Спосіб одержання імуноглобулінових препаратів для діагностики вірусів групи есно

Спосіб одержання імуноглобулінових препаратів для діагностики вірусів групи ECHO, що полягає в одержанні сироватки крові тварин після циклу імунізації комплексом сероварів моно- та 3 імунні моновалентні та полівалентні сироватки для ідентифікації ентеровірусів виробництва ЗПП Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М. П. Чумакова РАМН. До складу набору сироваток включені також імунні сироватки, призначені для ідентифікації вірусів ECHO в реакції нейтралізації у культурі тканини [7]. Одним з таких препаратів є "Сыворотки диагностические энтеровирусные, сухие моно- и поливалентные для реакции нейтрализации". До складу діагностичного набору сироваток входять сироватки до 31-го серотипу вірусів ECHO (1-9; 11-27; 29-33), а також полівалентні сироватки одержані до цих сероварів вірусів. Серологічна ідентифікація вірусів виконується реакцією нейтралізації у первиннотрипсинізованій культурі тканини нирок зелених мавп (для ідентифікації вірусів ECHO 1-9; 11-15; 17-20; 22-27; 29-32 сероварів, а також на перещеплюваних лініях клітин RD для вірусів ECHO 16, 21, 23. Але даний метод не є найбільш специфічним для цієї групи вірусів. До того ж, для виготовлення сироваток використовуються дорогі культури тканин, та тварини (кролі і барани), утримання яких також дуже затратне. Дане технічне рішення прийнято за прототип корисної моделі, як таке що призначене для одержання діагностичного препарату вірусів ECHO. Зважаючи на недостатню специфічність діагностичних сироваток прототипу для ідентифікації гемаглютинуючих вірусів ECHO була поставлена задача підвищення специфічності одержання діагностичних препаратів шляхом поліпшення очистки сироватки від неспецифічних компонентів. Задача вирішується тим, що спосіб одержання імуноглобулінових препаратів для діагностики вірусів групи ECHO полягає в одержанні сироватки крові тварин після циклу імунізації комплексом сероварів вірусів ECHO та очистки від неспецифічних чинників додаванням до одержаної імунної сироватки розчину 0,4 % ріванолу у пропорції 1:3 та витримують суміш до осадження супутніх речовин-неспецифічних чинників, після чого надосадкову рідину відділяють, додають хлористий натрій до кінцевої концентрації 0,85 %, розчин центрифу 56783 4 гують, відокремлюють та видаляють осад, а розчин одержаного гамаглобуліну з антигемаглютинуючими властивостями, за необхідності подальшого зберігання, ампулюють та ліофілізують. Спосіб реалізують наступним чином. Імунізацію білих щурів та сірих кролів проводили антигенами 12-ма гемаглютинуючими сероварами вірусів ECHO та полівалентними антигенами 3 типів. В основу організації полівалентних антигенів була покладена особливість різних штамів вірусів ECHO проявляти гемаглютинуючу активність залежно від температури проведення реакції аглютинації (РГА при +4°, +18°, +37 °С). Полівалентні антигени 3-х типів були утворені об'єднанням рівних об'ємів гемаглютинуючих вірусів ECHO (по 1,0 мл). Моно- та полівалентні сироватки одержували імунізацією лабораторних тварин (білих щурів та сірих кролів) гемаглютинуючими штамами вірусів ECHO. Полівалентні антигени містили від 4 до 6 моновалентних антигенів. Одержання моновалентних щурячих антигемаглютинуючих сироваток до вірусів ECHO. В якості антигенів використовували гемаглютинуючі віруси ЕСНО 3, 11, 6, 7, 11, 12, 13, 19, 20, 21, 24, 29, 30 сероварів, вирощених на первиннотрипсинізованних клітинах нирках ембріонів людини (ПЭЧ), фібробластах ембріонів людини ФЕЧ. Накопичення антигенів також можливе на перещеплюваних культурах фібробластів щура (ФК).В моновалентних антигенах визначали аглютинуючі та інфекційні титри в реакціях аглютинації та в реакції нейтралізації в культурі тканини. Для імунізації використовували білих щурів та сірих кролів На кожний моновалентний та полівалентний антигени брали по 5 білих щурів та по 3 кроля. Схема імунізації. Білих щурів імунізували внутришньочеревним введенням наростаючих доз моновалентних антигенів 1, 2, 3, 5 мл з інтервалом 7 діб. В одержаних від кожного щура моновалентних сироватках визначали рівень специфічних антитіл в РЗГА та неспецифічних гемаглютининів до еритроцитів людини в реакції аглютинації РА (Табл. 1). Таблиця 1 Результати імунологічного дослідження моновалентних сироваток № № п. п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Серовари вірусів ЕСНО-3 ЕСНО-6 ЕСНО-7 ECHO-11 ECHO-12 ECHO-13 ECHO-19 ECHO-20 ECHO-21 ECHO-24 ECHO-29 E-30 Інфекційні титри вируТитри неспецифічних Титри специфічних Титри Аглютининів сів культура ПЭЧ (в аглютининів в сироват- аглютининів в сировавірусів в Культ. ПЭЧ Log) в РН ках тках 5,75 1:1024 1:512 1:512 6,0 1:128 1:128 6,75 1:1024 1:512 1:512 6,65 1:128 1:64 1:64 5,8 1:128 1:128 1:128 6,35 1:16 1:32 1:32 5,0 1:1024 1:512 1:1024 6,5 1:256 1:256 5,0 1:256 1:256 3,5 1:512 1:512 6,25 1:512 1:512 6,25 1:64 1:128 1:128 5 56783 Результати, що наведені в таблиці 2 свідчать про те, що імунізація проводилася антигенами з високим рівнем інфекційних та аглютинуючих титрів. Поряд з утворенням специфічних антигемаглютинуючих антитіл в імунних сироватках відбувається накопичення у високих титрах неспецифічних гемаглютининів, котрі унеможливлюють визначення специфічних антигемаглютинуючих антитіл. Для видалення неспецифічних факторів із імунних сироваток використали 0,4 % розчин ріванолу який має властивість видаляти із сироваток альбумінову, , -глобулінові фракції сироваток, з котрими пов'язують неспецифічні фактори в імунних сироватках. До одного об'єму сироватки прибавляли 3 об'єми 0,4 % розчину ріванолу з рН 5,8. Альбумінова, , -глобулінові фракції сироваток після витримки 30 хв. при +4 °С випадали в щільний осад, що їх разом з ріванолом видаляли висолюванням хлористим натрієм (0,85 % насичення). Наступним центрифугуванням при 2000 об./хв. впродовж 15 хв. відділяли гамаглобулін. Одержані в процесі обробки гамаглобулінові фракції сироваток розводили фізіологічним розчином 1:10, ампулювали та ліофілізували. В ампулах отримували аморфний препарат білого кольору, що легко розчинявся дистильованою водою, зберігалися антигемаглютинуючі антитіла. Препарати були вільними від неспецифічних факторів, що давало можливість використовувати імунні гамаглобулінові препарати без допоміжної обробки для встановлення сероварів ізольованих вірусів групи ECHO. Одержання полівалентних гаммаглобулінових препаратів. До полівалентного антигену №1 входили віруси ECHO 3, 11, 13, 19 серотипів; до полівалентного антигену №2 входили віруси ECHO 7, 12, 20, 21 сероварів; до антигену №3 6 входили віруси 6, 24, 29, 30 сероварів. Полівалентні антигени складали в залежності від прояву гемаглютинуючої активності вірусів при різних температурах +4°; +18° ; +37 °С. Полівалентні антигени білим щурам вводили від 4,0 до 6,0 мл в залежності від кількості взятих в антиген вірусів, триразово з тижневим інтервалом. Такими ж дозами імунізували кролів також триразово з тижневим інтервалом. Тотальне кровопускання білих щурів та кролів проводили через 10 діб після останнього введення антигенів. Щурів та кролів попередньо заморювали ефіром (етером). В сироватках, отриманих від кожного щура та кроля паралельно визначали рівень антигемаглютинуючих та титри віруснейтралізуючих антитіл до кожного серовару вірусу, включеному в полівалентний антиген (табл. 2). Результати наведені в таблиці свідчать про можливість використовувати полівалентні антигени для одержання полівалентних сироваток з високими титрами антитіл до кожного антигену, що був взятий в полівалентний антиген, специфічність одержаних гаммаглобулінових полівалентних препаратів та про можливість їх використання для ідентифікації вірусів групи ECHO в РЗГА. Використання полівалентних гаммаглобулінових препаратів дозволяє проводити попереднє типування вірусів на 3 групи, що сприяє прискоренню ідентифікації гемаглютинуючих штамів групи ECHO з подальшою ідентифікацією моновалентними препаратами. Одержані полівалентні та моновалентні сироватки були перевірені в РЗГА з використанням в якості антигенів свіжоізольованих нами вирусів ECHO. Штами були розподілені на три групи відповідно до груп полівалентних сироваток. Таблиця 2 Рівень антигемаглютинуючих та вірус нейтралізуючих антитіл в полівалентних сироватках до музейних штамів вірусів ECHO Віруси ЕСНО 3 ECHO 11 ECHO 13 ECHO 19 ECHO 7 ECHO 12 ECHO 20 ECHO 21 ECHO 6 ECHO 24 ECHO 29 ECHO 30 Середньоегеометричні титри РЗГА Полівалентна сироватка 1 1:316 1:8913 1:1738 1:240 Полівалентна сироватка 2 1:275 1:174 Полівалентна сироватка 3 1:158 Середньо геометричні титри антитіл РН 1:316 1:1259 1:316 1:368 1:2512 1:1259 1:2512 1:1585 1:263 1:891 1:724 1:550 Примітки: - титри антитіл в РЗГА до вірусів ECHO 6, 24, 20, 21, 30 не визначали тому, що прототипними штами гемаглютинуюча активність втрачена; РЗГА- реакція затримки гемаглютинації; РН- реакція нейтралі 7 зації. 56783 8 9 56783 В групі гемаглютинучі віруси були ідентифіковані моновалентними сироватками в РЗГА та 10 результати підтверджені в реакції нейтралізації (РН). Результати наведені в Табл. 3. Таблиця 3 Ідентифікація свіжоізольованих вірусів ECHO полі- та моновалентними гаммаглобуліновими препаратами в РЗГА та в РН (кількість штамів) Полівалентні -глобуліни, РЗГА Віруси №1 ЕСНО-3 ЕСНО-6 ЕСНО-7 ECHO-11 ECHO-12 ECHO-13 ECHO-19 ECHO-20 ECHO-21 ECHO-24 ECHO-29 ECHO-30 Всього №2 №3 7 9 1 17 1 1 6 8 Моновалентні глобуліни, РЗГА 7 10 1 9 1 1 6 35 10 10 Наведені в таблиці результати свідчать про високу специфічність одержаних гаммаглобулінових полівалентних та моновалентних препаратів та про можливість їх використання для ідентифікації вірусів групи ECHO в РЗГА. Використання полівалентних гаммаглобулінових препаратів дозволяє проводити попереднє типування вірусів на 3 групи, що сприяє прискоренню ідентифікації гемаглютинуючих штамів групи ECHO. Джерела інформації: 1. Ворошилова М. К., Жевандрова В. И., Балаян М. С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. «Медицина» Москва 1964. С. 151. 2. Ворошилова М. К. Изучение кишечных вирусов в СССР. В кн Материалы к изучению энтеровирусных заболеваний и их последствий. Рига, 1962, С. 3-18. 3. Бароян О. В., Гайлонская И. Н., Григорьян И. К. Кишечные вирусы и их роль в кишечной патологии человека. Асептический серозный менингит. Советская медицина, 1961, №1.,С. 53-64. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Підтверджено ідентифікацією в РН 7 10 1 9 1 1 6 35 4. Todorov J. Заболевания грипподобного характера с респираторными проявлениями, связанные с энтеровирусной инфекцией. Труды НИИ эпидемиологии и микробиологии. Болгария. 1963, XI, 155-161. 5. Kouth V., et all. Die "Herpangina", Ehidemie 1967-1968 ECHO 3, 6, 30. Dtsch.vtd. Wschr. 1969, 94, 39, 1959-1965. 6. Инструкция по применению сывороток диагностических энтеровирусных, сухих моно- и поливалентных", утвержденной 16.10.1998 г. Управления лекарственных средств и медтехники. 7. Подоплекин В. Д., Подоплекина Л. Е. Опыт практического применения РЗГА для идентификации вирусов ECHO и определение уровня антител к ним в крови людей. В кн. Приготовление и применение вирусных препаратов. Материалы XX научной конференции, посвященные 60летию Томского НИИВС, Томск, 1966, С. 16. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601