Спосіб створення поверхні, інертної до неспецифічної білкової адсорбції

Реферат: UA 76098 U UA 76098 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до вимірювальної техніки, аналітичної біохімії, біотехнології, молекулярної біології, імунології, медицини та і може бути використана для захисту металевих конструкцій від формування плівок біологічного походження, аналізу багатокомпонентних біохімічних середовищ, експресної детекції біомолекул, вивчення біоспецифічних взаємодій. Відомо, що неспецифічна адсорбція білків являє собою серйозну проблему у багатьох галузях науки і технології. Зокрема, вона є причиною передчасного виходу з ладу хроматографічних колонок і пористих мембран, зменшення швидкості наноносіїв у кровотоку, адсорбції бактерій на контактних лінзах, порушень в роботі приладів, що забезпечують діяльність серцево-судинної системи при різних патологіях. Особливо гостро ця проблема постає при детекції аналітів у комплексних біологічних середовищах афінними сенсорами, що працюють на основі безміткової детекції, зокрема, такими методами, як поверхневий плазмонний резонанс, кварцовий мікробаланс тощо. Біосенсори, здатні до детекції у комплексних біологічних рідинах, можуть бути виготовлені шляхом іммобілізації біорозпізнаючих елементів на поверхні перетворювача, попередньо вкритого біологічно інертним покриттям [1]. Іммобілізація біорецепторів на адсорбційно-інертних покриттях може бути шляхом до детекції аналітів за допомогою біосенсорів у таких комплексних речовинах як плазма та сироватка крові [2]. Метод поверхневого плазмонного резонансу належить до недеструктивних біосенсорних оптичних методів дослідження, що не потребують використання мічених реактивів і дозволяють отримувати інформацію в режимі реального часу. Він базується на вимірюванні зміни показника заломлення середовища в залежності від процесів, що відбуваються поблизу межі розподілу. З кінця 90-х біосенсори на основі ППР широко використовуються для дослідження біомолекулярних взаємодій як в академічних дослідженнях, так і в таких практичних галузях, як медична діагностика, моніторинг навколишнього середовища, безпека харчових продуктів [3]. Для таких перетворювачів важливим є забезпечення на поверхні сенсора умов, сприятливих для функціонування біомолекул, оскільки прямий контакт з поверхнею металу може створювати для них небезпеку денатурації. Тому впровадження пристроїв на основі ППР передбачає розробку процедур формування чутливих поверхонь з відповідними фізико-хімічними властивостями, які з одного боку попереджують денатурацію рецепторних центрів біологічного походження, а з іншого - забезпечують адекватні умови функціонування фізичних перетворювачів [4]. У традиційних методах таких як наприклад імуноферментний аналіз (ІФА), для надання поверхні інертних властивостей використовуються білки, такі як бичачий сироватковий альбумін, овальбумін, білки молочної сироватки тощо [5]. Незважаючи на достатню ефективність, згаданий метод не позбавлений певних недоліків, а саме: він вимагає досить тривалого часу, використання флуоресцентних та інших міток, інтерпретація результатів, отриманих для багатокомпонентних середовищ, може бути неоднозначною. За прототип вибраний спосіб створення інертної біосумісної поверхні, описаний в [6], що включає очистку поверхні та її модифікацію шляхом формування самозбираного моношару меркаптоундецилбромоізобутирату з подальшим створенням на модифікованій поверхні так званих полімерних щіток на основі метакрилату олігоетиленгліколю та подібних речовин. Використаний спосіб робить можливою детекцію біомолекул без застосування флуоресцентних та інших міток у складних багатокомпонентних середовищах, якими є плазма і сироватка крові, рослинні гомогенати. Однак, його використання потребує значних витрат часу на стадії підготовки поверхні, зокрема, формування самозбираного моношару меркаптоундецилбромоізобутирату протікає протягом 24 годин і відбувається у спиртовому розчині, а жорсткі технологічні вимоги, зокрема, необхідність всіляко уникати контакту з водним середовищем, яке негативно впливає на формування полімерних щіток, потреба проводити реакцію полімеризації в присутності азоту та досить висока ціна використовуваних реагентів створюють значні незручності при його використанні. Крім того, меркаптоундецилбромоізобутират належить до екологічно небезпечних речовин, що забруднюють навколишнє середовище. Робота з ним потребує особливої обережності і може бути шкідливою для здоров'я. Це звужуєобласть застосування прототипу. Задачею корисної моделі є формування поверхні біологічно інертного покриття, що перешкоджає неспецифічній адсорбції при суттєвому підвищенні експресності та економічності способу. Поставлена задача вирішується тим, що у способі створення поверхні, інертної до неспецифічної білкової адсорбції, згідно з корисною моделлю, здійснюють очистку поверхні, її модифікацію та промивку; модифікацію поверхні здійснюють шляхом нанесення на неї водного 1 UA 76098 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 розчину тіоціанату калію у концентрації 4,5-5 М протягом 5-10 хв., а промивку здійснюють водою. Тіоціанат є комерційно доступним хімреагентом за розумною ціною, який не являє небезпеки для навколишнього середовища і організму людини. Він легко розчиняється у воді, навіть у великих концентраціях, що робить непотрібним використання спиртових розчинів. Оскільки тіоціанат є малою молекулою з активною сіркою, моношар формується на поверхні швидко, на відміну від прототипу, що суттєво підвищує еспресність способу. Для промивки поверхні достатньо використати воду, що робить його більш зручним у використанні. Попередні експерименти показали, що використання більш низьких, ніж 4,5М, концентрацій реагенту не дає потрібного ефекту, в той час, як у використанні його більш високих концентрацій, ніж 5М немає потреби. Було також показано, що занадто тривалий контакт розчину з поверхнею може спричиняти небажані ефекти, а занадто короткий не дає можливості утворитись достатньо стабільному моношару на поверхні. Тому проміжок часу 5-10 хвилин є оптимальним. ПРИКЛАД. Як приклад конкретного виконання способу, що заявляється, розглянемо спробу неспецифічної іммобілізації соєвого інгібітору трипсину STI на поверхні, модифікованій тіоціанатом калію KNCS у концентрації 5М. STI 100 мкг/мл та KNCS розчиняли у воді безпосередньо перед експериментом. Дослідження проводилися за допомогою скануючого SPR спектрометра "ВіоНеlреr-01" [7]. Скляні пластинки 20 × 20 × 1 mm з тонким (45-55 нм) шаром золота, нанесеним через адгезивний шар хрому (2нм), фіксувалися на підтримуючій скляній призмі за допомогою імерсійної рідини (поліфеніловий ефір), показник заломлення якої близький до показника заломлення скла (1,61) [8]. Виміри здійснювались в стаціонарному режимі. Загальний хід експерименту представлено на кресленні, де на осі абсцис позначено час вимірювання (Time, s), на осі ординат - відгук ППР (Qspr, steps). Очистка поверхні сумішшю НСl/Н2О2/Н2О (15/15/70 об'єму) для видалення можливих органічних забруднювачів здійснювалась безпосередньо в процесі експерименту, модифікацію поверхні чутливого елемента здійснювали водним розчином тіоціанату калію у концентрації 5М протягом 5 хв. Після промивання поверхні сенсора водою в комірку вносився розчин STI. За відсутністю різниці у величині зміни сигналу ППР до і після іммобілізації STI робили висновок про ефективність перешкоджання неспецифічній адсорбції вказаного білка за допомогою обробки поверхні тіоціанатом калію у вказаній концентрації. Було показано, що різниця у величині сигналу до іммобілізації білка і після знаходиться в межах похибки, тобто поверхневий шар білка на такій поверхні не формується. Отже, завдяки нанесенню на поверхню сенсора розчину тіоціанату калію в концентрації 4,55М, формується поверхня, стійка до неспецифічної адсорбції. Таким чином, технічне рішення, що заявляється, повністю вирішує поставлену задачу. Джерела інформації: 1. Rodriguez Emmenegger С, Brynda E., Riedel Т., Sedlakova Z., Houska M, Alles A.B.Interaction of blood plasma with antifouling surfaces // Langmuir. 2009, 25(11), 6328-6333. 2. Sperling C, Houska ML, Brynda E., Streller U., Werner C. In vitro hemocompatibility of albuminheparin multilayer coatings on polyethersulfone prepared by the layer-by-layer technique // J Biomed Mater Res A. 2006, 76(4), 681-689. 3. Piliarik M., Vaisoherova H., Homola J, Surface Plasmon Resonance Biosensing // Methods in Molecular Biology: Biosensors and Biodetection, 2009, Vol. 503, p. 65-88. 4. Snopok B.A., Boltovets P.M., Rowell F J. Effect of the local environment and state of the immobilized ligand on its reaction with a macromolecular receptor // Theoretical and Experimental Chemistry.-2006. - Vol. 42, No. 4, p. 217-223. 5. Lequin R. "Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-lmked immunosorbent assay (ELISA)". Clin. Chem.-2005.-51 (12): 2415-2418. 6. Rodriguez Emmenegger C, Kylian O., Houska M., Brynda E., Artemenko A., Kousal J., Bologna Alles A., Biederman H. Substrat-independent approach to the generation of functional protein resistant surfaces // Biomacromolecules. 2011, 12, 1058-1066. 7. В. Snopok, M. Yurchenko, L. Szekely, G. Klein, E. Kasuba "SPR based immuno-capture approach for in vitro analysis of protein complex formation: mapping of MRS 18-2 binding site on retinoblastoma protein", Anal. Bioanal. Chem. 386, 2063-2073 (2006). 8. G.V.Beketov, Yu.M.Shirshov, O.V.Shynkarenko, V.I.Chegel "Surface plasmon resonance spectroscopy: prospects of superstate refractive index variation for separate extraction of molecular layer parameters" Sensors and Actuators B. 48, 432-438 (1998). 60 2 UA 76098 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб створення поверхні, інертної до неспецифічної білкової адсорбції, який включає очистку поверхні, її модифікацію та промивку, який відрізняється тим, що модифікацію поверхні здійснюють шляхом нанесення на неї водного розчину тіоціанату калію у концентрації 4,5-5 М протягом 5-10 хв., а промивку здійснюють водою. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3