Водорозчинні солі 3-бензилксантиніл-8-метилтіоацетатної кислоти, які виявляють антиоксидантну дію

Водорозчинні солі 3-бензилксантиніл-8метилтіоацетатної кислоти загальної формули: Корисна модель відноситься до біологічно активних сполук і може бути використана у фармації та медицині. Актуальною проблемою сучасної медицини та фармакології є створення антиоксидантних сполук, оскільки в патогенезі багатьох захворювань ключовою ланкою є активні форми кисню (АФК). Відомо, що в основі утворення та розвитку стресу лежить гіперпродукція АФК біоенергетичними і нейрохімічними системами головного мозку. АФК в умовах антиоксидантної недостатності окислювально модифікують білки, ліпіди, ДНК, мембрани та інші органели нейрону. Гіперпродукція АФК, особливо, супероксидрадикалу, біоенергетичними та нейрохімічними системами нейрону в умовах ішемії приводить до експресії проапоптичних білків, прозапальних цитокінів, активації індуцибельної NO-синтази. Супероксидрадикал є основним компонентом реакції утворення найбільш агресивних цитотоксинів гідроксильного радикалу та пероксинітриту. При нейродесрукційних захворюваннях NO бере участь у механізмах загибелі нейронів, ініціюючи «нітрозуючий стрес», внаслідок якого відбувається нітрозування іонів металів та тіольних груп у білкових молекулах, виникає фрагментація нуклеїнових кислот і пригнічуються функції мітохондріальних ферментів. Сучасна нейропротекція припускає зменшення ушкоджувальної дії нітрозуючого стресу включенням у комплексну терапію ОНМК не тільки інгібіторів синтази-нітроген монооксиду, але й «пасток» NO його цитотоксичних форм. Окислювальна модифікація білкових структур мембрани нейрону в умовах ішемії призводить до порушення генерації і провідності нервового імпульсу, десенситації рецепторів, утворенню пор, і, як наслідок, ініціації апоптозу та формуванню когнітивного дефіциту. Одним з ключових механізмів дії багатьох відомих антиоксидантів-нейропротекторів є їх здатність гальмувати процеси окислювальної модифікації білків та накопичення маркерних карбонільних продуктів - АФГ і КФГ. У зв'язку з цим, перспективним напрямом є пошук сполук, які гальмують процеси окислювальної модифікації білка (ОМБ). Найближчим аналогом за дією та структурою сполук, що заявляються, може служити Тіотріазолін (3-метил-1,2,4-тріазоліл-5тіоацетилморфоліній) [Беленичев И. Ф., Коваленко С. И., Мазур И. А. и др. Классификация, механизмы действия и перспективы создания антиоксидантных средств (обзор) // Акт. питання фармац. та мед. науки і практ. - Запоріжжя. - 1999. - Вип. 4. - С. 61-75]. N N + H3C O H2N O C S N H O O H N HN O N CH2Ph O . HX+ S N X=NH3; HOCH2CH2NH2; HN O , . O (19) UA (11) 54957 (13) U які виявляють антиоксидантну дію. 3 54957 Сполуки, що заявляються, відрізняються від прототипу структурою гетероциклічного радикалу, пов'язаного з атомом Сульфуру і виявляють вищу антиоксидантну дію. В основу корисної моделі поставлена задача створення нових малотоксичних препаратів антиоксидантної дії, які після поглиблених фармакологічних досліджень можуть бути використані в медичній практиці. Поставлена задача вирішується синтезом водорозчинних солей 3-бензилксантиніл-8метилтіоацетатної кислоти, загальної формули: O O HN O O H N . HX+ S N N X=NH3; HOCH2CH2NH2; HN CH2Ph O На відміну від прототипу та емоксипіну (еталон порівняння) сполуки, що заявляються, виявляють значно сильнішу антиоксидантну дію та є малотоксичними. Одержують сполуки, що заявляються стадійним синтезом, який складається з наступних етапів (Схема 1). Схема 1 NaNO2 HN O O O O NH2 N NO HN AcOH O Na2S2O4 NH2 N O 1 3 2 O HO O O OH 1.NaOH; 2.H2SO4 H N HN O NH2 N CH2Ph CH2Ph CH2Ph NH2 HN SOCl2 H N HN CH2Cl CH2OH N N O N N CH2Ph CH2Ph 5 4 O O HS O OH H N HN O N CH2Ph 6 N O O OH S X H N HN O N O . HX+ S N CH2Ph 7a-c Приклад 1. Етап 1. Синтез 6-аміно-1-бензил-5нітрозо-2,4(1H,3H)піримідиндіону (2). До суспензії 100 г (0,46 моль) 6-аміно-1-бензил-2,4(1H,3H)піримідиндіону (1) в 2500 мл води при інтенсивному перемішуванні додають 32 г (0,46 моль) натрій нітриту та потім повільно 90 мл льодяної оцтової кислоти. Суміш перемішують до переходу білого кольору суспензії в малиновий. Осад відфільтровують, промивають водою та сушать при 70-75 °С. Вихід 92 %. Т. пл. >360 °С. C11H10N4O3 Знайдено, %: С 53,69; N 22,72. Розраховано, %: С 53,66; N 22,75. Етап 2. Синтез 5,6-діаміно-1-бензил2,4(1Н,3Н)піримідиндіон (3). До суспензії 100 г (0,40 моль) сполуки 2 в 1000 мл води при інтенсивному перемішуванні додають натрій дитіоніт до переходу малинового кольору суспензії в жовтозелений. Осад відфільтровують, промивають водою та сушать при 70-75 °С. Вихід 94,6 %. Т. пл. >360 °С. C11H12N4O2 Знайдено, %: С 56,87; N 24,14. Розраховано, %: С 56,89; N 24,12. 4 Етап 3. Синтез 3-Бензил-8гідроксиметилксантину (4). Сплавляють 91 г (0,39 моль) сполуки 3 та 45 г (0,58 моль) гідроксіетанової кислоти при 100 °С протягом 1 год. Сплав подрібнюють, додають 430 мл дистильованої води та нейтралізують твердим NaOH до рН=6,5-7,0. Після цього додають 430 мл 2Н розчину NaOH та кип'ятять 2,5 год. Розчин фільтрують в гарячому вигляді та додають 50 % розчин H2SO4 до рН 4,0-4,5. Охолоджують. Осад, що утворився відфільтровують та сушать при 70-75 °С. Вихід 85 %. Т. пл. 261262 °С. C13H12N4O3 Знайдено, %: С 57,31; N, 20,62. Розраховано, %: С 57,35; N 20,58. ПМР спектр ( -шкала, м.ч., розчинник ДМСОd6): 13,48 (с, 1Н) - N7H; 11,16 (с, 1Н) –N1H; 7,327,22 (м, 5H) - СНаром; 5,65-5,52 (т, 1Н) - ОН; 5,09 (с, 2Н) - N3CH2; 4,50 (с, 2Н) - С8СН2. Етап 4. Синтез (3-Бензилксантиніл8)метилтіоацетатної кислоти (6). До 90 г (0,33 моль) сполуки 4 додають 500 мл тіоніл хлориду та кип'ятять під витяжною систему протягом 6 год. Потім повністю відгоняють тіоніл хлорид під вакуумом, а сухий залишок 3-бензил-8хлорометилксантину 5 сушать добу. Отриманий інтермедіат розчиняють в 300 мл тіоацетатній кислоти та кип'ятять протягом 1 год. Розчин охолоджують і виливають в 3 л води, осад, що утворився відфільтровують, промивають водою та сушать при 80-85 °С. Вихід 84 %. Т. пл. 241-242 °С. C15H14N4O4S Знайдено, %: С, 52,06; N, 16,14. Розраховано, %: С, 52,02; N, 16,18. ПМР спектр ( -шкала, м.ч., розчинник ДМСОd6): 13,48 (с, 1Н) - N7H; 12,67 (пош.с, 1Н)-ОН; 11,16 (с, 1H)-N1H; 7,36-7,25 (м, 5Н) - СНаром; 5,09 (с, 2Н) N3CH2; 4,50 (с, 2Н) - С8СН2; 3,41 (с, 2Н) - SCH2. Етап 4. Синтез водорозчинних солей (3бензилксантиніл-8)метилтіоацетатної кислоти (7ас). До 0,5 г (0,015 моль) сполуки 6 додають 10 мл води та 0,015 моль амоніаку (для 7а), коламіну (для 7b) або морфоліну (7с) та нагрівають до повного розчинення. Фільтрують розчин в гарячому вигляді, а фільтрат охолоджують, висаджують ацетоном. Осад відповідної солі відфільтровують, промивають ацетоном та сушать при 80-85 °С. Приклад 2. Етап 1. Метод оцінки АОА при неферментативній ініціації ВРО солями заліза (II) [Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. - Oxford: Claredon Press, 1995. - 346 p.]. В якості субстрату використано суспензію яєчних ліпопротеїдів (СЯЛ). СЯЛ готується шляхом гомогенізації яєчного жовтка з фосфатним буфером (рН = 7,4). До суспензії додають досліджувані сполуки в концентрації 10-3, 10-5, 10-7 моль/л. Реакцію вільнорадикального окиснення ініціюють додаванням 0,025 М розчину FeSO4 7H2O. Суміш інкубують 60 хв. при 37 °С. Реакцію зупиняють 50 % розчином трихлороацетатної кислоти з трилоном Б. Після центрифугування протягом 30 хв. до розчину тіобарбітурової кислоти (ТБК) додають надосадову рідину і кип'ятять на водяній бані протягом 60 хв. Забарвлений комплекс малонового діальдегіду з ТБК вилучають додаванням н-бутанолу. Методом спектрофотометрії визначають концентрацію малонового діальдегіду, яка свідчить про інтенсивність процесів віль 5 54957 норадикального окислення. Антиоксидантну активність (у відсотках) визначали за формулою: АОА = (СK1 - С0/ СK1 - СK2) 100 %, де СK1, СK2 - вміст ТБК-реактантів у контрольних пробах, моль/л; 6 С0 - вміст ТБК-реактантів у дослідній пробі, моль/л. В якості еталонів порівняння використовували тіотріазолін та емоксипін. Результати дослідження наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Антиоксидантна активність досліджуваних сполук (10-6 М) in vitro при неферментативній ініціації ВРО (М±m) Сполука Аммоній (3-бензилксантиніл-8)метилтіоацетат 2-Гідроксиетиламмоній (3'-бензилксантиніл-8')метил-тіоацетат Морфоліній (3-бензилксантиніл-8)метилтіоацетат Інтакт Контроль Тіотріазолін Емоксипін Примітки: Δ - р 0,05 по відношенню до інтакту; * - р 0,05 по відношенню до контролю; # - р 0,05 по відношенню до Тіотріазоліну; + - р 0,05 по відношенню до Емоксипіну. Етап 2. Метод оцінки гальмування аутоокислення адреналіну в адренохром [Методи оцінки антиоксидантних властивостей фізіологічно активних сполук при ініціюванні вільнорадикальних процесів у дослідах in vitro / Губський Ю. Л., Дунаев В. В., Бєленічев І. Ф. та інш. // Метод, реком. - Київ: МДА, ммоль/г суспензії 0,039±0,002*+ 0,032±0,001*+ 0,04±0,037* 0,03±0,001 0,254±0,001Δ 0,069±0,002* 0,091±0,002* АОА % 81,4 84,7 82,3 67,1 56,6 ДФЦ МОЗ України, 2002. - 26 с]. Неферментативна реакція окислення адреналіну в адренохром в лужному середовищі супроводжується накопиченням супероксидрадикалу. У біологічних системах швидкість процесу залежить від активності ферменту супероксиддисмутази, але в хімічній системі in vitro ця реакція може бути застосовна для кількісної оцінки АОА досліджуваних сполук. Результати дослідження наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Антиоксидантна активність досліджуваних сполук (10-6 М) in vitro по інгібіруванню супероксидрадикалу (М±m) Сполука Аммоній (3-бензилксантиніл-8)метилтіоацетат 2-Пдроксиетиламмоній (3'-бензилксантиніл-8')метил-тіоацетат Морфоліній (3-бензилксантиніл-8)метилтіоацетат Інтакт Контроль Тіотріазолін Емоксипін Примітки: Δ - р 0,05 по відношенню до інтакту; * - р 0,05 по відношенню до контролю; # - р 0,05 по відношенню до Тіотриазоліну; + - р 0,05 по відношенню до Емоксипіну. Етап 3. Оцінювання АОА сполук по інгібуванню NO -радикала [Ванин А. Ф. Динитрозольные комплексы железа и S-нитротиолы - две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в Оптична щільність 0,06±0,001*#+ #+ 0,06±0,001* 0,068±0,002*+ 0,066±0,0008 0,2±0,001Δ 0,072±0,001* 0,163±0,006* АРА % 70 70 66 35,8 18,5 биосистемах / А. Ф. Ванин //Биохимия. - 1998. - Т. 63, Вып. 7. - С. 924-938]. Фотоіндукція натрій нітропрусиду супроводжується накопиченням NO радикалу, про що судять за швидкістю окислення аскорбату, вимірюючи оптичну щільність проби при 265 нм. Результати дослідження наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Антиоксидантна активність досліджуваних сполук (10-6 М) in vitro по інгібуванню монооксиду азоту NO (M±m) Сполука Оптична щільність при 265 нм АРА % 7 54957 8 Продовження таблиці 3 Аммоній (3-бензилксантиніл-8)метилтіоацетат 2-Гідроксиетиламмоній (3'-бензилксантиніл-8')метил-тіоацетат Морфоліній (3-бензилксантиніл-8)метилтіоацетат Контроль N-АЦЦ Тіотріазолін Примітки: * - р 0,05 по відношенню до контролю; # - р 0,05 по відношенню до Тіотриазоліну; + - р 0,05 по відношенню до N-АЦЦ. Етап 4. Метод оцінки АОА по інгібіруванню окислювальної модифікації білка, що викликана реактивом Фентона [Ванин А. Ф. Динитрозолъные комплексы железа и S-нитротиолы - две возможные формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах / А. Ф. Ванин //Биохимия. 1998. - Т. 63, Вып. 7. - С. 924-938]. Ініціацію окислювальної модифікації білка проводили в гомогенаті мозку нелінійних білих щурів. До 250 мг гомогенату тканини додають 7 мл 0,5 М фосфатного буферу (температура розведення 5 °С) та центрифугують при 11000g 30 хв. (при температурі 10 °С). До 0,1 мл підготовленого супернатанту додавали 0,1 мл досліджуваних речовин (С = 10-6 М), 0,1 мл 2,8 % розчину феррум (II) сульфату, 0,1 мл 4 % гідроген пероксиду та 0,202±0,003*+# 0,202±0,003*+# 0,202±0,003*+# 0,59±0,03 0,48±0,002* 0,392±0,006*+ 65,7 65,7 65,7 18,6 33,5 інкубували при температурі 37 °С 2 год. Потім додавали 1 мл 25 % розчину трихлороацетатної кислоти та центрифугували 30 хв. при 3000 об/хв. (при температурі 15 °С). До осаду, який залишився після центрифугування, додавали 1 мл 2,2 % 2,4динітрофенілгідразину (виготовленого на 7 % розчині хлоридної кислоти), інкубували 1 год при температурі 37 °С та центрифугували 10 хв. при 3000 об/хв. Осад промивали 3 мл етилацетату, розводили в 3 мл 50 % розчину сечовини, додавали 1 краплю 7 % розчину хлоридної кислоти та розводили дистильованою водою в 12 разів. Підготовлений розчин спектрофотометрували при довжині хвилі 274, 363 нм (розчин порівняння 0,5 М фосфатний буфер). За показником екстинкції визначали кількість карбонільних і карбоксильних груп. Результати дослідження наведені в таблиці 4. Таблиця 4 Антиоксидантна активність досліджуваних сполук (10-6 М) in vitro по інгібіруванню окислювальної модифікації білка (М±m) Сполука Аммоній (3-бензилксантиніл-8)метилтіоацетат 2-Гідроксиетиламмоній (3'-бензилксантиніл8')метилтіоацетат Морфоліній (3-бензилксантиніл-8)метилтіоацетат Інтакт Контроль Емоксипін Тіотріазолін Примітки: Δ - р 0,05 по відношенню до інтакту; * - р 0,05 по відношенню до контролю; # - р 0,05 по відношенню до Тіотріазоліну; + - р 0,05 по відношенню до Емоксипіну. Етап 5. Метод оцінки АОА по гальмуванню «нітрозуючого» стресу, що викликаний надлишком феррум (II) динітрозильного комплексу з цистеїном (DNIC) (Halliwell В. Molecular Biology of Free Radicals in Human Diseases / B. Halliwell, O. Auroma - St. Lucia, London: OICA Int., 1999. - 352 p.). Для моделювання «нітрозуючого» стресу використовують надлишок феррум (II) динітрозольного комплексу з цистеїном (DNIC) - стабільний комплекс NO , який можна розглядати як транспортну фор АФГ, у.о./г 5,30±0,02*+ 5,8±0,03*+ Аоа,% 46,9 42,0 КФГ, у.е./г 3,73±0,02*+ 3,34±0,02*#+ Аоа,% 45,7 52,0 5,61±0,01*+ 1,07±0,002 9,95±0,07 7,0±0,002* 6,00±0,01* 43,7 30 40 3,52±0,02*+ 1,37±0,02 6,87±0,002 4,87±0,01* 3,75±0,01* 48,8 30,0 45,5 му цього радикала та таку, що забезпечує тривалішу дію NO на різні групи білків. Стабільний комплекс NO з цистеїном додавали в супернатант (вміст білку 5 мг/мл) в концентрації 100 мкМ та інкубували 10 хв. при температурі 4 °С. Досліджувані речовини вносили до інкубату в концентрації 10-6 М. Для оцінки АОА сполук в умовах «нітрозуючого» стресу визначали ступінь гальмування утворення продуктів окислювальної модифікації білка АФГ і КФГ в пробах. Також визначали ступінь підвищення активності СОД. Данні дослідження наведені в таблиці 5. 9 54957 10 Таблиця 5 Вплив досліджуваних сполук на активність СОД та вміст продуктів окислювальної модифікації білків в супернатанті мозку щурів при моделюванні нітрозуючого стресу in vitro (M±m) Досліджувані проби СОД у.о./мг білку/хв. Інтактна (n = 10) Контрольна: DNIC, 100 мкМ (n = 10) Досліджувана: DNIC + Аммоній (3бензилксантиніл-8)метилтіоацетат, 10-6 М (n=10) Досліджувана: DNIC + 2-Гідроксиетил-аммоній (3'-бензилксантиніл-8')метил-тіоацетат, 10-6 М (n=10) Досліджувана: DNIC + Морфоліній (3бензилксантиніл-8)метилтіоацетат, 10-6 М (n=10) Еталонна: DNIC + N-АЦЦ, 10-6 М (n=10) 260,7±7,6 120,2±5,0Δ 200,7±4,3*# Продукти ОМБ, у.о./мг білка КФГ, 363 нм АФГ, 270 нм 14,0±0,11 22,3±0,17 26,2±0,21Δ 36,7±0,10Δ 18,8±0,10*# 26,8±0,08*# 214,1±5,0*# 18,0±0,11*# 26,1±0,09*# 209,1±4,7*# 18,710,10*# 27,1±0,11*# 147,8±3,7* 22,6±0,12* 30,2±0,12* Примітки: Δ - р