Спосіб біосенсорної індикації цитотоксичних факторів біологічної і хімічної природи

Спосіб біосенсорної індикації цитотоксичних факторів біологічної і хімічної природи, який відрізняється тим, що додатково оцінюють дію на зміну фізіологічних параметрів Dunaliella viridis: фізіологічного розчину; біологічного чи хімічного чинника в присутності стандартної інактивованої сироватки та патологічної сироватки пацієнта; додатково оцінюють біохімічні характеристики екзометаболітів, які утворюються в результаті фізіологічної відповіді клітинного біосенсора D. viridis, за допомогою методів електрофорезу білкових фракцій в поліакриламідному гелі і на ацетатцелюлозі та за допомогою стандартних тестів на глікопротеїди та ліпідні фракції, а також проводять математичну обробку одержаних результатів і вираховують значення загального коефіцієнта цитотоксичності та відносного індексу цитотоксичності in vitro: сумарний коефіцієнт спонтанної цитотоксичності (Кcn) розраховують за формулою: 2 (19) 1 3 Корисна модель відноситься до біоіндикації і може бути використана для оцінки потенційної цитотоксичної дії хімічних речовин з біологічноактивною дією, скринінгу та біоіндикації фармакологічних препаратів, потенційно цитотоксичних метаболітів, що містяться в сироватці крові, скринінгу та моніторингу компонентів сироватки в лікуванні TORCH-інфекцій, індивідуального підбору лікарських препаратів у відповідності з наявністю цитотоксичних сироваткових компонентів. Існують невирішені питання в проблемі пошуку оптимальних інтегральних методів скринінгового і диференціального селективного визначення різноманітних за розміром і фізіологічною функцією сполук ендогенного та екзогенного походження в біологічних рідинах організму. У багатьох напрямках біології та медицини широко застосовуються різноманітні детекторні системи – біосенсори, що мають високу чутливість, специфічність, швидкість та потребують мікродози досліджуваного матеріалу. Як правило, біосенсорам такого роду властиво визначати будь-який один, або обмежену кількість, цитотоксичних компонентів спільного походження. Оскільки живий організм є динамічним і на тлі постійних змін характеру домінування різних метаболічних шляхів в сироватці крові, можуть превалювати, змінюючи один одного, ті чи інші цитотоксичні компоненти. Отже, важливо мати такий інструмент біоіндикації, який буде адекватно реагувати на цитотоксини і формувати реакцію відповіді на морфологічному та фізіологічному рівні відповідно до ступеню впливу. Особливо привабливою є можливість безперервного моніторингу метаболітів, що утворюються при різноманітних патологічних станах і супроводжуються масштабними цитолітичними процесами, появою в крові і міжклітинній рідині фрагментів клітинних мембран, конформаційно модифікованих білків, ДНК, глікопротеїнів зі зміненою структурою. Стандартні методи аналізу зазвичай дорогі і потребують багато часу. Тому залишається актуальною розробка методології біоіндикації низько- і високомолекулярних цитотоксичних факторів біологічної та хімічної природи. Розробка біосенсорних технологій є частиною сучасної біотехнології. В розвитку нових технологій в господарстві (харчова промисловість, сільське господарство), фармакології, екології використовують водорості [Пономаренко СП., Паршикова Т.В. Экспресс-оценка эффективности биологически активных веществ на тест-культурах водорослей //Альгология. - 2001. - №4. - с.495 -501; Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры. Основы и приложения. - М.: Мир, 1992. - 616с.]. Різноманітні властивості водоростей можна використовувати для застосування їх як клітинного біосенсору і високочутливої системи біоіндикації. Відомий спосіб визначення цитотоксичних сироваткових факторів, який описано в статті А.І. Божкова, Н.Г. Мензянової, О.М. Клімової «Использование водорослей в качестве клеточного биосенсора при оценке патологических состояний организма» [Матеріали конференції «Горизонты биофизики. От теории к практике - Пущино - 2003. 48134 4 - С.68-69]. Він включає внесення сироватки крові хворих в культуру клітин Dunaliella viridis та визначення змін форми клітин водорості після культивування. Описаний спосіб дає достатню вірогідність, але до його недоліків слід віднести те, що він не дозволяє кількісно оцінити напрямок змін сумарної цитотоксичності при комбінованих інфекціях під впливом конкретних лікарських засобів; впливу хімічних сполук (наприклад, консервантів, харчових барвників, мікотоксинів); моніторингу цитотоксичності сироватки крові в процесі лікування хворих. Відомий також спосіб визначення цитотоксичності лікарських засобів за патентом України №39323 U [G01N33/15, пр. 06.08.08, опубл. 25.02.09, №4]. Він включає визначення цитотоксичності лікарських засобів за допомогою клітинного біосенсору D. viridis, а саме оцінку морфологічних і функціональних змін водорості в присутності розчину лікарського препарату, що досліджується, а також розрахунок коефіцієнтів морфологічної, функціональної та загальної цитотоксичності. Зазначений спосіб дозволяє виявити потенційно негативний ефект препарату на біологічний об'єкт - клітинний біосенсор, але його недоліком є те, що не врахована завжди існуюча взаємодія фармакологічного препарату та компонентів сироватки, що забезпечують оптимальну в'язкість та осмотичність цього середовища за рахунок білкових та інших компонентів тобто результати дослідження не є достатньо достовірними, внаслідок чого може мати місце постійно виникаюча помилка. Найбільш близьким по суті і результату до способу, що заявляється, є процес визначення цитотоксичних сироваткових факторів (Процес діагностики і прогнозу клінічного перебігу патологічного процесу шляхом визначення цитотоксичних сироваткових факторів), який описано в роботі О.М. Клімової, А.І. Божкова, В.В. Бойко [Патент України №19128 U, A61B10/00, G 01N 33/49, пр. 24.02.2006, опубл. 15.12.2006, №12]. Він включає внесення у завісь синхронізованої культури D.viridis фіксованого об'єму сироватки крові хворого, оцінку зміни форми клітин водорості, наявність глікопротеїнової оболонки, утвореної у агрегатів. За відсотком клітин із втраченою рухливістю та зі зміненою формою проводять диференційну оцінку гострих деструктивних процесів, перехідних та стійких патологічних станів. Відомий процес дозволяє здійснювати вибіркове якісне та кількісне визначення цитотоксичних факторів сироватки крові, що характеризують різні форми і стадії патологічних станів - гострих деструктивних процесів, перехідних зворотних станів і стійких незворотних процесів - за типами реакції відповіді клітинного біосенсору, при збереженні високої вірогідності оцінки перебігу і прогнозу захворювання. Однак, описаний спосіб не дозволяє оцінити гетерогенність специфічних впливів досліджуваних чинників на відповідь біосенсору, що проявляється структурно-функціональними зміна 5 48134 ми клітин D. viridis, не враховували інтегральний вплив усієї сукупності сироваткових компонентів. В основу корисної моделі поставлено задачу створення удосконаленого способу біоіндикації, який дозволяє оцінити сумарну цитотоксичність біологічних чи хімічних чинників шляхом використання біосенсорної культуральної тест-системи D. viridis. Поставлена задача вирішується тим, що в процесі біосенсорної індикації цитотоксичних факторів біологічної і хімічної природи здійснюють сумісну інкубацію фіксованого об'єму завісі синхронізованої культури D. viridis та такого ж об'єму досліджуваного зразку розчину біологічного чи хімічного чинника. Оцінюють морфологічні зміни форму клітин водорості, наявність, кількість і розміри клітинних агрегатів, а також наявність глікопротеїнової оболонки, утвореної у агрегатів, оцінюють зміну розмірів клітин водорості, форму клітинних мікро- та макроагрегатів, наявність філаментів і включень та спонтанну рухливість клітин водорості (функціональні зміни). Згідно з корисною моделлю, додатково оцінюють дію на зміну фізіологічних параметрів D. viridis: фізіологічного розчину; біологічного чи хімічного чинника в присутності стандартної інактивованої сироватки та патологічної сироватки пацієнта. Додатково оцінюють біохімічні характеристики екзометаболітів, які утворюються в результаті фізіологічної відповіді клітинного біосенсору D. viridis, за допомогою методів електрофорезу білкових фракцій в поліакріламідному гелі і на ацетатцелюлозі та з допомогою стандартних тестів на глікопротеїди та ліпідні фракції, а також проводять математичну обробку одержаних результатів і вираховують значення загального коефіцієнту цитотоксичності та відносного індексу цитотоксичності in vitro. Сумарний коефіцієнт спонтанної цитотоксичності (Кcn) розраховують з урахуванням морфологічних і функціональних змін за формулою: Mк Фк Ак Кcn 3 (1) де Mк - відсоток клітин зі зміненою формою в контрольній тест-системі, Фк - відсоток клітин зі зміненими функціональними властивостями в контрольній тест-системі, Ак - відсоток агрегованих клітин в контрольній тест-системі. Коефіцієнт сироваткової цитотоксичності (К цc ) хворих з різними патологічними станами вираховують за формулою Mc Фс Ас Кцc Кcn 3 1 Кcn (2) де Mc - відсоток клітин зі зміненою формою в досліді, Фc - відсоток клітин зі зміненими функціональними властивостями в досліді, Ак - відсоток агрегованих клітин в досліді, Кcn - коефіцієнт спонтанної цитотоксичності. Коефіцієнт цитотоксичної дії різних чинників (Кч) в присутності сироватки крові in vitro розраховують за формулою 6 Кч Mч Фч 3 Ач Кcn 1 Кcn (3) де Мч - відсоток клітин зі зміненою формою в присутності сироватки сумісно з чинником, Фч відсоток клітин зі зміненими функціональними властивостями в присутності сироватки сумісно з чинником, А ч - відсоток агрегованих клітин в присутності сироватки сумісно з чинником, Кcn - коефіцієнт спонтанної цитотоксичності. Розраховують індекс цитотоксичності (І) до біологічного чи хімічного чинника за формулою Kч I Kц с (4) і якщо індекс чутливості клітинного біосенсору (І) до біологічного чи хімічного чинника перевищує 1,0, вважають вірогідною негативну дію біологічного чи хімічного чинника на організм людини, а якщо індекс чутливості рівний або менший 1,0, вважають можливим застосування того чи іншого біологічного чи хімічного чинника для організму людини. Оцінка дії на зміну фізіологічних параметрів D. viridis фізіологічного розчину дозволяє визначити спонтанну цитотоксичність і отримати контрольний зразок для подальшого порівняння з дослідними зразками. Оцінка дії на зміну фізіологічних параметрів D. viridis біологічного чи хімічного чинника в присутності стандартної інактивованої сироватки дозволяє визначити цитотоксичність зазначеного чинника для організму людини. Оцінка дії на зміну фізіологічних параметрів D. viridis біологічного чи хімічного чинника в присутності патологічної сироватки пацієнта дозволяє визначити індивідуальну реакцію пацієнта на зазначений чинник. Якщо як чинник обирають алерген, чи мікотоксин, чи харчову добавку (консервант, емульгатор, барвник), чи лікарський засіб, можливо оцінити їх вплив (позитивний чи негативний) на організм людини. При цьому, якщо як чинник обирають лікарський засіб, можливо здійснити його індивідуальний підбір для даного пацієнта. Розрахунок індексу цитотоксичності до біологічного чи хімічного чинника дозволяє кількісно оцінити зазначені впливи. Заявнику невідомо введення зазначених параметрів біологічної індикації цитотоксичних факторів біологічної і хімічної природи і є результатом власних досліджень авторів. Ці дослідження дозволяють проводити біологічну індикацію цитотоксичних метаболітів сироватки крові (ЦТМС), які утворюються і містяться у різних органах, в тому числі у судинному кровотоці у хворих з різними патологічними станами, які утворюються або нейтралізуються в тест-системі (НТС) in vitro під впливом різних лікарських сполук; сумарних цитотоксичних факторів, які є наслідком дії харчових потенційно токсичних речовин (емульгатори, барвники, консерванти); сумарних цитотоксичних компонентів сироватки крові у хворих з бактеріальною і вірусною мікст-інфекцією для моніторування 7 48134 ефективності лікування, дослідження посилення цитотоксичних ефектів або їх нівелювання. Суть корисної моделі ілюструється прикладом її конкретного застосування при дослідженні сироватки хворого на хламідіоз та підбору лікарського засобу для лікування даної інфекції. Комбіновані TORCH-інфекції потребують тривалого лікування різними комбінаціями антибіотиків, антисептиків та імуномодуляторів з наступною оцінкою ефективності проведеного лікування. В клінічній практиці як правило досліджують наявність антитіл до збудника за допомогою досить чутливого методу ІФА-діагностики, але на певних етапах неспецифічним методом верифікації. Разом з тим, виникають значні матеріальні затрати на виявлення антитіл до збудника чи антигену з допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Нами запропоновано метод сумарної оцінки наявності мікст-інфекцій (бактеріальної і вірусної) з допомогою живого біосенсору, що реагує на наявність будь-якої комбінації збудника зміною структурнофункціональних характеристик одноклітинного об'єкту. Спосіб реалізується в декілька етапів. На першому етапі готують синхронізовану завісь одноклітинної водорості з концентрацією 15∙106 клітин/1мл. В три лунки планшета вносять по 50мкл тест-системи, в першу додають 50мкл 0,9 розчину NaCl (для визначення коефіцієнту спонтанної цитотоксичності), в другу додають 50мкл сироватки крові пацієнта, хворого на хламідіоз, в третю лунку вносять 50мкл сироватки крові інфікованого пацієнта та 50мкл розчину амоксиклаву. Після 30хвилинної сумісної інкубації клітин D. viridis з 0,9 розчином NaCl в першій лунці підраховують відсоток клітин зі зміненими морфологічними, функціональними характеристиками та кількість агрегованих клітин, і за формулою (1) розраховують сумарний коефіцієнт спонтанної цитотоксичності (Кcn) : 13 10 20 14,3 , 3 Спонтанну цитотоксичність (Кcn) визначають з урахуванням суми морфологічних, функціональних порушень клітин біосенсору D. viridis та їх здатності утворювати мікро- та макроагрегати. Оскільки враховують три основні значущі параметри: морфологію, функціональну активність та здатність утворювати агрегати, то інтегральний коефіцієнт цитотоксичності розраховували як значення суми відсотків трьох значущих параметрів, поділивши на кількість показників. Другий зразок (вміст другої лунки, що містить сироватку хворого та клітинну тест-систему) оцінюють за морфологічними і функціональними характеристиками та наявністю агрегатів клітин D. viridis і за формулою (2) розраховують коефіцієнт цитотоксичності сироватки (К цc ) хворого на хлаКcn мідіоз: Кцc 18 6 41 1 14,3 3 14,3 0,51 , 8 Індуковану біологічними і хімічними чинниками цитотоксичність (К цc , К ч ) визначають враховуючи три основні значущі параметри: морфологію, функціональну активність та здатність утворювати агрегати і розраховували як значення суми відсотків трьох значущих параметрів, поділивши на кількість показників та з вирахуванням спонтанної цитотоксичності. Третій зразок (вміст третьої лунки, що містить сироватку хворого, клітинну тест-систему та терапевтичну дозу амоксиклаву) оцінюють за морфологічними і функціональними характеристиками та наявністю агрегатів клітин D.viridis і за формулою 3 розраховують коефіцієнт цитотоксичної дії амоксиклаву (Кч) в присутності сироватки крові пацієнта in vitro. 22 8 26 1 Кч 14,3 0,30 , 3 14,3 За формулою 4 розраховують індекс цитотоксичності (1) до біологічного чи хімічного чинника 0,30 I 0,59 . 0,51 Для інтегральної оцінки цитотоксичності розраховують індекс негативного впливу біологічних та хімічних факторів за співвідношенням коефіцієнту цитотоксичної дії чинників до коефіцієнту сироваткової цитотоксичності (К цc ) хворих з різними патологічними станами. Індекс чутливості клітинного біосенсору (I) до лікарського засобу становить 0,59, що нижче 1,0 отже, препарат для даного конкретного пацієнта не є токсичним і його можна застосовувати для лікування цьому конкретному пацієнту. Приклад 2. Особливе значення має біоіндикація порогової дози консервантів та інгібіторів росту бактерій та токсинів мікроскопічних грибів в м'ясній промисловості. Відомо, що при зберіганні м'ясної продукції можлива контамінація грибами роду Aspergillus, що продукують небезпечний афлотоксин. Актуальним є використання ефективних скринінгових тест-систем для якісного та кількісного аналізу наявності афлотоксину в продукції м'ясної промисловості. Для цього ми вивчали реакцію клітин біосенсору на різні концентрації афлотоксину. Спосіб реалізується в декілька етапів. На першому етапі готують синхронізовану завісь одноклітинної водорості з концентрацією 15∙106 клітин/1мл. В три лунки планшета вносять по 50мкл тест-системи, в першу додають 50мкл 0,9 розчину NaCl (для визначення коефіцієнту спонтанної цитотоксичності), в другу додають 50мкл контрольної інактивованої сироватки крові (для визначення цитотоксичності сироватки), в третю лунку вносять 50мкл інактивованої сироватки крові та 50мкл розчину афлотоксину з концентрацією 2∙103 мкг/мл (для визначення цитотоксичності афлотоксину). Після 30-хвилинної сумісної інкубації клітин D. viridis з 0,9 розчином NaCl в першій лунці підраховують відсоток клітин зі зміненими морфологічними, функціональними характеристиками та кількість агрегованих клітин, і за формулою (1) 9 48134 розраховують сумарний коефіцієнт спонтанної цитотоксичності (Кcn) : 3 6 0 3, 3 Другий зразок (вміст другої лунки, що містить клітинну тест-систему та контрольну інактивовану сироватку) оцінюють за морфологічними і функціональними характеристиками та наявністю агрегатів клітин D. viridis і за формулою (2) розраховують коефіцієнт цитотоксичності сироватки (К цc ) Кcn 4 11 0 1 3 0,66 , 3 3 Третій зразок (вміст третьої лунки, що містить клітинну тест-систему, контрольну інактивовану сироватку та розчин алергену) оцінюють за морфологічними і функціональними характеристиками та наявністю агрегатів клітин D. viridis і за формулою 3 розраховують коефіцієнт цитотоксичної дії алергену (Кч) в присутності контрольної сироватки крові in vitro. Кцc Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 10 10 33 2 1 3 4, 3 3 За формулою 4 розраховують індекс цитотоксичності (і) алергену: 4,0 I6,1 . 0,66 Індекс цитотоксичності становить 6,1, що значно перевищує 1,0, і вказує на високу токсичність афлотоксину в дослідженій концентрації для організму людини. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє виявити не лише перебіг патологічного стану, а й кількісно оцінити посилення або зниження цитотоксичності під впливом екзогенних біологічних і хімічних речовин. Даний спосіб дозволяє проводити біоіндикацію цитотоксичних компонентів сироватки крові, лікарських засобів, алергенів, мікотоксинів, харчових консервантів та барвників in vitro для наступної екстраполяції на організм in vivo, для чого використали розроблені математичні формули інтегрального коефіцієнту цитотоксичності та загального сумарного індексу цитотоксичності. ЦТ. Кч Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601