Біотехнологічний спосіб одержання імуномодулюючого препарату

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, биотехнологии, а точнее к способам получения иммуномодулирующи х ве ществ из клеток микроорганизмов, и может быть использовано для производства медицинских и ветеринарных лекарственных препаратов. Проблема регуляции иммунного статуса организма с помощью биологически активных веществ привлекает последнее время пристальное внимание исследователей. В настоящее время количество иммуностимулирующи х средств, находящи хся на стадиях доклинических исследований и клинического тестирования достаточно велико, однако в терапевтическую практику на территории СНГ вошло лишь несколько препаратов (Лекарственные средства: Справ. - М., 1993). По химической структуре, способом получения, механизму действия и др угим параметрам, иммуномодуляторы представляют чрезвычайно разнородную группу, в которой большая доля принадлежит иммуномодулятору микробного происхождения. Давно известны способы получения иммуномодуляторов из грамотрицательных бактерий, компоненты клеточных стенок которых, в частности, липополисахариды обладают высокой иммуностимулирующей активностью, выражающейся в основном в способности тормозить рост опухолевых клеток. К сожалению, эти препараты проявляют также высокую токсичность, что сдерживает их применение в терапевтической практике, несмотря на высокую активность (Терапевтический архив. - 1990. - Т.62. - №12. - С.125 - 132). Стремление сохранить или повысить активность и одновременно снизить токсичность этих препаратов заставляет прибегать к сложным, многостадийным способам получения с использованием токсичных химических реагентов, сложного оборудования и методик очистки (Патент США №4094971, опубл. 13.06.78, №4152423, опубл. 01.05.79; Патент СССР №710503, опубл. 15.01.80). Очевидно, что выбор того или иного микроорганизма в качестве источника получения биологически активных компонентов, особенности состава и строения клеток продуцента определяют как технологию получения, так и свойства биопрепарата. Так, например, известен способ получения биологического иммуномодулирующего препарата с широким спектром действия, содержащий продукты лизиса Cl.phnemonia, E.coli. Лизис проводят с помощью гомологических бактериофагов (Заявка Франции №2550707, опубл. 22.02.85) Японской фирмой Chugai Hiyaki K.K. разработан способ получения препарата из Streptococcus pyogenes (а.з Японии №1 - 04017). После обработки суспензии клеток антибиотиком и инкубирования продукт дополнительно обрабатывается протеолитическими ферментами. Этой же фирмой заявлен способ получения иммуномодулирующего препарата из клеток Streptococcus eguisimilis с ослабленной способностью вызвать отрицательные побочные эффекты (Заявка Франции №2427099). Улучшение физиологических свойств достигается воздействием дезоксирибонуклеази и рибонуклеазы для расщепления нуклеиновых кислот и протеазы для гидролиза протеинов в соответствующи х условиях. Известны способы получения водорастворимых пептидогликанов, обладающих иммунной активностью из стрептококков, стрептомицетов, стафилококков с помощью специфических ферментов, лизирующи х клеточные стенки: микробной N-ацетилмурамидазы (а.з. Японии №61 - 6045, а.з. №62 - 41213), литическим ферментом SALF (а.з. Японии №61 - 1405). Дальнейшее выделение и очистка пептидогликановых фракций производится с помощью молекулярных сит и ионообменных смол. Перечисленные выше способы требуют применения малодоступных специфических ферментов, сложных схем очистки, что нежелательно для получения препаратов в промышленных условиях. Лактобациллы, в частности, штаммы лактобациллус булгарикус, давно привлекают внимание исследователей благотворным влиянием на организм млекопитающих. Противоопухолевое действие веществ, содержащихся в клеточных стенках эти х микроорганизмов, было открыто И.Г. Богдановым ("Пути и методы изыскания противоопухолевых антибиотиков", 1, 1959, с.108). Было показано, что фармакологическое действие обусловлено присутствием в лизатах гликопептидных фрагментов клеточной стенки и установлено их строение (FEBS Letters. V.57, №3, 1975, с.259 - 261). Более поздние исследования позволили прийти к заключению, что противоопухолевая активность объясняется наличием тетрасахаридных мурамидсодержащих гликопептидов (Биоорганическая химия. - 1987. - Т.13. - №3. - С.386 - 394). Аналоги этих соединений, полученных путем органического синтеза, не дают такого высокого эффекта, как природные. Это, очевидно, связано с наличием в природном препарате компонентов, синергически усиливающих действие гликолептидов. До последнего времени все способы и исследования биологически активного вещества проводились с использованием штамма Lactobacillus bulgaricus B-51, принадлежащего Болгарии. Так, описан способ получения иммуномодулятора из этого штамма, включающий ферментативный гидролиз трипсином, отделение клеточных стенок, обработку трихлоруксусной кислотой, гидролиз лизицимом, отделение полученного лизата и сублимационную сушку целевого продукта (Биотехнология. 1986. - №1. - С.101 - 109). Способ предполагает использование токсичной трихлоруксусной кислоты, что нежелательно для промышленного производства. Наиболее близким к заявленному является способ получения противоопухолевого вещества из штамма Lactobacillus bulgaricus B-51, описанный в патенте США №3762998, опубл. 02.10.63. Способ выбран в качестве прототипа. Способ включает обработку бактериальных клеток альбумином и пепсином или трипсином, экстракцию полученной массы фенолом, отделение активной субстанции с последующим выделением целевого продукта минеральной и органической кислотой при pH 1,5 - 4,0, или высаливанием, или осаждением посредством органического растворителя, смешивающегося с водой. В патенте описано несколько схем получения биологически активного вещества, но они либо требуют применения токсичных веществ (фенола), либо включают слишком много стадий. Это делает проблематичным использование указанного способа для промышленного производства. Задача, которую решают авторы предлагаемого способа, состоит в разработке промышленного способа получения нетоксичного иммуномодулирующего средства со стабильными свойствами и составом, широким спектром фармакологического действия при высокой активности без использования в технологии вредных веществ и сложных схем очистки. Поставленная задача решается тем, что в способе получения иммуномодулирующего средства путем культивирования микроорганизма Lactobacillus bulgaricus на питательной среде, содержащей источники азота, углерода фосфора в анаэробных условия х при температуре от 28 до 50°C с последующей обработкой полученных клеток биодеградирующими агентами и выделением целевого продукта, в качестве исходного микроорганизма используют штамм Lactobacillus bulgaricus-86 (деп. в кол, №ВКПМ-5788) биодеградацию клеток проводят концентрированным раствором едкого натрия при исходном нейтральном значении pH и температуре от 59 до 61°C, а затем раствором лизоцима с концентрацией 1,0мас.% при известных для этого фермента условиях. Общими с прототипом признаками являются: - использование микроорганизма Lactobacillus bulgaricus: - культивирование на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора в анаэробных условиях при температуре от 28 до 50°C; - обработка клеток биодеградирующими агентами: - выделение целевого продукта. Отличительными признаками являются: - использование нового штамма Lactobacillus bulgaricus-86; - проведение биодеградации концентрированным раствором едкого натрия при исходном нейтральном значении pH и температуре от 59 до 61°C; - последующая обработка раствором лизоцима с концентрацией 1,0мас.% при известных для этого фермента условиях. Вышеперечисленные и другие преимущества заявляемого способа будут видны из нижеприведенного описания. Для реализации способа используется новый штамм Lactobacillus bulgaricus-86, выделенный из ассоциативной культуры при получении биопрепаратов на Ладыжинском биофармацевтическом объединении "Энзим". Штамм депонирован в ВКПМ (ВНИИ-генетика) под номером ВПКИ-5788, 1991г. Штамм характеризуется следующими свойствами: Культурально-морфологические особенности штамма - штамм, выращенный при 40 ± 1°C в течение 18 24 часов на питательной среде MRS, образует однородную муть и слабый мелкодисперсный осадок; в полужидких средах - висячие каплеобразные колонии, в толще агара - белесые дисковидные колонии с неровными краями до 1мм в диаметре. На твердой агаризованной среде образуются колонии, полупрозрачные белесоватые, круглые с неровными краями и диаметром 1 - 3мм. Морфология клеток - клетки грамположительные, средней длины и толщины, края округлые палочки ровные, размер колеблется от 0,5 до 3 - 8мк, возможно расположение цепочками разной длины от 2 до 8 клеток, полисадовидно. Физиологические характеристики штамма факультативный анаэроб, неподвижный, каталазоотрицательный, нитраты в нитриты не восстанавливает, желатин не разжижает, слабо гидролизует желатин, не образует аммиака из аргинина. Молоко створаживает с образованием кислоты (1,27%). Молоко с лакмусом восстанавливает без образования газа, интенсивно восстанавливает молоко с метиленовой синью. На средах с повышенным содержанием хлористого натрия (>4%) и pH 9,6 не растет. Не выдерживает прогревания при 63°C в течение 30 минут. Слизь не образует. На средах с желчью растет, крахмал слабо гидролизует. В отношении сбраживания углеводов достаточно инертен. Так, сбраживанию подвергает только глюкозу, сахарозу. Не сбраживает арабинозу, мальтозу, дульцит, ксилозу, раффинозу, инозит, рибозу, адонит, маннит, имулин, целлобиозу, галактозу, эскулин, сорбозу, сорбит, рамнозу, амигдалин, трегалозу, маннозу, L-метилa-глюкозид, глицерин. Культивирование штамма осуществляют в анаэробных условиях при температуре 40 ± 10°C на сбалансированной питательной среде, содержащей: гидролизат казеина - 48 - 50,0% по NH2, гидролизат соевой муки - 20 - 25% по NH2, автолизат пекарских дрожжей - 15 - 20% по NH2, кукурузный экстракт - 7,5 ± 2,5 по NH2, а также соли: K2HPO2 - 0,2 - 0,5% MgO4×7H2 O - 0,02% MnO4 - 4H 2O - 0,005 и источник углеводов са хар - 0,6 - 0,8% После культивирования в течение 8 - 24 часов проводят сепарирование биомассы. Полученную биомассу промывают водой и суспендируют в воде. К суспензии клеток приливают раствор 20% NaOH. При исходном значении pH (7,0 ± 1) и температуре (60 ± 1)°C в течение 4-х часов проводят нейтрализацию осадка клеточного материала 14% раствором HCl до pH (6,0 ± 0,1) при перемешивании. После промывки и отделения клеточного материала проводят его лизис. Лизис осуществляется при pH 7,0 ± 1 (pH доводят HCl). Для исключения бактериального загрязнения в реакторе производят обработку толуолом и хлороформом. Нагревают до температуры 38 ± 1°C и добавляют 1% раствор лизоцима в концентрации 0,3 - 1,0% к исходной биомассе. Лизирование проводят в течение 2 - 10 часов при перемешивании и pH 6,7 - 7,8. Время окончания процесса лизирования определяют по изменению оптической плотности суспензии. Через 2 - 3 минуты после добавления раствора лизоцима отбирают пробу суспензии и измеряют оптическую плотность суспензии на спектрофотометре при длине волны 450нм и толщине поглощения слоя 1см. По истечении 2 - 10 часов с начала лизирования измеряют оптическую плотность (Дкон) суспензии (l = 450нм) рассчитывают степень гидролиза (K) по формуле Ä - Äêîí K = èñõ , Äèñõ при K = 0,55 - 0,60 лизирование клеток проведено практически полностью. Затем проводят отделение твердой фазы с помощью центрифугирования. Дальше можно проводить концентрирование раствора лизата на ротационном испарителе (t = 40 ± 1°C) проводят кислотную денатурацию белков, в концентрате лизата. После отделения выпавших белков осаждают препарат этиловым спиртом (соотношение объемов концентрата и спирта 1 : 5). Затем отделяют осадок препарата, промывают спиртом и перерастворяют в дистиллированной воде. Далее раствор передают на стадию сублимационной сушки. Операции разделения фаз, концентрирование можно проводить и другими известными способами. Полученный препарат представляет собой порошок белого или белого с желтым оттенком цвета, умеренно растворим в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Имеет стабильный состав, включающий мурамидсодержащие гликопептиды (20 - 40%), пептиды (15 - 30%), содержание нуклеотидов (от 0,1 до 1,0%) и биологическую активность по усилению фагоцитоза in vivo (не менее 20%). Именно такой биохимический состав обеспечивает спектр фармакологического действия, полученного в результате реализации этих свойств ве щества, что подтверждается данными экспериментов. По данным института Проблем онкологии и радиобиологии им. Кавецкого (ИПОР) АН Украины, препарат, полученный по вышеописанной технологии, малотоксичен, обладает иммуномодулирующими свойствами (малые дозы стимулируют клеточный и особенно гуморальный иммунитет, большие дозы могут его угнетать), а также выраженным противолучевым действием. Препарат обладает противоопухолевым и антиметастатическим влиянием, улучшает микроциркуляцию, стимулирует эндотелиальную систему, способствуе т ускорению регеративных процессов. Препарат вводили внутрибрюшинно, подкожно и перорально в широком диапазоне концентраций (от 1/10 до 1/75000 от LD50) при LD50 ± 7000мг/кг. Как стимулятор антителогенеза у мышей высокореагирующей линии СВА обладает способностью активировать синтез антител, не нарушая механизмов регуляции ответной реакции организма на гетерогены, а по силе имунностимулирующего эффекта не уступает общепризнанному коммерческому препарату - полному адъюванту Фрейнда. В больших дозах (1/10 и 1/100 от LD 50) обладает слабым противоопухолевым и антиметастатическим эффектом, но не угнетает роста лейкозных клеток. При комбинированном лечении на 20 - 30% усиливается противоопухолевое действие циклостатинов (циклофосфан и др.). При подкожных способах введения эффективность препарата увеличивается по сравнению с внутримышечным и уже введение дозы 1/1000 1/75000 от LD50 позволяет получать ощутимые иммуностимулирующие эффекты. Субстанция эффективна как в облученном, так и в интактном организме. По влиянию на клеточный иммунный ответ пероральное применение препарата не уступает парентеральному. Субстанция из лактобациллы, полученная по вышеописанной технологии с использованием нового штамма Lactobacillus bulgaricus-86 повышала микроциркуляцию, стимулировала эндотелиальную систему, способствовала регенеративным процессам (отчеты ИПОР за 1990 - 93гг. В экспериментах на животных использовали как субстанцию бластолена, так и его лекарственные формы бластофарма (5 и 10мл БАВ в 1 таблетке). Найденные при исследовании субстанции закономерности подтвердились и при использовании ГлС препарата. При разработке эффективных доз и схем введения был выбран оптимальный вариант, что позволило подготовить инструкцию по клиническому изучению бластолена. Одновременно с учетом эффективным доз и схемы введения проведен комплекс исследований по хронической токсичности и показана безвредность субстанции и ее лекарственных форм (инъекционной и таблетированной в объеме требований ФК Украины) Украинским институтом фармакологии и токсикологии. Промышленная применимость способа показана в примерах конкретного выполнения. Пример 1. Выращивание культуры Lactobacillus bulgaricus-86 осуществляли в опытно-промышленных условиях на ферменте Vнеом = 7,0м 3 с инокулятором Vгеом = 0,7м 3 на среде следующего состава: - гидролизат казеина - 48 - 50% по NH2 (120кг на операцию); - гидролизат соевой муки - 20 - 25% по NH 2 (60кг); - автолизат пекарских дрожжей - 15 - 20% по NH2 (200кг на 1 загрузку); - кукур узный экстракт - 7,5 ± 0,2 по NH2; - K2HPO4 - 0,2 - 0,5%; - MgSO 4×7H2O - 0,02%; -MnSO4×4H2 O - 0,005%; - сахар - 6 - 8% Гидролиз казеина осуществляют в реакторе с помощью фермента протеазы C из расчета 1500ед/г казеина в течение 10 - 12 часов при температуре 40°C и pH, равном 9,5 - 10,0. В аналогичных условиях гидролизуют соевую муку, только концентрация фермента составляет 3000ед/г соевой муки. Дрожжевой автолизат готовят из пекарских дрожжей путем суспендирования 200кг дрожжей с 200л воды и автолизе при температуре 48 - 50°C в течение 18 - 20 часов. Затем проводят смешивание всех компонентов и их стерилизацию в ферментере при температуре 126 - 128°C в течение 40 минут. После охлаждения среды до 40°C, производят засев инокулятора Vраб = 350л односуточной посевной культурой, выращенной на среде MRS (4,5л). Культивирование проводят в анаэробных условиях при температуре 40 ± 1°C. Корректировку pH в процессе роста культуры не проводят. Через 12 часов инокулят в асептических условиях пересевают в подготовленную питательную среду (3,5м. Рост культуры сопровождается закислением питательной среды, pH 3,8 - 4,2, накопление биомассы контролируют под микроскопом и путем измерения оптической плотности культуральной жидкости. Через 10 часов, при стабилизации роста культуры процесс культивирования прекращают путем охлаждения культуральной жидкости водопроводной водой до температуры 20°C. Затем проводят сепарирование биомассы на сепараторе Westfale (скорость подачи 200л/час). По окончании сепарации биомассу (16кг) с помощью специального приспособления извлекают из сепаратора, суспендируют в 500л стерильной умягченной воды и повторно сепарируют. Промытую влажную биомассу (12кг) порционно направляют далее на стадию щелочного гидролиза или на сублимационную сушк у. Берут 2кг промытой влажной биомассы (W = 75%) или 500 сухой сублимированной, добавляют 3л дистиллированной воды в бутылки (или 500 сублимированной и 5л дистиллированной). Суспензию перемешивают до (0,75г) гомогенного состояния 30 - 40 минут на мешалке, добавляют в суспензию при перемешивании раствора гидроокиси натрия (20%), устанавливают значение pH, равное 7,0. Затем в реактор добавляют 4л дистиллированной воды и доводят объем в реакторе до 9,0л. После того, как в реакторе установится температура, равная +60 ± 1°C, добавляют 1л натрия гидроокиси с массовой долей 20%. Гидролиз проводят в течение 4 - х часов при температуре суспензии, +60°C. По окончании процесса гидролиза суспензию охлаждают до +20°C водопроводной водой и центрифугируют при 12000об/мин. Супернатант передают на обезвреживание. Производят разборку сепаратора, а осадок ресуспендируют в бутылки и нейтрализуют раствором соляной кислоты с массовой долей 14% до pH 6,0 ± 0,1. После центрифугирования и промывки клеточного материала его суспендируют в 5л дистиллированной воды и доводят pH до значения 7,0 ± 1,0. Для исключения бактериального загрязнения в реактор вливают по 25мл хлороформа и толуола. После прогрева суспензии клеточного материала до (+38 ± 1)°C в реактор через загрузочный люк добавляют 150мл раствора лизоцима с массовой долей 1% (или 0,3% в пересчете на исходную сухую биомассу). Процесс лизирования ведут при постоянном перемешивании в течение 10 часов, контролируя pH и температуру. Время окончания процесса лизирования определяют по изменению оптической плотности (l = 450нм) при степени гидролиза (K) равном 0,55 - лизирование клеток проведено полностью. По окончании процесса лизиса суспензию центрифугируют при 2000об/мин. Супернатант собирают в бутыль и передают на стадию концентрирования. Концентрируют лизат при температуре +40°C под вакуумом с помощью роторного испарителя до 2л (степень концентрирования - 5 раз). Далее проводят кислотную денатурацию белков. При перемешивании добавляют раствор соляной кислоты до значения pH раствора, равного 3,0. Закисленный концентрат лизата центрифугируют при 10000об/мин. Прозрачный супернатант собирают в бутыль и подвергают нейтрализации (до pH, равного 7,0 ± 0,1). К 2л очи щенного концентрата лизата загружают 10л спирта этилового (соотношение объемов концентрата и спирта = 1 : 5). Спиртовую смесь выдерживают при комнатной температуре 12 часов до образования на дне бутылки плотного липкого осадка. Затем надосадочный спиртовый раствор сливают, а осадок промывают 1,0л этилового спирта. После промывки растворяют осадок в 2,0л дистиллированной воды. Раствор субстанции переливают в металлические поддоны толщиной слоя по 1см раствора в каждый поддон, замораживают в течение 6 часов при температуре -35°C. Сублимационную сушк у проводят на сублимационной сушилке ТГ-50. Высушенную субстанцию препарата фасуют по 5,0г в сухие стеклянные флаконы с притертой пробкой, пробки заливают горячим парафином. При изготовлении готовой лекарственной формы для инъекций готовят 630л раствора субстанции с полиглюкином (280г полиглюкина и 33г субстанции). После перемешивания компонентов проводят стерильную фильтрацию раствора и дозатором стерильно разливают во флаконы по 2мл. В каждом флаконе содержится по 2мг БАВ. Затем проводят сублимационную сушку препарата, после чего производят закупорку флаконов или запайку ампул. При изготовлении таблетированной формы используют в качестве основного наполнителя лактозу, кроме того в состав таблетки входит поливинилпирролидон, стеариновая кислота или карбоксиметилцеллюлоза. В 1 таблетке содержится 5 или 10мг БАВ. Таким образом, выход БАВ составил в 1 те хнологическом цикле 33г БАВ или 15000 инъекционных доз готовой лекарственной формы препарата. В пересчете на 1 опытно-промышленную (3,5м 3 питательной среды) ферментацию, выход БАВ составил 200г, что позволит изготовить 75000 лекарственных доз препарата, обладающего иммуномодулирующим, противолучевым и регенеративным действием. Препарат (субстанция), полученный по вышеописанной технологии обладает следующими физикохимическими свойствами: Субстанция - порошок белого цвета, умеренно растворим в воде и изотоническом растворе хлорида натрия. Влажность субстанции 4,5%. Имеет стабильный состав, включающий мурамидсодержащие гликопептиды (20,0%), пептиды (15,0%), нуклеотиды (0,05%) и обладающий биологической активностью по усилению фагоцитоза не менее 30%. Ампулированная субстанция сохраняет биологическую активность в течение 2 лет. Пример 2. Биомассу клеток штамма Lactobacillus bulgaricus-86 получали так, как в примере 1. 125,0г сухой промытой биомассы суспендировали в 1400мл стерильной дистиллированной воды, установили значение pH равным 7,0. Затем добавили 200мл 20% раствора NaOH и провели щелочной гидролиз при температуре +60°C в течение 4 - х часов. После этого провели нейтрализацию гидролизата 14% - м раствором HCl до pH, равного 6,0 и отцентрифугировали суспензию при 17000об/мин в течение 40мин. Супернатант в объеме 1100мл обезвреживали, а 110г осадка суспендировали в 1400мл дистиллированной воды. Затем после промывки осадок суспендировали в 1л дистиллированной, воды, затем добавляли 0,75л (0,6% в пересчете на исходную биомассу) лизоцима и при pH, равном 7,0, температуре ±38°C проводили гидролиз клеточных стенок в течение 3-х часов до K равной 0,60, процесс лизиса приостанавливали, отделяли лизат с помощью центрифугирования. Доводили pH супернатанта до 3,0 14% HCl, и отделяли выпавшие белки центрифугированием. Затем прозрачный супернатант подвергали нейтрализации и доводили pH до 7,0. Далее прозрачный раствор нейтрализованного лизата подвергали спиртоосаждению (аналогично способу, описанному в примере 1), перерастворяли в 500мл стерильной дистиллированной воды и передавали на сублимационную сушку. Получено 12,5г субстанции, что составило 10% от исходной биомассы. Показатели препарата: - порошок белого цвета, - растворим в воде, -влажность - 4,3%, - содержание мурамидсодержащих гликопептидов - 35%, - содержание пептидов - 26%, - количество нуклеотидов - 0,3%, - биологическая активность 40%. Пример 3. Биомассу штамма Lactobacillus bulgaricus-86 получали способом, описанным в примере 1. Весь ход те хнологического процесса, вплоть до лизиса лизоцимом тоже был аналогичным, кроме того, что использовали не 150мл 1% раствора, а 175мл, т.е. 0,15% к исходной биомассе. Через 10 часов K составил только 0,2, увеличение времени лизиса до 15 - 20 часов также не привело к достижению положительного результата, лизис клеточных стенок практически не шел (K - 0,25). Пример 4. Биомассу штамма LB-86 получали способом, описанным в примере 1. Весь ход технологического процесса получения БАВ был аналогичным описанному в примере 2. Для лизиса использовали 1,25г лизоцима. Оказалось, что в процессе лизирования клеточных стенок прошел практически за 2 часа. После сушки субстанции было получено 11г препарата (из 125г биомассы) при следующем качестве продукта: -влажность 4,5%, - содержание мурамидсодержащих гликопептидов 30%; - содержание пептидов 25%, - количество нуклеиновых кислот 0,8%. Пример 5. Биомассу штамма LB-86 получали способом, описанным в примере 1. Весь ход технологического процесса получения биологически активной субстанции был аналогичным примеру 2. На стадию лизиса взяли 1,5г лизоцима. Процесс лизиса клеточных стенок прошел практически за 1час, K = 0,75. После сушки субстанции было получено 7г препарата. По всем своим качественным показателям препарат соответствовал требованиям НТД, только по содержанию нуклеиновых кислот (их было 1,8%) препарат был некондиционным. Таким образом при использовании для стадии лизиса лизоцима в концентрации >0,3 - 1,0 удается получать продукт с регламентным выходом и качеством, соответствующим требованиям разработанной НТД (проект ВФС на субстанцию).