Спосіб отримання нетрансгенної культури ізольованих коренів тирличів (gentiana l.)

Спосіб отримання нетрансгенної культури ізольованих коренів тирличів (Gеntiana L.), що включає на першому етапі культивування експлантацію та вирощування кінчиків корінців (інокулюмів) рослин у живильному середовищі на основі Мурасіге-Скуга (МС) з половинним вмістом макроі мікросолей (МС/2), доповненому фітогормонами a-нафтилоцтовою кислотою (НОК) та 6бензиламінопурином (БАП) або НОК та кінетином (Кін), при такому співвідношенні інгредієнтів, мг/л: ІЗОЛЬОВАНИХ (13) 1 КУЛЬТУРИ 36436 НЕТРАНСГЕННОЇ (11) (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ (GENTIANA L.) в идається під в ідпов ідальність в ласника патенту UA ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС (19) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ 3 36436 4 етапі культивування корені з утвореними бічними отримання біомаси культури ізольованих коренів корінцями, які вирощують протягом 2-3 тижнів до тирличів. Корисна модель відноситься до галузі біотехнології і може бути застосована для отримання біомаси цінних рідкісних лікарських видів рослин роду Gentiana L., як вихідної сировини для фармацевтичної промисловості, а більш конкретно, до способу одержання нетрансгенної культури ізольованих коренів тирличів. Тирлич (Gentiana L.) - найбільший рід родини Gentianaceae Juss., який включає близько 400 видів. Його види є типовими альпійськими рослинами, більшість з яких зустрічається на висоті понад 1000м; у той час як деякі види зростають виключно на рівнинах. В Україні рід тирлич представлений 10 видами. Тирлич жовтий (Gentiana lutea L.), тирлич безстебловий (Gentiana acaulis L.) і тирлич крапчастий (Gentiana punctata L.) - рідкісні лікарські та декоративні рослини Українських Карпат, знаходяться під загрозою зникнення і занесені до Червоної книги України (1996). У рослинах цих та інших видів тирличів накопичуються важливі біологічно активні речовини: іридоїди, алкалоїди, ксантони, флавоноїди, фенолкарбонові кислоти тощо. Екстракти з кореневищ і коренів тирличів поліпшують функціональну діяльність травних органів, стимулюють секрецію шлункових залоз, здійснюють нормалізуючий вплив на метаболічні функції печінки, мають протизапальні, антисептичні та антигельмінтні властивості тощо [1]. Одним із основних способів забезпечення фармацевтичної промисловості рослинною сировиною є створення промислових плантацій. Однак, для тирличів, зокрема вище перелічених видів, такий підхід через біологічні особливості рослин (низька схожість насіння, пізній вступ у фазу цвітіння, вибагливість до умов зростання) є низько ефективним і економічно невигідним. У фармацевтичній промисловості для виробництва ліків використовують в основному кореневище та корені тирличів, приріст біомаси яких у природних умовах відбувається дуже повільно: для отримання кореневища масою 100-200г необхідно вирощувати рослини до 10-12 років. Альтернативою природного розмноження є отримання біомаси в культурі in vitro. Ізольовані корені здатні синтезувати біологічно активні речовини, характерні для коренів цілих рослин [2-3]. Вирощують культур у ізольованих коренів рослин як на агаризованому, так і в рідкому живильному середовищі. В останньому випадку скорочується цикл вирощування завдяки полегшеному доступу до клітин поживних речовин; вдається запобігти впливу компонентів, що містяться у агар-агарі, на ріст культури, окрім того з'являється можливість використання продуктів клітинного метаболізму, що виділяються у середовище [4]. Відомий спосіб отримання трансгенної культури ізольованих коренів тирличів шляхом трансформації Agrobacterium rhizogenes [3, 5, 6]. Недоліком цього способу є висока трудомісткість операцій отримання, вирощування і постійної селекції трансформантів, а також необхідність використання для цього дорогих реактивів та обладнання. Отримання нетрансгенної культури ізольованих коренів тирличів не проводилося. Аналогів до представленої роботи авторами не знайдено. В основу пропонованої корисної моделі поставлено завдання розробити такий спосіб отримання нетрансгенної культури ізольованих коренів тирличів (Gentiana L.), який би був менш трудомісткий і методично простіший, без використання генетичної трансформації. Зазначене завдання вирішується пропонованим способом вирощування нетрансгенної культури ізольованих коренів тирличів, який на першому етапі культивування включає експлантацію та вирощування кінчиків корінців (інокулюмів) рослин у живильному середовищі на основі Мурасіге-Скуга (МС) з половинним вмістом макро- і мікросолей (МС/2). доповненому фііоюрмонами aпафтилоцтовою кислотою (НОК) та 6бензиламінонурином (БАП) або НОК та кінетином (Кін), при такому співвідношенні інгредієнтів, мг/л: NH4NO3 820-830 КNО3 945-955 СаСІ2´2Н2O 215-225 MgSO4 ´7H2O 180-190 КН3РO4 80-90 KI 0,410-0,420 Н3ВО3 3,10-3,20 MnSO4 ´4H2O 11,0-11,2 ZnSO4´7H2 O 4,25-4,35 Na2MoO4 ´2H2O 0,120-0,130 CuSO4´5Н2O 0,0120-0,0130 CоSO4´6H2O 0,0120-0,0130 Na2EДТA´2K2O 18,60-18,70 FeSO4´7H2 O 13,85-13,95 Тіамін ПСІ (В1) 0,09-0,11 Піридоксин НСl (В6) 0,45-0,55 Нікотинова кислота (РР) 0,45-0,55 6-бензиламінопурин або кінетик 0,05-0,5 a-нафтилонтова кислота 0,1-2 Мезоінозит 90-110 Сахароза 30000 Вода до 1 л, у середовищі доводять рН до 5,5-5,7, розливають його по 50мл у колби об'ємом 250мл, живильне середовище автоклавують протягом 15 хвилин при тиску в одну атмосферу, о холоджують його до кімнатної температури, в одержане живильне середовище висаджують 6-8 інокулюмів довжиною 11,5см, які вирощують на шейкерах протягом 2-3 тижнів, потім на другому етані культивування готують живильне середовище МС/2, з якого вилучають фітогормони НОК і БАН або НОК і Кін (без фітогормональне середовище), при такому співвідношенні інгредієнтів, мг/л: NH4NO3 820-830 КNО3 945-955 СаСІ2х2Н2O 215-225 MgSO4 x7H2 O 180-190 5 36436 6 КН3РO4 80-90 дженими експлантами ставили на шейкери з цикKI 0,410-0,420 лом 50-60коливань/хв і вирощували протягом 2-3 Н3ВО3 3,10-3,20 тижнів без доступу світла при температурі MnSO4 x4H2 O 11,0-11,2 +24...26°С і відносній вологості повітря 70-80%. ZnSO4 x7H2O 4,25-4,35 Другим етапом вирощування за пропонованим Na2MoO4 x2H2O 0,120-0,130 способом було перенесення культивованих кореCuSO4x5Н2O 0,0120-0,0130 нів з утвореними бічними корінцями на живильне CоSO4x6H2O 0,0120-0,0130 середовище на основі МС72 без фітогормонів Na2EДТAx2K2 O 18,60-18,70 (НОК і БАП). FeSO4 x7H2O 13,85-13,95 У приготовленому живильному середовищі Тіамін ПСІ (В1) 0,09-0,11 доводили рН до 5,5-5,7. Середовище розливали у Піридоксин НСl (В6) 0,45-0,55 колби і стерилізували гарячою парою при 1атм. Нікотинова кислота (РР) 0,45-0,55 протягом 15хв. Мезоінозит 90-110 У колби з рідким живильним середовищем в Сахароза 30000 асептичних умовах поміщали отримані на першоВода до 1 л, му етапі культивування корені з утвореними бічу якому доводять рН до 5,5-5,7, розливають його ними корінцями тирличу жовтого. Колби ставили по 50мл у колби об’ємом 250мл, живильне серена шейкери з циклом 50-60 коливань/хв. Корені з довище автоклавують протягом 15 хвилин при утвореними бічними корінцями вирощували протятиску в одну атмосферу, о холоджують його до гом 2-3 тижнів без доступу світла при температурі кімнатної температури, в одержане живильне се+24...26°С і підносній вологості повітря 70-80%. редовище пересаджують отримані на першому Після першого етапу культивування визначали етапі культивування корені з утвореними бічними середню кількість утворених бічних корінців тирликорінцями, які вирощують протягом 2-3 тижнів до чу жовтого у розрахунку на висаджений інокулюм; отримання біомаси культури ізольованих коренів після першого та другої о етапів культивування тирличів. визначали середню довжину бічних корінців. Авторами експериментальне розроблено поСередня кількість утворених після першого слідовність етапів та операцій, що стосуються етапу бічних корінців у розрахунку на інокулюм способу двохетапного отримання нетрансгенної тирличу жовтого складала 98 шт. Середня довжикультури ізольованих коренів тирличів. на бічних корінців після першого етану культивуПриклад 1. Вирощували нетрансгенну культування становила 6,3мм, після другого етапу кульру ізольованих коренів тирличу жовтого. На пертивування - 30,8 (табл.). шому стані культивування використовували живиІнокулюми перед висадкою у живильне серельне середовище на основі МС/2 наступного довище та нарощену культур у ізольованих коренів складу, мг/л: після 4-6 тижнів (перший і другий етапи культивуNH4NO3 820-830 вання) зважували в асептичних умовах і визначаКNО3 945-955 ли її індекс росту за сирою масою. Цей показник СаСІ2´2Н2O 215-225 через 4-6 тижнів вирощування культури ізольоваMgSO4 ´7H2O 180-190 них коренів тирличу жовтого складав 926,5 (табл.). КН3РO4 80-90 Приклад 2. Вирощували нетрансгенну культуKI 0,410-0,420 ру ізольованих коренів тирличу крапчастого. На Н3ВО3 3,10-3,20 першому етапі культивування використовували живильне середовище на основі МС/2 наступного MnSO4 ´4H2O 11,0-11,2 складу, мг/л: ZnSO4´7H2 O 4,25-4,35 NH4NO3 820-830 Na2MoO4 ´2H2O 0,120-0,130 КNО3 945-955 CuSO4´5Н2O 0,0120-0,0130 СаСІ2´2Н2O 215-225 CоSO4´6H2O 0,0120-0,0130 MgSO4 ´7H2O 180-190 Na2EДТA´2K2O 18,60-18,70 КН3РO4 80-90 FeSO4´7H2 O 13,85-13,95 KI 0,410-0,420 Тіамін ПСІ (В1) 0,09-0,11 Н3ВО3 3,10-3,20 Піридоксин НСl (В6) 0,45-0,55 MnSO4 ´4H2O 11,0-11,2 Нікотинова кислота (РР) 0,45-0,55 ZnSO4´7H2 O 4,25-4,35 6-бензиламінопурин або кінетик 0,05-0,15 Na2MoO4 ´2H2O 0,120-0,130 a-нафтилонтова кислота 0,5-2 CuSO4´5Н2O 0,0120-0,0130 Мезоінозит 90-110 CоSO4´6H2O 0,0120-0,0130 Сахароза 30000 Вода до 1 л, Na2EДТA´2K2O 18,60-18,70 у приготовленому живильному середовищі довоFeSO4´7H2 O 13,85-13,95 дили рН до 5,5-5,7. Тіамін ПСІ (В1) 0,09-0,11 Середовище розливали по 50мл у колби і стеПіридоксин НСl (В6) 0,45-0,55 рилізували гарячою парою при 1атм. протягом Нікотинова кислота (РР) 0,45-0,55 15хв. 6-бензиламінопурин або кінетин 0,45-0,5 У колби з рідким живильним середовищем в a-нафтилонтова кислота 0,1-0,15 асептичних умовах поміщали по 6-8 інокулюмів Мезоінозит 90-110 тирличу жовтого довжиною 1-1,5см. Колби з висаСахароза 30000 7 36436 8 Вода до 1 л, CuSO4´5Н2O 0,0120-0,0130 у приготовленому живильному середовищі довоCоSO4´6H2O 0,0120-0,0130 дили рН до 5,5-5,7. Na2EДТA´2K2O 18,60-18,70 Середовище розливали по 50мл у колби і стеFeSO4´7H2 O 13,85-13,95 рилізували гарячою парою при 1атм. протягом Тіамін ПСІ (В1) 0,09-0,11 15хв. Піридоксин НСl (В6) 0,45-0,55 У колби з рідким живильним середовищем в Нікотинова кислота (РР) 0,45-0,55 асептичних умовах поміщали по 6-8 інокулюмів 6-бензиламінопурин або кінетин 0,05-0,15 тирличу крапчастого довжиною 1-1,5см. Колби з a-нафтилонтова кислота 0,4-0,6 висадженими експлантами ставили на шейкери з Мезоінозит 90-110 циклом 50-60коливань/хв і вирощували протягом Сахароза 30000 2-3 тижнів без доступу світла при температурі Вода до 1 л, +24...26°С і відносній вологості повітря 70-80%. у приготовленому живильному середовищі довоДругим етапом вирощування за пропонованим дили рН до 5,5-5,7. способом було перенесення культивованих кореСередовище розливали у колби і стерилізуванів з утвореними бічними корінцями на живильне ли гарячою парою при 1атм. протягом 15хв. середовище на основі МС/2 без фітогормонів У колби з рідким живильним середовищем в (НОК і БАП). асептичних умовах поміщали по 6-8 інокулюмів У приготовленому живильному середовищі тирличу безстеблового 1-1,5см. Колби з висаджедоводили рН до 5,5-5,7. Середовище розливали у ними експлантами ставили на шейкери з циклом колби і стерилізували гарячою парою при 1атм. 50-60коливань/хв і вирощували протягом 2-3 тижпротягом 15 хв. нів без доступу сві тла при температурі +24...26°С і У колби з рідким живильним середовищем в відносній вологості повітря 70-80%. асептичних умовах поміщали отримані на першоДругим етапом вирощування за пропонованим му етапі культивування корені з утвореними бічспособом було перенесення коренів з утвореними ними корінцями тирличу крапчастого. Колби стабічними корінцями на живильне середовище МС/2 вили на шейкери з циклом 50-60 коливань/хв. без фітогормонів (НОК і Кін). Корені з утвореними бічними корінцями вирощуУ приготовленому живильному середовищі вали протягом 2-3 тижнів без доступу світла при доводили рН до 5,5-5,7. Середовище розливали у температурі +24...26°С і відносній вологості повітколби і стерилізували гарячою парою при 1атм. ря 70-80%. протягом 15хв. Після першого етапу культивування визначали У колби і рідким живильним середовищем в середню кількість утворених бічних корінців тирлиасептичних умовах поміщали отримані на першочу крапчастого у розрахунку на висаджений інокуму етапі культивування корені з утвореними бічлюм; після першого та другого етапів культивуванними корінцями тирличу безстеблового. Колби ня визначали середню довжину бічних корінців. ставили на шейкери з циклом 50-60 коливань/хв. Середня кількість утворених після першого Корені з утвореними бічними корінцями вирощуетапу бічних корінців у розрахунку на інокулюм вали протягом 2-3 тижнів без доступу світла при тирличу крапчастого складала 63шт. Середня дотемпературі +24...26°С і відносній вологості повітвжина бічних корінців після першого етапу культиря 70-80% до отримання потрібної біомаси. вування тирличу крапчастого становила 4,1мм, Після першого етапу культивування визначали після другого етапу культивування - 21,3мм середню кількість утворених бічних корінців тирли(табл.). чу безстеблового у розрахунку на висаджений іноІнокулюми перед висадкою у живильне серекулюм; після першого та другого етапів культивудовище та нарощену культур у ізольованих коренів вання визначали середню довжину бічних корінців. після 4-6 тижнів (перший і другий етапи культивуСередня кількість утворених після першого вання) зважували в асептичних умовах і визначаетапу бічних корінців у розрахунку на інокулюм ли її індекс росту за сирою масою. Цей показник тирличу безстеблового складала 97. Середня дочерез 4-6 тижнів вирощування культури ізольовавжина бічних корінців після першого етапу культиних коренів тирличу крапчастого складав 308,3 вування становила 4,6мм; після другого етапу (табл.). культивування – 25,8мм (табл.). Приклад 3. Вирощували нетрансгенну культуІнокулюми перед висадкою у живильне сереру ізольованих коренів тирличу безсгеблового. На довище та нарощену культур у ізольованих коренів першому етапі культивування використовували після 4-6 тижнів (перший і другий етапи культивуживильне середовище на основі МС/2 наступного вання) зважували в асептичних умовах і визначаскладу, мг/л: ли її індекс росту за сирою масою. Цей показник NH4NO3 820-830 через 4-6 тижнів вирощування культури ізольоваКNО3 945-955 них коренів для тирличу безстеблового складав СаСІ2´2Н2O 215-225 410,7 (табл.). MgSO4 ´7H2O 180-190 Таким чином, запропонований спосіб двохетаКН3РO4 80-90 пного вирощування нетрансгенної культури ізоKI 0,410-0,420 льованих коренів тирличів у рідкому живильному Н3ВО3 3,10-3,20 середовищі дозволив: 1) отримати культуру ізоMnSO4 ´4H2O 11,0-11,2 льованих коренів без використання генетичної ZnSO4´7H2 O 4,25-4,35 транс4юрмації; 2) зменшити трудові та матеріальні затрати вирощування, а, отже, і собівартість біоNa2MoO4 ´2H2O 0,120-0,130 9 36436 10 маси, порівняно із трансгенними культурами ізоприклад, для тирличу жовтого, при початковій масі льованих коренів; 3) збільшити біомасу ізольоваексплантів 200-240мг, через 4-6 тижнів культивуних коренів тирличу жовтого через 4-6 тижнів вання отримати на 1л живильного середовища до культивування у 926 разів, тирличу крапчастого - у 225г біомаси коренів, що відповідає масі кореня 308 разів, тирличу безстеблового - у 410 разів. 10-12 річної рослини. При цьому запропонований спосіб дозволяє, наТаблиця Результати двохетапного вирощування нетрансгенної культури ізольованих коренів тирличів за прикладами 1-3 Вид Приклад 1 Приклад 2 Приклад 3 тирлич жовтий тирлич крапчастий тирлич безстебловий Середня кількість бічних корінців на інокулюмі, шт. Середня довжина бічних корінців, мм Вихід біомаси через 46 тижнів культивуванІндекс росту за ня у перерахунку на 1л сирою масою живильного середовища, г І етап II етап 98±6,6 6,3±0,44 30,8±2,86 926,56±84,36 225,4 63±4,1 4,1±0,38 21,3±1,74 308,34±28,32 67,8 97±7,3 4,6±0,35 25,8±0,23 410,7±38,36 98,6 Джерела інформації: 1. Страшнюк Н.М., Леськова О.М., Загричук Г.Я., Мельник В.М., Куна х В.А. Біологічно активні речовини видів роду Gentiana L. 1. Біосинтез та фізіологічна дія // Фітотерапія. Часопис. - 2006. №1. - С. 31-41. 2. Menkovic N., Sa vikin-Fodulovic К., Momcilovic I., Grubisic D. Quantitative determination of secoiridoid and gamma-pyrone compounds in Gentiana lutea cultured in vitro II Planta Med. - 2000. - Vol.66, №1 - P. 96-98. 3. Tiwari R.K., Trivedi M., Guang Z.C., Guo G.Q., Zheng G.-C. Genetic transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes: growth and production of secoiridoid glucoside Комп’ютерна в ерстка А. Крижанівський gentiopicroside in transformed hairy root cultures // Plant Cell Rep. - 2007. -Vol.26.-P. 199-210. 4. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - К.: Наукова думка, 1980. - 488 с. 5. Momcilovic I., Grubisic D., Kojic M., Neskovic M. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and plant regeneration of four Gentiana species // Plant Cell Tissue Organ Cult. 1997.-Vol.50, №1.-P. 1-6. 6. Hosokawa К., Ma tsuki R., Oikawa Y., Yamamura S. Genetic transformation of gentian using wild-type Agrobacterium rhizogenes II Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1997. - Vol.51. - P. 137-140. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601