Штам соматичних структур базидіомікоту schizophyllum commune fries sc-10 – продуцент з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів

Реферат: Штам соматичних структур базидіомікоту Schizophyllum commune Fries Sc-10 - продуцент з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів. UA 116596 U (54) ШТАМ СОМАТИЧНИХ СТРУКТУР БАЗИДІОМІКОТУ Schizophyllum commune Fries Sc-10 ПРОДУЦЕНТ З ПІДВИЩЕНИМ РІВНЕМ ІНДУКЦІЇ СИНТЕЗУ ПРОДУКТІВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕННЯ ЛІПІДІВ UA 116596 U UA 116596 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана в промисловому грибівництві, екології та деструкції певних органічних відходів галузей промисловості і сільського господарства. Дереворуйнівні базидіомікотові (ксилотрофи) мають потужні екзоферментні системи, за допомогою яких поза межами клітин відбувається ефективне розщеплення лігноцелюлозного комплексу і інших складних та здебільш хімічно стійких високомолекулярних органічних речовин. Крім ензимів, процес деструкції цих сполук залежить від генерації вільних, в т.ч. перекисних ліпідних, хімічно нестабільних радикалів шляхом запуску численних спонтанних ланцюгових реакцій [4, 9]. Ці реакції носять неспецифічний характер, тому є перспективним залучення базидіомікотових ксилотрофів до процесів розкладання органічних відходів промисловості та сільського господарства, біоремедіації забруднених такими відходами середовищ тощо [9, 10]. Розщепка звичайна (Schizophyllum commune) найпоширеніший вид грибів-ксилотрофів у світі, інтенсивно вивчаються його геном та перспективи практичного (в т.ч. медичного) використання [1, 8]. Виходячи з вищезазначеного, є актуальним скринінг штамів базидіомікотових ксилотрофів продуцентів з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в культурі, які ефективно нарощують біомасу і є стійкими до негативного впливу перекисних радикалів. Відомі результати порівняльного дослідження вмісту в грибах продуктів ПОЛ. Штами ксилотрофних базидіоміцетів культивують в глибинній культурі на глюкозо-пептонному середовищі. Надаються дані щодо вмісту продуктів ПОЛ в гомогенатах міцелію і ліпідах грибів різних систематичних, екологічних і фізіологічних груп. Не надаються дані з індукції синтезу продуктів ПОЛ [3]. Відомі штами Schizophyllum commune, залучені до експериментальних оригінальних досліджень співробітників Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України у співавторстві з вченими інших інститутів НАН України, Білорусі та університетів США, присвячених проблемі біології видів лікарських та їстівних макроміцетів [1]. Не надаються дані з індукції синтезу продуктів ПОЛ. Найбільш близьким є штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105 - продуцент екзогенних продуктів перекисного окиснення ліпідів [5]. Не досліджувалася індукція процесів ПОЛ, використовувався штам іншого виду базидіомікоту. В основу корисної моделі поставлено задачу отримання нового штаму соматичних структур базидіомікоту Schizophyllum commune Fries Sc-10, з високим вмістом продуктів ПОЛ в міцелії і культуральній рідині та здатністю активно реагувати на вплив індукторів, який, отже, є продуцентом з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів. Поставлена задача вирішується тим, що інтродукований штам Sc-10 базидіомікоту Schizophyllum commune Fries, згідно з корисною моделлю, є продуцентом з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів в міцелії і культуральній рідині при поверхневому періодичному культивуванні на глюкозо-пептонному середовищі при 27,5 °C протягом 12-ти діб. Штам Schizophyllum commune Fries Sc-10 отримано за загальноприйнятим методом виділення чистих культур з дикорослих плодових тіл [2]. Чисту міцеліальну культуру штаму Sc10 підтримують на агаризованому незахміленому пивному суслі (4° по Баллінгу) шляхом пересівів кожні 5-6 місяців [7]. Приклад конкретного виконання. Для вивчення динаміки росту і інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів, штам Sc-10 культивують поверхнево в колбах Ерленмеєра ємністю 250 мл на глюкозо-пептонному 3 живильному середовищі (ГПС, рН0 6,5±0,2) об'ємом 50 мл наступного складу, г/дм [5]: глюкоза 10,0; пептон 3,0; КН2РО4 0,6; К2НРО4 0,4; MgSO4•7H2O 0,5; СаСl2 0,05; ZnSO4•7H2O 0,001; 3 дистильована вода до 1 дм . 3 Інокулюмом (0,5±0,01 г/дм ) є 10-ти денна міцеліальна культура штаму Sc-10 на сусло-агарі. Термін культивування при 27,5 °C складає 12 діб. Параметри ферментації зумовлені 1 UA 116596 U 5 10 15 20 технологічною і економічною недоцільністю довгострокового культивування та тривалістю фази експоненціального росту штаму Sc-10. Матеріалами досліджень є гомогенізований міцелій (МГ) та культуральний фільтрат (КФ), які готують наступним чином. Міцелій при 5±1 °C відділяють від культуральної рідини шляхом фільтрування. Отриманий міцелій промивають дистильованою водою, підсушують на фільтрувальному папері, гомогенізують шляхом розтирання в охолодженій до 1±0,5 °C ступці. МГ використовують для приготування водної витяжки та визначення рівня самочинної і індукованої інтенсивності процесів ПОЛ. Залишок міцелію зважують у відкаліброваних бюксах і висушують при +105 °C до постійної маси для розрахунку його вологості і абсолютно сухої біомаси (АСБ) [6]. Для встановлення рівня самочинної інтенсивності процесів ПОЛ, до 1,5 мл водної витяжки міцелію або 0,5 мл КФ (контроль - дистильована вода) додають розчини трихлороцтової кислоти (ТХО) та тіобарбігурової кислоти (ТБК) до кінцевих концентрацій в реакційній суміші 3 0,61 та 0,37 моль/дм , відповідно. Суміш кип'ятять 15 хв. на водяній бані та швидко охолоджують до +20 °C; центрифугують 15 хв. при 1700 g. Для визначення рівня індукованої інтенсивності процесів ПОЛ, до вказаних об'ємів водної витяжки міцелію або КФ (контроль -2 3 -2 3 дистильована вода) додають 1•10 моль/дм розчин сірчанокислого заліза і 1•10 моль/дм аскорбінової кислоти. Інкубацію суміші при 40 °C проводять протягом 90 хв. Екстинкцію супернатанту дослідної проби вимірюють проти контрольної на спектрофотометрі при 532 нм і 590 нм. Розрахунок самочинної (Ас) та індукованої (Аi) інтенсивності ПОЛ міцелію або КФ здійснюють за формулою [6]: c i   25 30 532  590  106  V   , 156  105   , 6 де: Е532 і Е590 - показники екстинкції; 10 - фактор розмірностей; V - об'єм реакційної суміші 5 (мл); К - коефіцієнт перерахунку на АСБ міцелію; 1,56•10 - молярний коефіцієнт екстинкції; Р наважка сирого міцелію (г) або об'єм КФ (мл). Кількість продуктів ПОЛ, активних до ТБК (ТБКАП) виражали в нмоль/г АСБ або нмоль/мл КФ. Досліди проводять у трикратній повторності. Статистичну обробку експериментальних даних проводять з використанням Microsoft Excel та пакету програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Достовірною вважається різниця за рівня вірогідності Р>0,95 [6]. Таблиця Деякі ростові та біосинтетичні характеристики штаму Schizophyllum commune Sc-10 при культивуванні на ГПС Термін культивування, діб 9 12 35 40 45 АСБ, г/дм 2,25±0,05 3,49±0,13 3 Самочинна інтенсивність Індукована інтенсивність процесів ПОЛ процесів ПОЛ Міцелій, нмоль/ Міцелій, нмоль/ КФ, нмоль/ мл КФ, нмоль/ мл г АСБ г АСБ 61,95±1,09 7,33±0,11 130,70±3,48 10,50±1,01 92,05±2,95 10,07±1,04 281,07±5,13 15,08±1,20 Таким чином, запропонований штам Sc-10 базидіомікоту Schizophyllum commune Fries є продуцентом з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів і може бути використаний в промисловому грибівництві, екології та технологіях деструкції певних органічних відходів галузей промисловості і сільського господарства. Це може збільшити сферу використання цього виду базидіомікоту і асортимент продукції, здешевити екологічно чисте виробництво. Штам Schizophyllum commune Fries Sc-10 переданий та зберігається в Колекції культур шапинкових грибів (ІВК) Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, що має статус Національного надбання України [7]. Джерела інформації: 1. Биологические особенности лекарственных макромицетов в культуре: Сборник научных трудов в двух томах. / Под ред. чл.-кор. НАН Украины С.П. Вассера. - К.: Альтерпрес, 2011. 212 с. 2. Бисько Н.А. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / Н.А. Бисько, А.С. Бухало, С.П. Вассер и др. - К.: Наук, думка, 1988. - 144 с. 2 UA 116596 U 5 10 15 20 25 3. Капич А.Н. Определение антиоксидантной активности на модели перекисного окисления линолевой кислоты, инициированного грибной марганец пероксидазой / А.Н. Капич, Т.В. Корнейчик // Успехи медицинской микологии. - 2007. - Т. 9. - С. 162-164. 4. Капич А.Н. Сопряжение перекисного окисления липидов с деградацией лигнина у дереворазрушающих базидиомицетов / А.Н. Капич // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. - 2011. - Т. 3. - 316-335. 5. Пат. 76863 Україна, МПК C12N 1/00. Штам соматичних структур дереворуйнівного базидіоміцета Flammulina velutipes (Curtis) Singer F-1105 - продуцент екзопродуктів перекисного окиснення ліпідів / О.В. Чайка, О.В. Федотов. - № u201204305; заявл. 06.04.2012; опубл. 25.01.2013, бюл. № 2/2013 (найближчий аналог). 6. Федотов О.В. Інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів штамів грибів порядків Agaricales і Polyporales І О.В.Федотов // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія, екологія. - 2016. - 24(2). - С. 314-323. 7. Федотов О.В. Колекція культур шапинкових грибів - основа мікологічних досліджень та стратегії збереження біорізноманіття базидіоміцетів / О.В. Федотов, О.В. Чайка, Т.Є. Волошко, А.К. Велигодська // Вісник Донецького університету, Сер. А: Природничі науки. - 2012. - № 1. - С 209-213. 8. Chowdhary A. Schizophyllum commune as an emerging fungal pathogen: a review and report of two case s / A. Chowdhary, H.S. Randhawa, S.N. Gaur, K. Agarwal, S. Kathuria, P. Roy, C.H. Klaassen, J.F. Meis // Mycoses. - 2013. - Vol. 56. - P. 1-10. 9. Pozdnyakova N.N. Influence of PAHs on ligninolytic enzymes of the fungus Pleurotus ostreatus D1 / N.N. Pozdnyakova, S.V. Nikiforova, O.V. Turkovskaya // Cent. Eur. J. Biol. - 2010. - № 5 (1). - P. 83-94. 10. Winquist E. Production of lignin modifying enzymes on industrial waste material by solid-state cultivation of fungi / E. Winquist, U. Moilanen, A. Mettala, M. Leisola, A. Hattaka // Biochem. Eng. J. 2008. - 42. - P. 128-132. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Штам соматичних структур базидіомікоту Schizophyllum commune Fries Sc-10 - продуцент з підвищеним рівнем індукції синтезу продуктів перекисного окислення ліпідів. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3