Спосіб виготовлення біологічно-активної субстанції з чистотілу

Спосіб виготовлення біологічно-активної субстанції з чистотілу шляхом відварювання у воді висушеної трави, відцідження відвару, який відрізняється тим, що чистотіл відварюють у воді в співвідношенні 1:10 протягом 1 години, відціджений відвар піддають вакуумконденсаційному сушінню при 60°С до сухого залишку 20%-30% вологості. (19) (21) u200600948 (22) 02.02.2006 (24) 16.10.2006 (46) 16.10.2006, Бюл. №10, 2006р. (72) Россіхін Василь В'ячеславович, Богдан Микола Андрійович, Количєв Михайло Олександрович, Реуцький Микола Іванович (73) ХАРКІВСЬКА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ ОСВІТИ 3 нальної телячої сироватки, фірма "Sigma") вводили внутрішньом'язово мишам у задню лапку. На 7 добу після перевивання пухлини (появи пухлинного вузла) тварин розподілили на 3 групи, в кожній з яких було по 20 мишей (дві дослідні і одна контрольна). Мишам дослідних груп екстракт чистотілу вводили внутрішньочеревне в різних дозах; доцільність внутрішньочеревного введення обґрунтовувалася як нашими попередніми дослідженнями з використанням імуномодуляторів, так і даними літератури про те, що локальне введення препарату приводить до вираженого протипухлинного ефекту [Бережная Н.М., Горецкий Б.А. Интерлейкин-2 и злокачественные новообразования. Киев: Наук. думка, 1992, 174с.]. Оскільки в умовах справжньої моделі введення пухлинних кліток здійснювалося внутрішньом'язово в лапку стегна, то внутрішньочеревне введення уявлялося найдоцільнішим для даної моделі. Досліджувану дозу екстракту чистотілу розраховували, ґрунтуючись на даних літератури [Лікарські рослини. Енциклопедичний довідник. За ред. акад. АН УРСР А.М. Гродзинського, Київ, 1989], з розрахунку 1г на 1кг ваги. Оскільки середня вага мишей 20г, то нами були вибрані дві дози - 0,02г на 1 мишу - доза, що повністю відповідає вказаному розрахунку (1-а дослідна група мишей), і 0,03г - доза, що в півтора рази перевищує попередню (2-а дослідна група мишей). Відповідну кількість (дози) екстракту чистотілу розводили фізіологічним розчином і стерилізували. Екстракт чистотілу мишам вводили в об'ємі 0,2мл, кожний з яких містив або 0,02г, або 0,03г впродовж подальших 14 днів, починаючи з 7 дня після перевивання (появи пухлини). Упродовж усього терміну спостереження щодня вимірювали об'єм пухлини (довжина і ширина пухлинного вузла) і вираховували вагу пухлини за формулою [R.C. McKenzi, A. Oran, C. А. Dinarello, D. N. Sauder. IL-1 receptor antagonist inhibits subcutaneous melanoma В 16 growth in vivo // Anticancer Research 1996. -V.I 6. -№1. -P.437]: Вага (г) = довжина X (ширина)2/2. Під час експерименту вивчали особливості динаміки зростання і максимальну тривалість життя мишей у кожній досліджуваній групі і в контрольній. Результати досліджень. На 7 добу після перевивання пухлинних кліток вага пухлини мишей контрольної і дослідних груп була однаковою і складала 0,19+0,1гр. Починаючи з 11 доби після перевивання пухлинних кліток (5-й день уведення екстракту чистотілу), реєструються відмінності в зростанні пухлини мишей групи №1 у порівнянні з контрольною. Так, у групі № 1 вага пухлини була приблизно в 1,5 рази менша ніж у контрольній і складала 0,23+0,01м. Вага пухлини мишей у контрольній і в дослідній групі №2 (0,03г екстракту чистотілу) була однакова і складала 0,32+0,01г. На 14-ту добу після перевивання пухлини (8-й день уведення екстракту чистотілу) спостерігається гальмування в зростанні пухлини мишей груп №1 і №2, яке виявляється в зменшенні розміру пухлини в 1,5 рази порівняно з контрольною (вага пухлини в останній була 0,78+0,1г), і однаковим 17614 4 0,43+0,3г в групах №1 і №2). З 18-ї по 21-у добу (закінчення введення екстракту чистотілу) зберігаються ті ж відмінності в динаміці зростання пухлин мишей у контрольній і дослідних групах. На 23-тю добу спостерігається різке збільшення ваги пухлини мишей у групі №2, проте, не зважаючи на це, продовжують зберігатися відмінності в динаміці зростання пухлини мишей контрольної і дослідної групи №1 (вага пухлини мишей групи №1 приблизно в 2 рази менша, ніж у контрольних). На 25-ту добу спостерігається різке збільшення пухлини мишей групи №1, хоч і зберігаються відмінності в 1,5 рази у вазі пухлини в порівнянні з контрольною групою (2,8+0,2г і 4,0+0,18г відповідно). У групі мишей №2 пухлина досягає таких же розмірів, як і в контрольній (3,9+0,1г). На 28-му добу після введення пухлинних кліток мишам спостерігається гальмування швидкості росту пухлини мишей дослідних груп порівнянне з контрольною: у групі мишей №1 вага пухлини склала 3,66+0,3г, а в групі №2 - 4,64+0,2г; у контрольній - 7,73+0,3г. На 32-гу добу після перевивання спостерігається різке збільшення ваги пухлини в контрольній групі і незначне збільшення ваги пухлини в групі №2. Таким чином, вага пухлини мишей групи №1 була меншою в 2 рази порівняно з вагою пухлини мишей групи №2 і в 4 рази - порівняно з контрольною (3,58+0,2г, 6,67+0,2г, 14,2+0,25г відповідно). На 34-ту доби зберігаються ті ж закономірності динаміки зростання пухлини мишей контрольних і дослідних груп; максимальна тривалість життя мишей контрольної групи склала 35 діб. Протягом наступного тижня в динаміці зростання пухлини мишей дослідних груп істотних змін не спостерігалося, оскільки зростання пухлини було незначним. На 42-гу добу вага пухлини мишей групи №1 істотно не змінюється порівняно з попередніми термінами дослідження і складає 3,65+0,25м. Вага пухлини мишей групи №2 8,18+1,1г. Максимальна тривалість життя тварин групи №2 складала 45 діб, що на 10 діб перевищує тривалість життя мишей контрольної групи; це на 28% більше порівняно з контролем. На момент загибелі тварин групи №2 істотних відмінностей у вазі пухлини порівняно з контрольною групою не спостерігалося. Максимальна тривалість життя тварин групи №1 становила 55 діб, що на 20 діб перевищує тривалість життя мишей контрольної групи, це на 57,1% порівняно з контрольною групою. Необхідно підкреслити, що на відміну від ваги мишей групи №2 вага пухлини мишей групи №1 на момент загибелі тварин відрізнялася від такого в контрольних мишей (пухлини були в 1,5 рази менше). Таким чином, дослідження протипухлинної активності екстракту чистотілу в системі in vivo (модель перевивальної МХ-рабдоміосаркоми) показало, що введення екстракту чистотілу в дозі 0,02г на мишу (терапевтична доза) має перевагу перед дозою 0,03г на мишу, оскільки надає вираженого протипухлинного ефекту, який виявляється в зміні динаміки зростання (вага пухлини) і реальному збільшенні тривалості життя мишей. 5 2. Вивчення протипухлинного ефекту екстракту чистотілу in vitro. Вивчення протипухлинного ефекту екстракту чистотілу in vitro проводили в системі дифузійних камер із використанням пухлинних експлантантів та ізольованих пухлинних кліток при додаванні тих же доз екстракту чистотілу, що і в дослідах in vivo (0,02г і 0,03г). Отримання пухлинних біоптатів: з видаленої пухлини стерильно вирізували фрагменти тканини, позбавлені судин і вогнищ некрозу, подрібнювали їх ножицями до розміру не більше 0,2-0,3мм. Отримання ізольованих пухлинних кліток: з видаленої пухлини стерильно вирізували фрагменти тканини, позбавлені судин і вогнищ некрозу, подрібнювали їх ножицями до розміру не більше 0,2-0,3мм, і протягом 30-40хв. при 37°С культивували в 0,2% розчині трипсину в середовищі RPMI1640 (Sigma, USA), при постійному перемішуванні на магнітомішалці. Виділені клітки відмивали триразовим центрифугуванням при 425g в культуральному середовищі і підраховували в камері Горяєва при суправітальному забарвленні трипановим синім. Вивчення протипухлинної дії екстракту чистотілу: протипухлинну дію визначали за здатністю екстракту чистотілу пригнічувати пухлинне зростання й утворення сфероїдів пухлинними клітками. Сфероїди - упорядковані колонієподібні структури з ознаками спіральної орієнтації; їх можна розглядати як мікромодель пухлинного вузла, вони також відображають основні характеристики даних пухлин. Протипухлинну дію вивчали в дифузійних камерах: 2-3 біоптати або 1млн. пухлинних кліток поміщали в дифузійні камери, що складаються з 2 тефлонових кілець, на які наклеювалися за допомогою клею ВФ-6 мілліпорові фільтри діаметром 0,23мк ("Сінпор-8", Чехія). Дифузійні камери поміщали в 24-лункові планшети, в дослідні зразки додавали екстракт чистотілу в досліджуваних дозах, і культивували протягом 5 діб у середовищі RPMI 1640 (Sigma, USA) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки (Sigma, USA) при температурі 37°С і насиченні повітряного середовища 5% CO2. Препарати фіксували 1 годину в спиртформолі, зафарбовували 20хв. гематоксиліном Караччі, проводили через батарею спиртів висхідної концентрації (500, 700, 960, 1000), прояснювали в ксилолі. Препарати готували в краплі канадського бальзаму на предметному склі, вивчали за допомогою мікроскопа МБІ-6, об.20, 40, ок.10. Для диференційованого обліку особливостей зростання експлантантів пухлин та ізольованих пухлинних кліток була розроблена 9-бальна система оцінки, яка давала можливість детально охарактеризувати зростання пухлинних кліток у дифузійних камерах і подати дані в графічному зображенні: 1. Відсутність зростання. 2. Незначне зростання. 3. Початкові етапи пухлинного зростання; утворення моношару. 4. Поява моношару низької щільності. 5. Утворення моношару середньої щільності. 17614 6 6. Початкові етапи сфероїдоформування: конгломерати кліток. 7. Сфероїдоформування (1-2 сфероїди в полі зору). 8. Сфероїдоформування (3-5 сфероїдів у полі зору). 9. Сфероїдоформування (10-12 сфероїдів у полі зору). Система оцінки також включала 2 показники: А - деструкція пухлини; У - моношар низької щільності. Мікроскопічне вивчення фільтрів дифузійних камер, на які були поміщені біоптати пухлин мишей та ізольовані пухлинні клітки МХрабдоміосаркоми без додавання екстракту чистотілу (контроль) показало, що характерною особливістю зростання in vitro, в даному випадку є утворення моношару низької щільності і міграція пухлинних кліток. Додавання в середовище культивування екстракту чистотілу в дозі 0,02г приводить до значного гальмування пухлинного зростання, що виявляється у відсутності міграції кліток, в деяких випадках спостерігається деструкція пухлинних кліток. Додавання в середовище культивування екстракту чистотілу в дозі 0,03г також приводить до гальмування пухлинного зростання і міграції пухлинних кліток, проте деструкції в цьому випадку не спостерігалося. Порівняльна оцінка протипухлинного ефекту екстракту чистотілу в дозою 0,02г і 0,03г показала, що і в системі in vitro використання дози 0,02г також має переваги порівняно з дозою 0,03г у вияві протипухлинної дії. Таким чином, подані дані по вивченню впливу екстракту чистотілу in vitro в дифузійних камерах свідчать про те, що екстракт чистотілу володіє значною протипухлинною дією, яка виявляється в деструкції пухлинних кліток за відсутності будьякої здатності пухлинних кліток до міграції. У подальшому були проведені експериментальні дослідження, які характеризують безпечність потенційного лікарського засобу екстракту чистотілу, виробленого за нашим способом. Дослідження мали за мету вивчення небезпечності для експериментальних тварин досліджуваної речовини в умовах короткотривалої дії, тобто визначення гострої токсичності. Відповідно до мети експериментів були поставлені завдання: - визначити параметри гострої токсичності при трьох шляхах уведення речовини в організм лабораторних тварин; - отримати дані щодо клінічних проявів інтоксикації; - визначити видову та статеву чутливість експериментальних тварин щодо дії досліджуваної речовини. Експерименти виконані відповідно до методичних рекомендацій ["Експериментальне вивчення токсичної дії потенційних лікарських засобів"]. Досліди, проведені на білих нелінійних щурах, білих нелінійних мишах та морських свинках. Тварини знаходилися на стандартному раціоні віварію, який відповідає всім вимогам харчування для 7 всіх використаних видів. Кожна група складалася з 12 тварин обох статей. При розрахунку доз досліджуваний екстракт чистотілу приймали за 100% речовину. Концентрації розчинів підбирали з урахуванням максимальної кількості рідини, яку допускається вводити за один прийом при різних шляхах надходження в організм [Елизарова Ο.Η. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении. - М.: Медицина. 1971. - С.29]. Гостру токсичність для білих щурів вивчали при трьох шляхах введення: внутрішньошлунковому, внутрішньочеревинному, який забезпечує системну дію досліджуваної речовини, та ректальному, який передбачається для клінічного використання. Першій дослідній групі білих щурів (по 6 тварин кожної статі) масою 210-230г (самці) та 200210г (самиці) за допомогою металевого зонду одноразово вводили в шлунок 50%-й водний розчин досліджуваної речовини дозою 5000мг/кг, яка є максимальною дозою четвертого класу токсичності (малотоксичні речовини) для внутрішньошлункового введення [Експериментальне вивчення токсичної дії потенційних лікарських засобів: Методичні рекомендації. - Київ. 2000. - 43с.; Заугольников С.Д., Лойт Α.Ο., Иваницкий A.M. Токсиколого-гигиеническая классификация вредных веществ Принципи и методы установлення предельно допустимых концентрации вредных веществ в воздухе производственных помещений. - М.: Медицина, 1970. - С.76-83]. Контрольній групі тварин вводили дистильовану воду. Другій дослідній групі білих щурів (по 6 тварин кожної статі) масою 210-220г (самці) та 200-215г (самиці) вводили внутрішньочеревне 10% розчин екстракту чистотілу в максимальній дозі четвертого класу токсичності для внутрішньочеревного шляху введення [Експериментальне вивчення токсичної дії потенційних лікарських засобів: Методичні рекомендації. - Київ. 2000. - 43с.; Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парантеральных способах введення // Токсикология новых промышленных химических веществ. - М.: Медицина, 1973. - Вып. 13. -С.47-51] - 1000мг/кг. Контрольній групі тварин вводили фізіологічний розчин. Третій дослідній групі білих щурів (по 6 тварин кожної статі) масою 220-230г (самці) та 200-220г (самиці) проведене ректальне введення 40% водного розчину досліджуваної речовини в дозі 1000мг/кг. Контрольній групі тварин вводили дистильовану воду. Видова чутливість до досліджуваної речовини вивчали на білих мишах і на морських свинках. Групі білих мишей (по 6 тварин кожної статі) масою 24-28г (самці) та 24-26г (самиці) та групі морських свинок (по 6 тварин кожної статі) масою 270290г (самці) та 250-270г (самиці) вводили внутрішньошлунково екстракт чистотілу максимальною дозою четвертого класу токсичності - 5000мг/кг (20% водний розчин білим мишам і 50% водний розчин - морським свинкам). Контрольним групам тварин уводили дистильовану воду. Тривалість спостережень за станом тварин складала 14 днів. Масу тіла білих щурів визначали 17614 8 через 3, 7 та 14 діб після введення досліджуваної речовини, ректальну температуру один раз на день. Результати вимірів опрацьовували методами варіаційної статистики за допомогою ЕОМ [Программированная обработка результатов токсиколого-гигиенических экспериментов на микроЗВМ типа "Электроника БЗ-34": Методические рекомендации.-Киев, 1987. -22с.]. Внутрішньошлункове введения білим щурам 50% водного розчину екстракту чистотілу в дозою 5000мг/кг маси тіла до загибелі тварин не приводило. Клінічні прояви інтоксикації виражались у деякому пригніченні рухової активності та загальмованості тварин. Слід відмітити, що подібні симптоми спостерігалися при введенні контрольним білим щурам розчинника екстракту чистотілу - дистильованої води в тому ж об'ємі, що і досліджуваної речовини. Через 30-40 хвилин піддослідні та контрольні тварини не відрізнялися від інтактних. Систематична реєстрація показників стану кожної тварини протягом 14 діб не виявила клінічних проявів дії досліджуваної речовини, а також змін маси і температури тіла піддослідних тварин у порівнянні з контрольними. При внутрішньочеревному введенні білим щурам 10% розчину екстракту чистотілу в дозі 1000мг/кг маси тіла летальний кінець не спостерігався. Клініка інтоксикації проявлялася через 5-10 хвилин загальмованістю, зменшенням спонтанної рухової активності, ускладненням дихання, особливо вдиху повітря, уповільненням частоти дихання до 48-70 ударів за хвилину, постійним скороченням м'язів, які супроводжувалися стійким витягуванням задніх кінцівок. Тривалість порушень дихання спостерігалася на протязі 25-40 хвилин, тонічних судом - 4-4,5 години. Спостереження за тваринами протягом 14 діб не виявило клінічних проявів інтоксикації, змін маси та температури тіла. Ректальне введення білим щурам 40% водного розчину досліджуваної речовини дозою 1000мг/кг маси тіла до загибелі тварин не приводило. Клінічних ознак отруєння не помічено. Загальний стан і поведінка, маса та температура тіла дослідних тварин протягом 14 діб не відрізнялися від контрольних. При внутрішньошлунковому введенні 20% водного розчину екстракту чистотілу білим мишам в дозі 5000мг/кг маси тіла та 50% водного розчину досліджуваної речовини морським свинкам дозою 5000мг/кг маси тіла летальний кінець не спостерігався. Із клінічних симптомів виявлене короткочасне пригнічення рухової активності, що також відмічалося і в контрольних білих мишей та морських свинок, яким внутрішньошлунково вводили розчинник - дистильовану воду в тих же об'ємах, що і досліджуваної речовини. Протягом всього строку спостереження (14 діб) клінічних ознак інтоксикації не відмічалося, а інтегральні показники стану піддослідних тварин не відрізнялися від контрольних. У відповідності до мети та завдань роботи вивчена гостра токсичність потенційного лікарського засобу екстракту чистотілу на трьох видах лабораторних тварин (білих щурах, білих мишах та морських свинках) при трьох шляхах надходження в 9 17614 організм (внутрішньошлунковому, внутрішньочеревному та ректальному). Результати досліджень показали, що DL50 для білих щурів обох статей при внутрішньошлунковому шляху надходження складає більше 5000мг/кг. при внутрішньочеревному та ректальному шляхах надходження в організм - більше 1000мг/кг. Розрахована на основі даних про OЬ^o при надходженні в організм пероральним шляхом, DL50 при внутрішньовенному введенні склала більше 500мг/кг [Экспрессные методы определения токсичности и опасности химических веществ / Заугольников С.Д., Кочанов М.М., Лойт Α.Ο., Ставчанский И.И. Л.:, Медицина, 1978. - С.84]. DL50 для білих мишей обох статей та для морських свинок обох статей при внутрішньошлунковому шляху надходження складає більше 5000мг/кг. Клінічні прояви інтоксикації при внутрішньочеревному шляху надходження в організм білих щу Комп’ютерна верстка М. Ломалова 10 рів (ускладнення дихання та тонічні судоми) свідчать про те, що вірогідними мішенями впливу досліджуваної речовини є дихальний центр, ЦНС та нервово-м'язова система. Таким чином, проведені дослідження свідчать про те, що за класифікацією речовин за токсичністю [Експериментальне вивчення токсичної дії потенційних лікарських засобів: Методичні рекомендації. -Київ. 2000. - 43с.] екстракт чистотілу належить до малотоксичних речовин (IV клас токсичності) при одноразовому внутрішньошлунковому (для білих щурів, білих мишей та морських свинок) та внутрішньочеревному (для білих щурів) шляхах надходження в організм. Статева та видова чутливість до досліджуваної речовини не виражена. Таким чином запропонований спосіб виготовлення біологічно-активної субстанції з чистотілу є нетоксичним і ефективним засобом протипухлинної терапії. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601