Спосіб запліднення in vitro

Реферат: Винахід стосується способу запліднення in vitro, згідно з яким відбирають ооцити в незрілому стані трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні ними розміру 10-13 мм на 8-12-й день циклу, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2. UA 99240 C2 (12) UA 99240 C2 UA 99240 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до області ембріології і медицини, а саме до гінекології і репродуктології і може бути використана для генної терапії в молекулярній медицині в програмах екстракорпорального запліднення (ЕКЗ), переважно групи жінок з низьким овуляторним резервом та старшої вікової групи. Ембріональний розвиток - складний комплексний процес формування повноцінного організму із заплідненого ооцита. У передзародковий, доімплантаційний і постімплантаційний періоди ембріогенеза можливі порушення і/або зупинки розвитку. Актуальність даного методу запліднення обумовлена обмеженнями, які виникають при лікуванні безпліддя подружніх пар класичним методом ЕКЗ (ЗІВ), а саме: - загроза виникнення синдрому гіперстимуляції яєчників при синдромі полікістозних яєчників і без нього, - сактосальпінкси великих розмірів, - недостатня відповідь яєчників на стимуляцію суперовуляції високими дозами гонадотропінів, - майбутнє лікування онкологічних захворювань, коли стимуляція протипоказана, обмежена або виникає необхідність збереження репродуктивного матеріалу для відстроченого досягнення вагітності у пацієнтки або сурогатної матері, - можливість зниження вартості отримання ооцитів в донорських програмах. У програмах лікування безплідності методами ДРТ дозрівання більшої кількості ооцитів індукують підвищеними дозами гонадотропних гормонів. Багато пацієнток мають порушення в ендокринній системі, страждають синдромом полікістозних яєчників. Ці фактори є причиною аномальної надекспресії в ході оогенезу деяких генів і зайвого нагромадження їх мРНК у цитоплазмі ооцита. За даними різних центрів ЕКЗ частота настання вагітності після застосування методу ЕКЗ перебуває в межах 20-40%. Тому дуже актуальний пошук нових шляхів, які б привели до підвищення ефективності програм ДРТ. Один з напрямків для рішенням даної проблеми складається в поліпшенні якості ооцитів. З рівня медицини відомий спосіб запліднення in vitro (US 6641526, А 61 У 17/43, опублікований 04.11.2003), згідно з яким при заплідненні як допоміжна процедура для підвищення якості ооцитів в ооцит за допомогою ін'єкцій уводять антисмислові екзогенні нуклеїнові кислоти в складі генетичних конструкцій, а потім проводять ембріотрансплантацію. Досягненню необхідного медичного результату в зазначеному винаході перешкоджає ушкодження мембрани ооцита в результаті проведення операції ін'єкції, що призводить до подальшого погіршення якості ооцита і ембріона. Крім того, введення в ооцит ін'єкцією антисмислових екзогенних нуклеїнових кислот забезпечує тільки їх локальний і короткостроковий доступ у клітину, також введення екзогенних нуклеїнових кислот у складі генетичної конструкції може призвести до модифікації генома ембріона. Відомий також спосіб підвищення ефективності запліднення ооцитів (US 5693534, С 12 N 5/00, опубл. 02.12.1997), що включає відбір ооцита, введення його в композицію для культивування, культивування ооцита в композиції, запліднення культивованого ооцита сперматозоїдами, культивування ембріона в композиції і ембріотрансплантацію, при цьому застосовували композицію, що містить щонайменше 0,01 нг/мол активіну і щонайменше 0,01 нг/мол інгибіну або застосовували композицію з додаванням пептидів, що містить щонайменше 0,01 нг/мол активіну і щонайменше 0,01 нг/мол інгибіну, тобто композиція включає тільки послідовності амінокислот. Найбільш близьким аналогом, прийнятим нами за прототип, є спосіб запліднення in vitro шляхом керування якістю ооцитів (патент РФ №2281777, МПК А61К 5/54 (2006.01), C12N 5/08 (2006.01), А61Р 43/00 (2006.01), опубл. 20.08.2006 ), згідно з яким попередньо проводять відбір і видалення незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, при цьому в культуральне середовище додають ефективну кількість щонайменше одного антисмислового олігонуклеотида довжиною 17-30 нк, кожний з яких комплементарний мРНК щонайменше одного з наступних генів: генів індукторів апоптоза, таких як HRK, FAS, FASL, ΒΑΧ, Caspasa-3, генів ростових факторів, таких як, IGF1, генів рецепторів ростових факторів, таких як IGF1R, генів регулюючих темпи дроблення ембріонів, таких як HLA-E, HLA-F, HLA-G генів клітинного стресу, таких як HSF1 і HSF2. Композиція для додавання в культуральне середовище включає один або більше антисмислових олігонуклеотидів, описаних вище, і прийнятний розчинник. Перевага винаходу полягає в підвищенні якості і життєздатності ооцитів і підвищенні терапевтичної ефективності лікування безплідності. 1 UA 99240 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Недоліком описаного способу є недостатня якість отриманих ооцитів, а також недостатня терапевтична ефективність лікування безплідності, особливо у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом, в тому числі у жінок старшої вікової групи, що нерідко призводить до використання програм з донорськими ооцитами. Як показали наші дослідження, причинами цього є ряд порушень у більшості проблемних (неякісних) зрілих ооцитів М2, які негативно впливали на подальший розвиток ембріона: - цитоплазма ооцитів була поганої консистенції, мутнувата, гранульована, зустрічались гранульозні скупчення; - якісні характеристики цитоплазматичної мембрани були дуже низькі: погана еластичність, підвищена травматичність. Задачею, на вирішення якого спрямований даний винахід, є підвищення якості ооцитів, зменшення кількості введених препаратів і їхнього негативного впливу для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій), можливість отримання вагітності із власного генетичного матеріалу не використовуючи донорські ооцити у жінок із синдромом виснажених яєчників та різко зниженим оваріальним резервом, в тому числі у жінок старшої вікової групи, відповідно зменшення кількості програм з донорськими ооцитами. Для вирішення цієї задачі у способі запліднення in vitro, згідно з яким попередньо проводять відбір незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, згідно винаходу відбирають всі ооцити в незрілому стані трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні ними розміру 10-13 мм на 8-12-й день циклу, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2, при найкращих варіантах реалізації пропонованого способу у композицію для культивування додають людський альбумін (Human Serum Albumin «SAGE Media») у кількості (10-20) мг/мл; після відбору незрілих ооцитів визначають консинстенцію цитоплазми та якісні характеристики цитоплазматичної мембрани; дорощування незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 здійснюють упродовж 24-40 годин; ооцити після культивування піддають кріоконсервації; використовують композицію для культивування, яка містить: D-глюкозу, динатрієву сіль, гентаміцин, гліцин, кальцію лактат, L-аланін, Lаспарагінову кислоту, L-аспарагін моногідрат, L-глутамінову кислоту, L-глутамін, L-пролін, Lсерин, L-таурин, магнію сульфат, калію дигідроортофосфат. Вибір конкретного варіанту реалізації пропонованого способу залежить від вихідного стану жінки та результатів медичного обстеження. В основу даного винаходу покладено той факт, що в результаті наших досліджень було встановлено, що дорощені в лабораторних умовах in vitro незрілі ооцити відібрані в ті терміни, коли зрілі ооцити ще не з'явились, за основними якісними характеристиками не поступались зрілим яйцеклітинам, більш того, у випадках, коли ми отримували зрілі ооцити поганої якості, незрілі GV і/або М1-яйцеклітини однієї і тієї ж самої пацієнтки, після дорощування були значно кращої якості (навіть у жінок старшого віку та з проблемами формування повноцінних ооцитів in vivo (в організмі жінки)). Таким чином переваги пропонованого способу від способу по прототипу такі: 1) Забір ооцитів на стадіях GV і /або М1 дозволяє зменшити кількість введених препаратів для стимулювання GV і /або М1-яйцеклітин, оскільки саме ці клітини менш чутливі до негативного впливу препаратів, які використовуються для стимулювання жінок в програмах ДРТ (допоміжних репродуктивних технологій). 2) Використовуючи незрілі GV і /або М1-ооцити ми отримуємо можливість вплинути на процес формування зрілого ооцита, що дасть нам змогу вносити певні якісні корективи в формування повноцінного зрілого ооцита М2. 3) За рахунок використання даного способу жінки старшого віку, з низьким оваріальним резервом та з прогностично поганими ооцитами будуть мати змогу мати власних генетичних дітей, не використовуючи донорські ооцити. 4) Важливим є також те, що за рахунок використання пропонованого способу значно скоротиться кількість донорських програм, що є особливо важливим для країн Євросоюзу, де в більшості країн донація ооцитів заборонена, що є суттєвою проблемою для багатьох безплідних пар, яким рекомендована донація ооцитів. 5) Додавання до культиваційних середовищ з незрілими ооцитами людського альбуміну (1020 мг/мл) (Human Serum Albumin «SAGE Media») в значній мірі покращує якість цитоплазми та цитоплазматичної мембрани ооцита, що в подальшому сприятиме утворенню ембріонів кращої якості. Заявлений спосіб підтверджується наступними прикладами його здійснення 2 UA 99240 C2 5 10 15 20 25 30 35 Приклад 1. Пункцію фолікулів і відбір незрілих ооцитів здійснювали трансвагінально під УЗконтролем, при досягненні ними розміру 10-13 мм на 8-12-й день циклу на стадії GV і /або М1, за допомогою голки для аспірації ооцитів 17G (K-OSN-1730-B-90 «COOK») із застосуванням внутрішньовенного наркозу. Тиск в аспіраційній системі знижували до 7,5 кПа. Прагнули уникнути ситуації з домінантним фолікулом діаметром 14 мм і більше, оскільки в таких випадках можна очікувати атрезію інших фолікулів і неповноцінність ооцитів в них. Після відмивання ооцитів (в середовищі Flushing Medium «MediCult») здійснювали їхнє дозрівання, для чого їх поміщали в композицію для культивування IVM («MediCult», Данія) на 28-40 ч. Потім яйцеклітини, які досягли стадії МІІ, що встановлювали після їх денудації по наявності 1-го полярного тільця, запліднювали методом ICSI і через 16-20 год. оцінювали результати за фактом утворення зиготи (поява 2 пронуклеусів). З цієї стадії ембріони культивували в середовищі IVF («MediCult») протягом 2 діб, після чого здійснювали ембріотрансплантацію. Ендометрій до моменту пункції фолікулів залишається на стадії проліферації і, як правило, за часом та морфологією відповідає лише її 9-12-го дням. Тобто він істотно відстає в досягненні преімплантаційного стану і з урахуванням відсутності найближчої перспективи секреторної трансформації достатньо далекий від виникнення в ньому умов необхідних для нідації. Для виходу з такого становища та забезпечення своєчасної підготовки слизової матки до імплантації перенесених ембріонів, що утворилися після дозрівання in vitro незрілих ооцитів на стадії GV і /або М1, слід призначати перорально естрадіол (прогінова) починаючи з дня пункції фолікулів, а з дня ICSI - прогестерон (утрожестан по 200 мг 3 рази на добу інтравагінально). Добова доза естрадіолу залежала від стану ендометрію, оцінюваного за допомогою УЗД. При його товщині 6 мм - 6 мг на добу. Така «замісна» терапія при настанні вагітності тривала 12-13 тиж. Діагностику вагітності проводили шляхом визначення в сироватці крові ХГ через 12-16 днів після перенесення ембріонів, а потім через 1-2 тижнів з допомогою УЗД підтверджували факт її настання, нормальний розвиток ембріонів і встановлювали їх локалізацію в матці. Достовірно встановлено, що дозрівання незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 відбувається в 55-84% випадках, запліднення в 67,9-90,7%, отримання вагітності 23,3 -38,5%. Приклад 2. Умови конкретної реалізації способу аналогічні прикладу 1. Але у композицію для культивування з незрілими ооцитами додають людський альбумін (10-20 мг/мл) (Human Serum Albumin «SAGE Media»). Внаслідок реалізації пропонованого способу було спостережено наступне: - культивування незрілих ооцитів in vitro призвело до ряду позитивних фенотипічних, морфологічних та біохімічних змін: відбулось покращення якості цитоплазми та цитоплазматичної мембрани ооцита. - додавання до культиваційних середовищ з незрілими ооцитами людського альбуміну (1020 мг/мл) (Human Serum Albumin «SAGE Media»), в значній мірі покращує якісні характеристик як цитоплазми, так і цитоплазматичної мембрани ооцита, що в подальшому сприяє утворенню ембріонів кращої якості. 40 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 50 55 1. Спосіб запліднення in vitro, згідно з яким попередньо проводять відбір незрілих ооцитів, введення ооцитів в умовах in vitro в композицію для культивування, культивування ооцитів в композиції, запліднення культивованих ооцитів методом ICSI, культивування ембріонів в композиції і ембріотрансплантацію, який відрізняється тим, що відбирають всі ооцити в незрілому стані трансвагінально під УЗ-контролем, при досягненні ними розміру 10-13 мм на 812-й день циклу, вводять їх в умовах in vitro в композицію для культивування і дорощують в процесі культивування до зрілої стадії М2. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що у композицію для культивування додають людський альбумін у кількості 10-20 мг/мл. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що після відбору незрілих ооцитів визначають консинстенцію цитоплазми та якісні характеристики цитоплазматичної мембрани. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що дорощування незрілих ооцитів до зрілої стадії М2 здійснюють упродовж 24-40 годин. 5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ооцити після культивування піддають кріоконсервації. 6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що використовують композицію для культивування, яка містить щонайменше: D-глюкозу, динатрієву сіль, гентаміцин, гліцин, кальцію лактат, L 3 UA 99240 C2 аланін, L-аспарагінову кислоту, L-аспарагін моногідрат, L-глутамінову кислоту, L-глутамін, Lпролін, L-серин, L-таурин, магнію сульфат, калію дигідроортофосфат. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4