Спосіб визначення сульфонілсечовинних гербіцидів у ґрунті та зерні кукурудзи

Спосіб визначення сульфонілсечовинних гербіцидів у ґрунті та зерні кукурудзи, що включає підготовку проб ґрунту та зерна кукурудзи до екст 3 день вважають МайсТер Пауер OD на основі діючих речовин (д.р.) тієнкарбазон-метилу, йодсульфурон-метил натрію, форамсульфурону (30 та ципросульфаміду) (табл. 1). Для контролю за дотриманням гігієнічних нормативів тієнкарбазон-метилу та форамсульфурону раніше були розроблені аналітичні методи визначення кожної речовини окремо методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) [4-7]. Але на сьогоднішній день в сільськогосподарській практиці все більше використовують комбіновані препарати, що в своєму складі містять декілька діючих речовин. Таким препаратом і є МайсТер Пауер OD. Тому актуальною стає розробка методу, який дозволив би одночасно визначати декілька речовин з класу сульфонілсечовин в одній пробі. Така методика дозволила б значно прискорити швидкість одного визначення та зменшити витрати на його проведення. Такий метод має не лише економічне, а й біоетичне значення. Відомі окремі способи визначення тієнкарбазон-метилу та форамсульфурону у грунті та зерні кукурудзи шляхом ВЕРХ (4-7). Однак, дані способи мають наступні недоліки: не передбачають визначення суміші сульфонілсечовинних гербіцидів, не забезпечують достатню очистку екстракту, що може вплинути на результат вимірювання, вимагають більше часу і затрат реактивів. Спосіб визначення форамсульфурону в ґрунті та зерні кукурудзи обраний як прототип передбачає підготовку проб ґрунту та зерна кукурудзи до екстракції, проведення екстракції, очищення та концентрування. Наявність форамсульфурону визначають за його залишковими кількостями у ґрунті та зерні кукурудзи (6). Однак, такий підхід не дозволяє одночасно визначити кожну діючу речовину сульфонілсечовинної групи з суміші в одній пробі. Задачею корисної моделі є одночасне визначення сульфонілсечовинних гербіцидів (тієнкарбазон-метилу, форамсульфурону та ципросульфаміду) в одній пробі ґрунту та зерна кукурудзи. Технічний результат, отриманий після вирішення задачі, полягає в прискоренні визначення сульфонілсечовинних гербіцидів (тієнкарбазонметилу, форамсульфурону та ципросульфаміду) і зменшенні витрат на його проведення. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі визначення форамсульфурону у ґрунті та зерні кукурудзи, що включає підготовку проб ґрунту та зерна кукурудзи до екстракції, проведення екстракції, очищення екстрактів, концентрування та хроматографування, згідно корисної моделі, змінюють умови підготовки екстрактів та умови хроматографування для чіткого розходження піків речовин (форамсульфурону, тієнкарбазонметилу та ципросульфаміду), що знаходяться в пробах ґрунту чи зерна кукурудзи, після отримання хроматограм вивчають піки кожної речовини, ідентифікують їх за часом утримування і визначають їх кількість за градуювальною залежністю висоти піка кожної сполуки від концентрації в градуювальному розчині суміші сполук. Спосіб реалізують наступним чином: 58531 4 Спосіб ґрунтується на вилученні похідних сульфонілсечовини (тієнкарбазон-метилу, форамсульфурону, ципросульфаміду) з проб ґрунту та зерна кукурудзи сумішшю ацетонітрил-вода (4+1, об.+об.) при підігріві, очищенні та концентруванні екстракту, подальшому визначенні тієнкарбазонметилу, форамсульфурону та ципросульфаміду методом обернено-фазової ВЕРХ з ультрафіолетовим (УФ) детектором. Підготовка проби: 25 г проби ґрунту або зерна кукурудзи поміщають в конічну колбу місткістю 250 мл. Приливають 30 мл суміші ацетонітрил-вода (4+1, об.+об.) та екстрагують на апараті для струшування протягом 30 хвилин при температурі 60°С. Екстракт фільтрують через фільтр «синя стрічка» у мірний циліндр з притертою пробкою місткістю 50 мл. Екстракцію з 20 мл суміші ацетонітрил-вода (4+1, об.+об.) повторюють. Об'єднаний екстракт доводять до об'єму 50 мл сумішшю ацетонітрил-вода (4+1, об.+об.) та перемішують у циліндрі з притертою пробкою. Аліквоту 10мл екстракту (тобто 1/5 частину екстракту) вносять на патрон C18 за допомогою шприца місткістю 10 мл з роз'ємом типу Луер (швидкість потоку через патрон не повинна перевищувати 2 мл/хв.). Елюат збирають у грушоподібну колбу для відгону розчинників місткістю 25 мл і концентрують на ротаційному випарнику при температурі водяної бані не вище 60°С до об'єму 0,2-0,3 мл. До сухого залишку розчинник випаровують струменем сухого повітря. Сухий залишок кількісно переносять в градуйовану пробірку місткістю 5 мл за допомогою рухомої фази (суміш ацетонітрил-0,1% водний розчин ортофосфорної кислоти (35+65, об.+об.)). Кінцевий об'єм екстракту проби 1 мл. Аналогічно готують паралельну пробу. Підготовка та кондиціювання колонки для рідинної хроматографії: Колонку хроматографічну сталеву (250 ммх4,6 мм), заповнену Нуклеосилом C18 (100-5), стабілізують при температурі 30°С при об'ємній витраті рухомої фази 1 мл/хв протягом 30 хвилин. Вмикають детектор і чекають стабільності базової лінії 10-15 хвилин. Умови роботи хроматографа: - рідинний хроматограм «Шимадзу» або подібний з УФ-детектором; - колонка хроматографічна сталева (250 ммх4,6 мм), заповнена Нуклеосилом С18 (100-5); - рухома фаза - суміш ацетонітрил-0,1 % водний розчин ортофосфорної кислоти (35+65, об.+об.); - об'ємна витрата рухомої фази - 1 мл/хв.; - температура термостата колонки - 30°С; - довжина хвилі ультрафіолетового детектора - 230 нм; - чутливість - 0,02 aufs (одиниць абсорбції на шкалу); - швидкість руху діаграмної стрічки самописа 4 мм/хв; - об'єм петлі інжектора рідинного хроматографа - 20 мкл. Час утримування за даних умов, хв.: форамсульфурону - 7,1±0,1; тієнкарбазон-метилу - 10,8±0,1; 5 ципросульфаміду - 12,0±0,1. Етапи способу одночасного визначення сульфонілсечовинних гербіцидів в одній пробі ґрунту або зерна кукурудзи узагальнені в табл. 2. Кількісне визначення тієнкарбазон-метилу, форамсульфурону та ципросульфаміду здійснюють методом абсолютного калібрування. Для цього необхідно для кожної речовини окремо побудувати градуювальну залежність висоти її хроматографічного піка від масової концентрації в градуювальному розчині суміші цих речовин. Побудова градуювальник залежностей для тієнкарбазон-метилу, форамсульфурону та ципросульфаміду: Готують 5 градуювальних розчинів суміші тієнкарбазон-метилу, форамсульфурону та ципросульфаміду з масовими концентраціями кожної сполуки 1; 2; 4; 5 та 6 мкг/мл. Ці градуювальні розчини хроматографують тричі в умовах, наведених в табл. 2. Ідентифікацію піків тієнкарбазон-метилу, форамсульфурону та ципросульфаміду в розчинах проводять відповідно до часу утримування кожної з трьох сполук (табл. 2). Вимірюють висоту піка кожної речовини від нульової (базової) лінії у напрямку, перпендикулярному осі часу, за допомогою лінійки з похибкою 0,5 мм. Обчислюють середнє значення висоти піків кожної сполуки з 3 паралельних вимірювань. Отримані результати обробляють за методом найменших квадратів. Градуювальна залежність описується рівнянням: hгр  а  b  гр , де hгр - висота піку тієнкарбазон-метилу, форамсульфурону чи ципросульфаміду, мм; гр - масова концентрація тієнкарбазонметилу, форамсульфурону чи ципросульфаміду в градуювальному розчині, мкг/мл; а - масштабний коефіцієнт; b - коефіцієнт регресії. Градуювальну залежність вважають задовільною, якщо значення коефіцієнта кореляції знаходиться в межах від 0,8 до 1,0. Виконання вимірювань: Проби хроматографують тричі за умов, наведених в таблиці 2. Використовуючи відповідну градуювальну залежність, обчислюють масову частку ( n ), мг/кг, тієнкарбазон-метилу, форамсульфурону та ципросульфаміду для кожної з паралельних пробі ґрунту чи зерна кукурудзи за hпр  a Vпр формулою: n  k   , де b m n - номер паралельної проби (n = 1, 2); k- коефіцієнт, який враховує аліквоту проби, k=5; 58531 6 hnp - висота піку тієнкарбазон-метилу чи форамсульфурону, чи ципросульфаміду (середнє з трьох спостережень) в аліквоті проби, що введена в хроматограф, мм; а - масштабний коефіцієнт; b - коефіцієнт регресії у рівнянні градуювальної залежності; Vnp - кінцевий об'єм екстракту проби, мл; m - наважка проби, г. Результат обчислень заокруглюють до другої значущої цифри. Обробка результатів вимірювання: За результат вимірювання масової частки тієнкарбазон-метилу або форамсульфурону, або ципросульфаміду в пробі (со), мг/кг, приймають середнє значення двох паралельних визначень масової частки тієнкарбазон-метилу або форамсульфурону, або ципросульфаміду. Перелік використаної літератури: 1. Перспективы защиты растений: материалы международного Конгресса ВСРС. XVI International Plant Protection Congress, (Глазго, Англія, 15-18 октября 2007)/ Российская академия сельскохозяйственных наук. - М: Агрохимия. -2009. №4.~с.69-91. 2. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні. - Офіційне видання. - Київ: Юнівест Медіа, 2003. - 348 с 3. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні. - Офіційне видання. - Київ: Юнівест Медіа, 2010. - 543 с 4. Методичні вказівки з визначення тієнкарбазон-метилу у грунті методом високоефективної рідинної хроматографії: Методичні вказівки № 9342009 // Погоджено МОЗУ 3.04.2009, Постанова № 10, затверджено Міністерством охорони навколишнього природного середовища 5.05.2009, Наказ № 204. 5. Методичні вказівки з визначення тієнкарбазон-метилу в зерні кукурудзи методом високоефективної рідинної хроматографії: Методичні вказівки № 936-2009 // Погоджено МОЗУ 3.04.2009, Постанова № 10, затверджено Міністерством охорони навколишнього природного середовища 5.05.2009, Наказ № 204. 6. Методичні вказівки з визначення форамсульфурону у грунті методом високоефективної рідинної хроматографії: Методичні вказівки № 4332003 // Методичні вказівки з визначення мікро кількостей пестицидів в продуктах харчування, кормах та навколишньому середовищі. - Київ, 20 рік. - Збірка № 44. - С 279-290. 7. Методичні вказівки з визначення форамсульфурону в зерні кукурудзи методом високоефективної рідинної хроматографії: Методичні вказівки № 432-2003 // Методичні вказівки з визначення мікро кількостей пестицидів в продуктах харчування, кормах та навколишньому середовищі. - Київ, 20 рік. -Збірка №44.- С 266-278. Спосіб визначення сульфонілсечовинних гербіцидів у грунті та зерні кукурудзи 7 58531 8 Таблиця 1 Загальні відомості про досліджувані сульфонілсечовинні гербіциди Назва Хімічна назва за IUPAC Емпірична формула Молекулярна маса C12H14N4O7S2 390,4 C17H20N6O7S 452,4 C18H18N2O5S Хімічна формула 374,4 CH3 4-[(4,5-дигідро-3метокси-4-метил-5 оксо-1H-1,2,4Тієнкарбазон триазол-1-іл) карбо-метил нілсульфамоїл]-5метилтіофен-3карбонова кислота 1-(4,6-диметоксі піримідин-2-іл)-3-(2Форамсульдиметилкарбамоїл-5фурон формамідофенілсульфоніл) сечовина O O S S O CH3 O O O N N CH3 N N H O H3 C H OCH3 CON(CH3)2 H C O N SO2NHCONH N H N OCH3 CH3 Ципросульфамід N-циклопропіл-4[(2метоксибензол) сульфамоїл] бензамід O O O O S HN O N H 9 58531 10 Таблиця 2 Спосіб визначення сульфонілсечовинних гербіцидів у грунті та зерні кукурудзи Етап визначення Екстракція Очищення Концентрування Хроматографування (умови) Комп’ютерна верстка М. Мацело Дії на даному етапі 25 г проби ґрунту або зерна кукурудзи поміщають в конічну колбу місткістю 250 мл. Приливають 30 мл суміші ацетонітрил-вода (4+1, об.+об.) та екстрагують на апараті для струшування протягом 30 хвилин при температурі 60 °С. Екстракт фільтрують через фільтр «синя стрічка» у мірний циліндр з притертою пробкою місткістю 50 мл. Екстракцію з 20 мл суміші ацетонітрил-вода (4+1, об.+об.) повторюють. Об'єднаний екстракт доводять до об'єму 50 мл сумішшю ацетонітрилвода (4+1, об.+об.) та перемішують у циліндрі з притертою пробкою. Аліквоту 10 мл екстракту (тобто 1/5 частину екстракту) вносять на патрон C18 за допомогою шприця місткістю 10 мл з роз'ємом типу Луер (швидкість потоку через патрон не повинна перевищувати 2 мл/хв). Елюат збирають у грушоподібну колбу для відгону розчинників місткістю 25 мл і концентрують на ротаційному випарнику при температурі водяної бані не вище 60 °С до об'єму 0,2-0,3 мл. До сухого залишку розчинник випаровують струменем сухого повітря. - рідинний хроматограм «Шимадзу» або подібний з УФ-детектором; - колонка хроматографічна сталева (250 ммх4,6 мм), заповнена Нуклеосилом С18 (100-5); - рухома фаза - суміш ацетонітрил-0,1 % водний розчин ортофосфорної кислоти (35+65, об.+об.); - об'ємна витрата рухомої фази -1 мл/хв.; - температура термостата колонки - 30 °С; - довжина хвилі ультрафіолетового детектора-230нм; - чутливість 0,02 aufs (одиниць абсорбції на шкалу); - швидкість руху діаграмної стрічки самописа - 4мм/хв; - об'єм петлі інжектора рідинного хроматографа - 20мкл. Час утримування за даних умов, хв.: форамсульфурону - 7,1 ±0,1; тієнкарбазон-метилу - 10,8±0,1; ципросульфаміду - 12,0±0,1. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601