Спосіб вилучення контамінантів зі штамів маточних культур грибів-лінгоксилотрофів

Спосіб вилучення контамінантів зі штамів маточних культур грибів-лінгоксилотрофів, який включає приготування поживного сусло-агарового середовища; його стерилізацію; розлив поживного середовища в чашки Петрі; контроль суслоагарового середовища на стерильність; інокуляцію поживного середовища штамом базидіоміцетів, який заражений контамінантами; інкубацію середовища в термостаті; вилучення чистої колонії штаму маточної культури; пересівання U МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ 3 стерильність; - інокуляція поживного середовища штамом культури мікроорганізмів, який заражений контамінантами; - інкубація культури мікроорганізмів при температурі +26±0,5°С; - вилучення чистої колонії штаму маточної культури; - пересівання вилученої чистої колонії на нове поживне середовище. Недоліками способу є: необхідність виконання великої кількості пасажів музейних культур грибів базидіоміцетів, що послаблює силу штаму маточної культури гриба; неможливість отримання штамів маточних культур лінгоксилотрофів високого ступеня очищення від контамінантів, тому що м'ясо-пептонний агар, який є поживним середовищем, придатний і для життєдіяльності мікроорганізмів-контамінантів; крім того, спори контамінантів на поживному середовищі проростають не всі одночасно і можуть у подальшому обумовлювати зараження вже очищеного штаму вищих базидіальних грибів. Причинами, що перешкоджають досягненню результату, є: - придатність м'ясо-пептонного агару для росту бактеріальних мікроорганізмів контамінантів, які за 2-5 діб засвоюють усю поверхню середовища у чашці Петрі; - м'ясо-пептонний агар не є природним поживним середовищем для маточних культур грибів - лінгоксилотрофів, що обумовлює повільний ріст гіфів міцелію; - багаторазові пасажі (більше 5-10 раз) для отримання чистої культури послаблюють силу штаму маточної культури гриба. Відомий також спосіб вилучення контамінантів з музейних маточних культур базидіоміцетів [Дудка И.А., Вассер С.П., Бухало А.С. Промышленное культивирование съедобных базидиомицетов. - К.: Наукова думка, 1988. 350с.], який включає: приготування поживного сусло-агарового середовища, його стерилізацію в автоклаві, розлив поживного середовища в чашки Петрі, його контроль на стерильність, інокуляцію поживного середовища штамом культури грибів, який заражений контамінантами, інкубацію середовища у термостаті протягом - 2-3 діб при температурі +26±0,5°С, вибір найчистішої колонії необхідного базидіоміцета, та пересівання її на нове поживне стерильне середовище до тих пір, поки не буде отримана чиста культура штаму базидіоміцета, яку можна зберігати на скошеному сусло-агаровому середовищі в мікологічних пробірках. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - приготування поживного сусло-агарового середовища; - стерилізація сусло-агарового середовища в автоклаві; - розлив поживного середовища в чашки Петрі; - контроль сусло-агарового середовища на стерильність; 30419 4 - інокуляція поживного середовища штамом базидіоміцетів, який заражений контамінантами; - інкубація середовища в термостаті при температурі +26±0,5°С; - вилучення чистої колонії штаму маточної культури; - пересівання вилученої чистої колонії на нове поживне середовище. Недоліком способу є тривале за часом та без надійного ступеня чистоти вилучення музейних штамів лінгоксилотрофних базидіоміцетів від контамінантів. Причинами, що перешкоджають досягненню результату, є те, що: - сусло-агарове середовище не є природним поживним середовищем для грибівлінгоксилотрофів; - тривала частота пасажів (25-30 разів) на чашках Петрі підвищує вартість даного способу та послаблює силу штаму маточної культури гриба; - значне відставання росту гіфів міцелію грибів від росту колоній контамінантних бактеріальних мікроорганізмів пригнічує ріст грибів; - морфологічна схожість грибних колоній контамінантів та заданого штаму лінгоксилотрофів ускладнює відбір чистої колонії штаму гриба. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб вилучення контамінантів зі штамів маточних культур грибів-лінгоксилотрофів, який шляхом інокуляції стерильного гілочкового субстрату з дерев, які є природним субстратом для даного виду базидіального гриба, його інкубація з контамінованим штамом, вилучення чистої культури заданого штаму лінгоксилотрофа з ксилеми інокульованих гілочок, дозволяє відновити чистоту вихідного штаму грибів. Суттєвими ознаками запропонованого рішення є: - підготовка гілочкового субстрату з порід дерев, які є природним субстратом для даного виду гриба-лінгоксилотрофа; стерилізація гілочкового субстрату автоклавуванням; - інокуляція гілочкового субстрату штамом лінгоксилотрофного базидіоміцета, який заражений контамінантами; - його інкубація при температурі +26±0,5°С протягом 2,5-3 тижнів в умовах стерильного боксу; - відбір гілочкового субстрату, що найбільш засвоєний міцелієм гриба; стерилізація гілочкового субстрату дезінфікуючим розчином; - ополіскування стерильною дистильованою водою; - зняття з гілочок кори (флоеми); стерилізація обкорованої гілочки дезінфікуючим розчином; - отримання інокулюму з глибоких прошарків ксилеми; - інкубація інокулюму на сусло-агаровому середовищі у чашці Петрі при температурі +26±0,5°С протягом 6-7 діб; - перенесення колоній міцелію, які очищені від контамінантів, у мікологічні пробірки на скошений сусло-агар; 5 - культивування протягом 5-7 діб при температурі +26±0,5°С до заростання суслоагарового середовища поверхневим міцелієм. Відмінними від прототипу ознаками є: - підготовка гілочкового субстрату з порід дерев, які є природним субстратом для даного виду гриба-лінгоксилотрофа; стерилізація гілочкового субстрату автоклавуванням; інокуляція контамінованим штамом лінгоксилотрофного базидіоміцета гілочкового субстрату з порід дерев, які є природним субстратом для даного виду гриба; - його інкубація при температурі +26±0,5°С протягом 2,5-3 тижнів; - відбір гілочкового субстрату, що найбільш засвоєний міцелієм гриба; стерилізація гілочкового субстрату дезінфікуючим розчином; - ополіскування стерильною дистильованою водою; - зняття з гілочок кори (флоеми); стерилізація обкорованої гілочки дезінфікуючим розчином; - отримання інокулюму з глибоких прошарків ксилеми; - інкубація інокулюму на сусло-агаровому середовищі у чашці Петрі при температурі +26±0,5°С протягом 6-7 діб; - перенесення колоній міцелію, які очищені від контамінантів, у мікологічні пробірки на скошений сусло-агар; - культивування при температурі +26±0,5°С протягом 5-7 діб до заростання сусло-агару поверхневим міцелієм чистої культури базидіального гриба. Спосіб здійснюється таким чином. З деревини, яка є природним субстратом для даного штаму лінгоксилотрофа, нарізають гілочки 0,5-0,8мм у діаметрі та 6-8см в довжину. На гілочках повинна бути збережена непошкоджена кора (флоема). Гілочки зв'язують у пучки по 5-7шт. ниткою, поміщають у 0,5-літрові банки, на дно яких наливають прошарок у 1см дистильованої води. Банки обв'язують бавовняною тканиною і стерилізують в автоклаві при тиску 2±0,2атм. протягом 2±0,1 годин. Після охолодження банки перекривають в умовах боксу чашками Петрі, які попередньо були простерилізовані в автоклаві при тих же умовах. Гілочковий субстрат (у трьох повторах) інокулюють контамінованим штамом гриба. Потім інокульований гілочковий субстрат інкубують у термостаті при температурі +26±0,5°С протягом 2,5-3 тижнів, спостерігаючи за співвідношенням росту міцелію та контамінантів. Субстрат із повільним ростом міцелію, який обумовлений антибіозом контамінантів, вибраковують. З банок, де відбувся позитивний ріст міцелію гриба, відбирають найбільш опушені міцелієм гілочки. В умовах боксу гілочки стерилізують у дезінфікуючому розчині, знімають з них кору (флоему) та повторюють стерилізацію. Далі зрізають верхній прошарок ксилеми (деревини) і з глибоких прошарків зрізають пластинку з гіфами міцелію. Цей інокулюм 30419 6 поміщають у чашку Петрі з сусло-агаровим середовищем, інкубують при температурі +26±0,5°С протягом 6-7 діб. Чисті культури міцелію переносять у мікологічні пробірки на скошений сусло-агар, культивують при температурі +26±0,5°С до його заростання поверхневим міцелієм чистої культури базидіоміцета. Контамінація - це неконтрольоване заселення сторонньої мікрофлори у будь-яку чисту культуру евкаріотичних клітин або мікроорганізмів. Контамінація музейних колекційних маточних штамів супутньою зовнішньою мікрофлорою (бактерії, плісняві гриби) є досить поширеним явищем у мікологічних лабораторіях. Такі випадки трапляються при непередбачених порушеннях правил асептики та антисептики. Одним із головних прийомів вилучення контамінантів із забруднених музейних штамів грибівлінгоксилотрофів є їх генетична особливість живлення: наявність генів, які відповідають за синтез ферментів, що розщеплюють лігнін та целюлозу в структурній агрегації деревини відповідних видів дерев, на яких вони зустрічаються в природі та до яких вони філогенетичне адаптовані. Так, музейні штами грибів за правилами вирощують на суслоагаровому середовищі. На цьому середовищі також розвиваються і контамінанти, які живляться розчинними вуглеводами. Лінгоксилотрофи, наприклад, глива та шиїтаке, теж їх засвоюють. Але найприроднішим для них є живлення за рахунок розщеплення лігніну та целюлози відмерлої деревини відповідних видів листяних порід дерев. Бактерії та плісняві гриби не мають ферментів для розщеплення таких складних вуглеводів. Тому гілочковий субстрат із відповідних видів дерев є природним середовищем для міцелію лінгоксилотрофів і не придатним для контамінантів. Останні можуть дати лише початковий ріст назовні гілочок і у водному настої після стерилізації гілочок за рахунок невеликої кількості розчинних простих вуглеводів та їх полімерів типу крохмалю, камедей. Але середину гілочок - лінгоцелюлозу засвоювати контамінанти не зможуть. Тому вона залишається придатною для росту лише гіфів міцелію лінгоксилотрофів. До лінгоксилотрофних вищих базидіоміцетів, які використовують у культивуванні, відносять Гливу звичайну (Pleurotus ostreatus) та шиїтаке (Lentinus edodes). До кожного з них підбирають субстрат - вид деревини, який є для них природним середовищем. Так, на території України серед деревних порід для Гливи звичайної таким природним середовищем є відмерла деревина тополі, для шиїтаке - більш тверда порода - дуб. Тому запропонований спосіб дозволяє, враховуючи природні особливості живлення базидіоміцетів, проводити вилучення контамінантів зі штамів грибів-лінгоксилотрофів. Приклад конкретного виконання Проводили заготовку гілочок діаметром 0,50,8мм та довжиною 6-8см (для гливи - гілочки тополі, для шиїтаке - дуба). Обов'язковим правилом заготівлі гілочок була їх 7 30419 необкорованість, тобто обов'язкове збереження кори (флоеми). Гілочки збирали у пучки по 5-7шт., фіксували ниткою та поміщали в три 0,5-літрові банки для кожного штаму, на дно яких наливали прошарок дистильованої води 1см. Банки з гілочковим субстратом обв'язували бавовняною тканиною та стерилізували при 2атм. протягом 2 годин в автоклаві ВК-75. Одночасно в автоклаві стерилізували чашки Петрі. Після охолодження банки з гілочками в умовах боксу перекривали стерильними чашками Петрі та інокулювали відповідними сусло-агаровими контамінованими штамами міцелію біотехнологічних грибів: - для Гливи звичайної штаму НК-35 (ІБК-455) інокулювали гілочки тополі; - для шиїтаке штаму LTX-50 (ІБК-1534) гілочки дуба. Банки з гілочковим міцелієм витримували у термостаті при температурі +26±0,5°С протягом 2,5-3 тижнів. Реєстрацію співвідношення росту міцелію гриба, та контамінантів на гілочковому субстраті в кожній із банок проводили через 4 доби. Результати досліджень представлені в таблицях 1 і 2. Таблиця 1 Динаміка обростання гілочок тополі контамінованим міцелієм Гливи звичайної штаму НК-35 (ІБК-455) Доба 4 8 12 16 20 Динаміка обростання відмічено активний ріст міцелію по торцю гілок, а також між ними уся поверхня торців гілок заросла міцелієм, вниз міцелій проник на 2,5см; поява жовтих плям пліснявих грибів міцелій проник по гілочках на глибину 5,0см від поверхні; з'явились сірі плями пліснявих грибів на стінках банки; вода на дні банки стала каламутною (бактеріальний ріст) гілочки по довжині обросли повністю, але в середині пучка ще не відмічається паралельний ріст контамінантів щільність міцелію зросла і в середині гілок, але паралельно посилився ріст пліснявих грибів на стінках банки та гілочках, а також мікроорганізмів у воді на дні банки Таблиця 2 Динаміка обростання гілочок дуба контамінованим міцелієм шиїтаке штаму LTX-50 (ІБК-1534) Доба 4 8 12 Динаміка обростання початок росту сусло-агарового міцелію на торцях гілочок, росту контамінантів не виявлено поверхневе опушення гіфами міцелію посилилось, з'явились ознаки росту контамінантів (окремі сірі плями на стінках банки, вода стала каламутною) міцелій засвоїв поверхню торців гілок і проник на глибину 0,5см, крім сірих, 8 16 20 24 28 32 з'явились окремі рожеві плями міцелію пліснявих грибів, вода каламутна міцелій шиїтаке проник на глибину 2см гілочок, відмічається паралельний ріст контамінантів міцелій засвоїв гілочки на глибину в середньому 4,5см, відмічено також ріст міцелію в середині пучка, експансія контамінантів стабілізувалася на попередньому рівні (16 діб) щільність міцелію шиїтаке збільшується на поверхні та в середині пучків гілочок, але додалися також жовті плями плісняви, вода каламутна з неприємним запахом у глибину ріст міцелію на пучках гілочок зупинився на рівні 5-5,5см через розростання контамінантів; у середині пучків гілочок щільність міцелію поширилась характер росту міцелію візуально мало змінився, можливе засвоєння внутрішньої деревини гілочок, помітний паралельний ріст пліснявих грибів, з'явились плями із зеленуватим відтінком, посилився неприємний запах води Таким чином, ріст міцелію біотехнологічних грибів відбувався на всіх зразках гілочок. Але інтенсивнішим було засвоєння гілочок тополі міцелієм гливи. Його конкуренція з контамінантами також була більшою. Міцелій шиїтаке ріс повільніше, його конкурентна здатність до контамінантів значно поступалась міцелію гливи. Зазначені фізіологічні ознаки відповідають видовим характеристикам цих грибів. Крім того, інтенсивність засвоєння міцелієм деревини також залежить від її щільності та антибіотичних властивостей. Так, дуб щільніша порода деревини, ніж тополя, в екстрактах першого також знайдені дубильні та бактерицидні (антибіотичні) речовини. В умовах боксу гілочки стерилізували у 96°-му етиловому спирті та в 3%-му розчині перекису водню, знімали з них кору (флоему) та повторювали стерилізацію за тим же алгоритмом. Далі зрізали верхній прошарок ксилеми (деревини) і з глибоких прошарків отримували пластинку з гіфами міцелію. Одержання чистих культур з гілочкового міцелію проводили таким чином. Банки з повільним ростом міцелію за рахунок антибіозу контамінантів вибраковували. З інших банок, де відбувся позитивний ріст міцелію, в умовах боксу з кожної банки вибирали одну гілочку, найбільш опушену міцелієм і найменше вражену контамінантами. Так відібрали 3 гілочки тополі та 3 гілочки дуба. Кожну з шести відібраних гілочок поміщали у стерильну чашку Петрі і обробляли дезинфікуючими розчинами, для чого їх занурювали на 10-15 секунд у 96° етиловий спирт, потім - на 2-3 секунди у 3% розчин перекису водню. Далі гілочки ретельно промивали стерильною дистильованою водою і складали в нові стерильні чашки Петрі. Потім у відібраних гілочок відрізали до 1см з торцевих кінців, обкоровували, повторно проводили через стерилізуючі розчини у тому ж режимі (занурювали 9 на 10-15 секунд у 96° етиловий спирт, потім - на 23 секунди у 3% розчин перекису водню) й знову складали у нові стерильні чашки Петрі. Відрізання кінців, обкоровування (зняття кори) та обробка поверхні стерилізуючими розчинами обумовлена особливостями живлення контамінантів, міцеліїв гливи та шиїтаке. Так, контамінанти можуть засвоювати прості вуглеводи (розчинні сахари, крохмаль, камеді), які знаходяться на поверхні гілок, у водних розчинах. У середину гілок контамінанти не проникають, тому що у них відсутні ферменти, які розтинають складні вуглеводи типу лігніну і целюлози на відміну від міцелію гливи та шиїтаке. На цих особливостях засноване виділення інокулюмів, для цього стерильним скальпелем зрізали поверхневі шари гілочки з мертвою (від антисептиків) тканиною, а з її середини отримували шматочки деревини (інокулюми), кожний з яких розміщували у центрі чашки Петрі зі стерильним сусло-агаровим середовищем. Стерильне сусло-агарове середовище готували таким чином: в 1 літр водопровідної води вносили 17,5г сухого порошку м'ясо-пептонного агару промислового виробництва, ретельно перемішували, доводили до кипіння з періодичним помішуванням, витримували на вогні 5 хвилин, розливали його у термостійкі колби по 100мл у кожну, стерилізували їх в автоклаві ВК-75 роздрібним методом (три доби підряд при 0,5атм. протягом 20 хвилин). Після стерилізації середовища проводили їх мікробіологічний та мікологічний контроль, для чого по три проби (колби) сусло-агарового середовища інкубували в термостаті при температурі +26°С та при +37°С протягом 72 годин, при цьому основна частина приготовленого та проавтоклавованого середовища зберігалась у холодильнику. Після триденного культивування контрольних проб у термостаті при відсутності росту контамінантів основну партію сусло-агару підігрівали на водяній бані до +37°С і розливали по 25мл у стерильні чашки Петрі, які також ставили на контроль у термостат при температурі +26°С та при +37°С на 48 годин, після чого при відсутності росту контамінантів використовували для отримання культури міцелію. Чашки Петрі з інокулюмом інкубували при температурі +26°С протягом тижня. З кожної гілочки робили три повтори інокулюму. Колонії інокулюму без бактеріального росту та пліснявих грибів (атиповий ріст колоній) приймали за чисті культури вихідного штаму лінгоксилотрофних базидіальних грибів. Чисті культури міцелію гливи та шиїтаке переносили в пробірки на скошений сусло-агар, культивували при температурі +26°С до йогозаростання поверхневим міцелієм (5-7 діб). Таким чином були отримані очищені від контамінантів культури грибів-лінгоксилотрофів. Пробірки були промарковані як чисті культури гливи штаму НК-35 (ІБК-455) і шиїтаке LTX-50 (ІБК1534). Таким чином, запропонований спосіб дозволяє досягти заданого ступеня чистоти штамів базидіальних лінгоксилотрофних грибів природним 30419 10 для їх живлення шляхом життєздатності їх міцелію. без втрати