути використаний для генної терапії в молекулярній медицині в програмах екстракорпорального запліднення (ЕКЗ), переважно групи жінок з низьким овуляторним резервом та старшої вікової групи. Ембріональний розвиток - складний комплексний процес формування повноцінного організму із заплідненого ооцита. У передзародковий, доімплантаційний і постімплантаційний періоди ембріогенезу можливі порушення і/або зупинки розвитку. Зазвичай при лікуванні безпліддя методом екстракорпорального запліднення (ЕКЗ) із застосуванням стимуляторів суперовуляції (кломіфенцитрат, гонадотропіни) в результаті пункції фолікулів отримують досить значне число яйцеклітин - 5-10 і більше. Більшість з них зрілі, тобто готові до інсемінації (запліднення in vitro) і перебувають у преовуляторному стані, на стадії метафази II. Вони оточені по периферії кумулюсом, мають декілька рядів клітин гранульози, які прилягають до zona pellucida і орієнтовані радіально (corona radiata). У перивітеліновому просторі знаходиться 1-е полярне тільце, яке свідчить про завершення мейозу. Однак поряд із зрілими яйцеклітинами в аспіраті нерідко можна виявити і незрілі ооцити з нечітко вираженою або відсутньою corona radiata, оточені щільним, малооб'ємним кумулюсом. У випадку, коли в перивітеліновому просторі немає полярного тільця, а в цитоплазмі присутній термінальний везикул (GV), ооцити розцінюються як ті, що знаходяться на стадії профази І. У такому стані вони не здатні до запліднення in vitro та подальшого перетворення в ембріони, і зазвичай виключаються з роботи. У програмах лікування безплідності методами ДРТ дозрівання більшої кількості ооцитів індукують підвищеними дозами гонадотропних гормонів. Багато пацієнток мають порушення в ендокринній системі, страждають синдромом полікістозних яєчників. Ці фактори є причиною аномальної надекспресії в ході оогенезу деяких генів і зайвого нагромадження їх мРНК у цитоплазмі ооцита. За даними різних центрів ЕКЗ частота настання вагітності після застосування методу ЕКЗ перебуває в межах 20-40 %. Тому дуже актуальний пошук нових шляхів, які б привели до підвищення ефективності програм ДРТ. Один з напрямків для рішенням даної проблеми складається в поліпшенні якості ооцитів. З рівня медицини відомий спосіб запліднення in vitro (US 6641526, А 61 У 17/43, опублікований 04.11.2003), у якому при заплідненні, як допоміжна процедура для підвищення якості ооцитів, в ооцит за допомогою ін'єкцій уводять антизначеннєві екзогенні нуклеїнові кислоти в складі генетичних конструкцій, а потім проводять ембріотрансплантацію. Досягненню необхідного технічного результату в зазначеному винаході перешкоджає ушкодження мембрани ооцита в результаті проведення операції ін'єкції, що призводить до подальшого погіршення якості ооцита і ембріона. Крім того, введення в ооцит ін'єкцією антизначеннєвих екзогенних нуклеїнових кислот забезпечує тільки їх локальний і короткостроковий доступ у клітину, також введення екзогенних нуклеїнових кислот у складі генетичної конструкції може призвести до модифікації генома ембріона. Відомий також спосіб підвищення ефективності запліднення ооцитів (US 5693534, С12N 5/00, опубл. 02.12.1997), що включає відбір ооцита, введення його в композицію для культивування, культивування ооцита в композиції, запліднення культивованого ооцита сперматозоїдами, культивування ембріона в композиції і ембріотрансплантацію, при цьому застосовували композицію, що містить щонайменше 0,01 нг/мол активіну і щонайменше 0,01 нг/мол інгібіну, або застосовували композицію з додаванням пептидів, що містить щонайменше 0,01 нг/мол активіну і щонайменше 0,01 нг/мол інгібіну, тобто композиція включає тільки послідовності амінокислот. Найбільш близьким аналогом, прийнятим нами за прототип, є спосіб запліднення in vitro шляхом керування якістю ооцитів (патент РФ № 2281777, МПК А61K35/54 (2006.01), C12N5/08 (2006.01), А61Р43/00 (2006.01), опубл. 20.08.2006), згідно з яким попередньо проводять відбір і видалення незрілих ооцитів, розміщення щонайменше одного ооцита в культуральному середовищі і культивування, при цьому в культуральне середовище додають ефективну кількість щонайменше одного антизначеннєвого олігонуклеотиду довжиною 17-30 нк, кожний з яких комплементарний мРНК, щонайменше одного з наступних генів: генів індукторів апоптозу, таких як HRK, FAS, FASL, ВАХ, Caspasa-3, генів ростових факторів, таких як IGF1, генів рецепторів ростових факторів, таких як IGF1R, генів, регулюючих темпи дроблення ембріонів, таких як HLA-E, HLA-F, HLA-G генів клітинного стресу, таких як HSF1 і HSF2. Композиція для додавання в культуральне середовище включає один або більше антизначеннєвих олігонуклеотидів, описаних вище, і прийнятний розчинник. Перевага винаходу полягає в підвищенні якості і життєздатності ооцитів і підвищенні терапевтичної ефективності лікування безплідності. 1 UA 101744 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Недоліком описаного способу є недостатня якість отриманих ооцитів, а також недостатня терапевтична ефективність лікування безплідності, особливо у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом, в тому числі у жінок старшої вікової групи, що нерідко приводить до використання програм з донорськими ооцитами. Як показали наші дослідження, причинами цього є ряд порушень у більшості проблемних (неякісних) зрілих ооцитів М2, які негативно впливали на подальший розвиток ембріона: - цитоплазма ооцитів була поганої консистенції, мутнувата, гранульована, зустрічались гранульозні скупчення; - якісні характеристики цитоплазматичної мембрани були дуже низькі: погана еластичність, підвищена травматичність. Задача, на вирішення якої спрямований даний винахід, є створення способу підвищення якості ооцитів, зменшення кількості введених препаратів і їхнього негативного впливу для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій), можливість отримання вагітності із власного генетичного матеріалу, не використовуючи донорські ооцити у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом, в тому числі у жінок старшої вікової групи, відповідно зменшення кількості програм з донорськими ооцитами. Для вирішення цієї задачі у способі запліднення in vitro, згідно з яким попередньо проводять відбір незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, згідно з винаходом, відбирають незрілі ооцити на стадії GV і/або М1, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2, при найкращих варіантах реалізації пропонованого способу у композицію для культивування додають людський альбумін (Human Serum Albumin "SAGE Media") у кількості (10-20) мг/мл; після відбору незрілих ооцитів визначають консинстенцію цитоплазми та якісні характеристики цитоплазматичної мембрани; дорощування незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 здійснюють упродовж 24-40 годин; ооцити після культивування піддають кріоконсервації; використовують композицію для культивування, яка містить: D-глюкозу, динатрієву сіль, гентаміцин, гліцин, кальцію лактат, Lаланін, L-аспарагінову кислоту, L-аспарагін моногідрат, L-глутамінову кислоту, L-глутамін, Lпролін, L-серин, L-таурин, магнію сульфат, калію дигідроортофосфат; відбір ооцитів здійснюють трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні фолікулами розміру 18-20 мм на 14-15-й день циклу. В основу даного винаходу покладено той факт, що в результаті наших досліджень було встановлено, що дорощені в лабораторних умовах in vitro незрілі ооцити за основними якісними характеристиками не поступались зрілим яйцеклітинам, більш того, у випадках, коли ми отримували зрілі ооцити поганої якості, незрілі GV- і/або М1-яйцеклітини однієї і тієї ж самої пацієнтки, після дорощування були значно кращої якості (навіть у жінок старшого віку та з проблемами формування повноцінних ооцитів in vivo (в організмі жінки)). Оскільки у деяких пацієнток старшої вікової групи відмічається несинхронний ріст фолікулів під час стимуляції індукторами овуляції у програмах ДРТ, ввівши тригер овуляції на розмірі максимального фолікула 18-20 мм, ми мали змогу отримати ооцити різного ступеня зрілості (GV, Ml, M2). Причому, кількість GV-клітин іноді дорівнювала кількості зрілих ооцитів. Це і спонукало нас здійснювати дорощування незрілих ооцитів (GV і /або М1) до стадії М2; причому в результаті ми отримали візуально кращі клітини, ніж зрілі в момент пункції. Таким чином переваги пропонованого способу від способу по прототипу такі: 1. Використовуючи незрілі GV- і /або М1-ооцити ми отримуємо можливість вплинути на процес формування зрілого ооцита, що дасть нам змогу вносити певні якісні корективи в формування повноцінного зрілого ооцита М2. 2. Забір ооцитів на стадіях GV і /або М1 дозволяє зменшити кількість введених препаратів для стимулювання GV- і /або М1-яйцеклітин оскільки саме ці клітини менш чутливі до негативного впливу препаратів, які використовуються для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій). 3. За рахунок використання даного способу жінки старшого віку, з низьким оваріальним резервом та з прогностично поганими ооцитами, будуть мати змогу мати власних генетичних дітей, не використовуючи донорські ооцити. 4. Важливим є також те, що за рахунок використання пропонованого способу значно скоротиться кількість донорських програм, що є особливо важливим для країн Євросоюзу, де в більшості країн донація ооцитів заборонена, що є суттєвою проблемою для багатьох безплідних пар, яким рекомендована донація ооцитів. 2 UA 101744 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5. Додавання до культиваційних середовищ з незрілими ооцитами людського альбуміну (1020 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media") значною мірою покращує якість цитоплазми та цитоплазматичної мембрани ооцита, що в подальшому сприятиме утворенню ембріонів кращої якості. Заявлений спосіб підтверджується наступними прикладами його здійснення. Приклад 1. Пункцію фолікулів і відбір незрілих ооцитів на стадії GV і /або М1 серед загальної кількості яйцеклітин, більшість з яких перебуває на стадії М2 (стадія зрілого ооцита), здійснювали трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні фолікулами розміру 18-20 мм на 14-15-й день циклу, після введення тригерної дози хоріогонічного гонадотропіну (для остаточного дозрівання ооцитів) за допомогою голки для аспірації ооцитів 17G (K-OSN-1730-B90 "COOK") із застосуванням внутрішньовенного наркозу. Тиск в аспіраційній системі знижували до 7,5 кПа. Після відмивання ооцитів (в середовищі Flushing Medium "MediCult") та їх денудації здійснювали відбір незрілих ооцитів на стадіях GV та М1 серед загальної кількості яйцеклітин, більшість з яких перебувало на стадії М2 - стадії зрілого ооцита, після чого незрілі яйцеклітини (GV та М1) поміщали в композицію для культивування IVM ("MediCult", Данія) на 28-40 ч. Потім незрілі яйцеклітини, які досягли стадії М2 (зрілий ооцит), тобто ті, в яких з'явилось перше полярне тільце, запліднювали методом ICSI і через 16-20 год. оцінювали результати за фактом утворення зиготи (поява 2 пронуклеусів). З цієї стадії ембріони культивували в середовищі IVF ("MediCult") протягом 2 діб, після чого здійснювали ембріотрансплантацію(ембріотрансфер). Паралельно здійснювали підготовку ендометрія для його переходу в секреторну фазу; при недостатній динаміці наростання ендометрія чи відсутності структурних змін в ньому, починаючи з дня пункції, призначали препарати естрогенів ("Прогонова", "Дивігель"). Діагностику вагітності проводили шляхом визначення в сироватці крові ХГ через 12-16 днів після перенесення ембріонів, а потім через 1-2 тижнів з допомогою УЗД підтверджували факт її настання, нормальний розвиток ембріонів і встановлювали їх локалізацію в матці. Достовірно встановлено, що дозрівання незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 відбувається в 55-84 % випадках, запліднення в 67,9-90,7 %, отримання вагітності 23,3-38,5 %. Приклад 2. Умови конкретної реалізації способу аналогічні прикладу 1. Але у композицію для культивування з незрілими ооцитами додають людський альбумін (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media". Внаслідок реалізації пропонованого способу було помічено наступне: культивування незрілих ооцитів in vitro привело до ряду позитивних фенотипічних, морфологічних та біохімічних змін: відбулось покращення якості цитоплазми та цитоплазматичної мембрани ооцита; додавання до культиваційних середовищ з незрілими ооцитами людського альбуміну (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin "SAGE Media"), значною мірою покращує якісні характеристик як цитоплазми, так і цитоплазматичної мембрани ооцита, що в подальшому сприяє утворенню ембріонів кращої якості. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб запліднення in vitro у людини, згідно з яким попередньо проводять відбір незрілих ооцитів, вводять ооцити в умовах in vitro в композицію для культивування, культивують ооцити в композиції, запліднюють культивовані ооцити методом ICSI, культивують ембріони в композиції і проводять ембріотрансплантацію, який відрізняється тим, що фолікули відбирають трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні ними розміру 18-20 мм на 14-15-й день циклу, після попереднього введення тригерної дози хоріогонічного гонадотропіну, незрілі ооцити відбирають на стадії GV та/або М1, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування, яка містить щонайменше D-глюкозу, динатрієву сіль, гентаміцин, гліцин, кальцію лактат, Lаланін, L-аспарагінову кислоту, L-аспарагін моногідрат, L-глутамінову кислоту, L-глутамін, Lпролін, L-серин, L-таурин, магнію сульфат, калію дигідроортофосфат, додають людський альбумін у кількості 10-20 мг/мл і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2 упродовж 24-40 годин. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ооцити після культивування піддають кріоконсервації. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3