Тест-система імуноферментна для визначення антитіл проти поверхневих полісахаридів s. aureus

Реферат: Тест-система імуноферментна для визначення антитіл високої специфічності проти поверхневих полісахаридів S. aureus включає виготовлення та очистку антигенного препарату, сорбування їх на полістироловій планшетці, виявлення зв'язаних антитіл за допомогою моноклональних антитіл проти імуноглобулінів людини. Містить адсорбовані полісахариди поверхневих антигенів S. aureus в лунках планшетки для імуноферментного аналізу в кількості 0,2 мкг. UA 79026 U (54) ТЕСТ-СИСТЕМА ІМУНОФЕРМЕНТНА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ ПРОТИ ПОВЕРХНЕВИХ ПОЛІСАХАРИДІВ S. aureus UA 79026 U UA 79026 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до області медицини і імунології і може використовуватись для діагностики, визначення рівня імунологічного захисту, відбору донорів для одержання імунної плазми та специфічного імуноглобуліну проти патогенних стафілококів - збудників сепсису і тяжких інфекцій. Відомий спосіб визначення антитіл (1) за допомогою еритроцитарного діагностикуму - носія загального синегнійного антигену бактерій P.aeruginosa. Спосіб дозволяє визначити антитіла тільки проти загальних антигенів псевдомонад. Але ці антитіла не визначають рівня імунологічного захисту організму в зв'язку зі своєю дією проти внутрішніх антигенів і не є ефективними проти живих бактерій, особливо при тяжких інфекціях та сепсисі. Відома тест-система імуноферментна для визначення антитіл проти грам-негативних бактерій (2), включає виготовлення та очистку антигенного препарату, сорбування його на полістироловій планшетці, виявлення зв'язаних антитіл за допомогою моноклональних антитіл кон'югованих з пероксидазою проти імуноглобулінів людини. Ця система не дозволяє виявляти поверхневі полісахариди S.aureus. В основу корисної моделі поставлена задача створити тест-систему імуноферментну для виявлення антитіл високої специфічності проти поверхневих полісахаридів S.aureus придатну для діагностики наявності подісахаридної капсули у патогенних стафілококів. Застосування тест-системи дозволить підвищити точність етіологічної діагностики інфекційного процесу та здійснювати відбір донорів для одержання імунної плазми та специфічного імуноглобуліну проти патогенних стафілококів. Поставлена задача вирішують тим, що у тест-системі імуноферментній для визначення антитіл високої специфічності проти поверхневих полісахаридів S.aureus, яка включає виготовлення та очистку антигенного препарату, сорбування їх на полістироловій планшетці, виявлення зв'язаних антитіл за допомогою моноклональних антитіл проти імуноглобулінів людини. Новим є те, що містить адсорбовані полісахариди поверхневих антигенів S.aureus, в лунках планшетки для імуноферментного аналізу в кількості 0,2 мкг. Для виготовлення поверхневого полісахариду бактерій S.aureus культуру вирощували на рідкому поживному середовище - МПБ з інгібіторами синтезу протеїну А (пептон, маніт), а також стимуляторів утворення мікрокапсули (глюкози, цукрози, дріжджового екстракту). Культуру вирощували при 37 °C у вигляді шару товщиною 7 мм в плоских бактерійних матрацах 4 доби, центрифугували для осадження бактерій. Із супернатанту осаджували препарат 3 об'ємами етанолу. Діаліз проводили проти дистильованої води впродовж доби, нерозчинний препарат суспендували в фосфатному буфері та звільняли від нуклеїнових кислот і протеїнів. Отриманий первинний препарат розчиняли за допомогою 5 N НСl та нейтралізували 5 N NaOH, очищували тричі переосадженням за допомогою етилового спирту. Препарат діалізували і висушували [3, 4]. Для виявлення досліджуваних антитіл застосовувався кон'югат моноспецифічних ослячих антитіл до імуноглобулінів людини, отриманий в результаті перйодатного зв'язування моноклональних антитіл з пероксидазою хрону. Тест-система має здібність виявляти специфічні імуноглобуліни проти поверхневих антигенів Staphylococcus aureus імуноферментним аналізом в сироватках крові людини. Діючою основою тест-системи являються поверхневі полісахаридні антигени бактерій Staphylococcus aureus, сорбовані на поверхні полістиролових планшетів, внаслідок чого ця поверхня набуває здатності вибирати специфічні антитіла з біологічних рідин. Результати реакції обраховували фотометрично при довжині хвилі 492 нм або візуально. При фотометричному обліку результат рахувався позитивним якщо оптична густина досліджуваної сироватки в 2 і більше разів перевищувала середнє значення ОГ негативного контрольного зразка, яке не повинно перевищувати 0,25 о.о.г. При якісному обліку виникнення жовтого забарвлення у лунках з позитивною контрольною сироваткою (антиген+імуноглобулін+моноклональні антитіла) при безкольоровій рідині в лунках з негативним контролем (антиген) свідчило про позитивну реакцію. Приклад 1. Чутливість тест-системи до антитіл, специфічних до поверхневих антигенів, при застосуванні препарату імуноглобуліну (табл. 1). 1 UA 79026 U Таблиця 1 Антигени Staphylococcu s aureus № 5-16 Staphylococcu s aureus № 7-22 Staphylococcu s aureus № 209 Staphylococcu s aureus № 6-18 Е.соlі-ЛПС Re-гліколіпiд О-антиген (ТХУ) Е.соlі 5 Розведення імуноглобуліну 1:240 1:480 1:960 + + + + + + + + + + 1:120 + + + + 1:1920 Чутливість отриманої тест-системи відповідала титрам антитіл в РПГА з еритроцитарними діагностикумами; щодо необхідної кількості антигенів для дослідження в одній лунці планшету, то відмінність була у 1,5-3 рази. Для виявлення специфічності тест-системи досліджували сироватки крові людини, які не вміщували антитіла проти поверхневих антигенів грам-негативних бактерій, антистафілококовий імуноглобулін, та сироватку крові людини після одужання від стрептококової інфекції. Приклад 2. Специфічність розробленої тест-системи (табл. 2). 10 Таблиця 2 Назва сироваток Анти-Staphylococcus Анти-Staphylococcus Анти-Staphylococcus Анти-Pseudomonas Анти-Streptococcus Без вмісту антитіл проти 15 20 25 30 1:10 + + + + + + 1:30 + + +  + Розведення сироваток 1:120 1:240 1:480 + + + + + + + + + 1:960 + + Специфічність розробленої тест-системи в межах скринінгу донорської сироватки, що відбирається здебільшого при позитивному результаті в розведеннях 1:120-1:480, складає 100 %. Тест-система розрахована на дослідження одночасно 8 сироваток при контролях: 1 антигени+імуноглобулін+моноклональні антитіла, та 2 -антиген бактерій Staphylococcus aureus. Призначення. Створення ІФА тест-системи мало на меті отримання специфічних імуноглобулінів для лікування сепсису, що викликається Staphylococcus aureus, стійкими до антибіотиків, проте вони можуть бути застосовані для визначення антитіл в сироватках крові хворих хірургічних відділень і людей після інфекційних захворювань з загрозою порушень, пов'язаних з надлишком антитіл і імунних комплексів. Джерела інформації: 1. Дяченко В.Ф., Н.Ф. Дзюбан, В.Н. Щетинина. Возможность диагностики, синегнойной инфекции с помощью эритроцмтарного диагностикума - носителя общего синегнойного антигена. В кн.: Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. - М, 12983, с. 146. 2. Патент України № 44895. 3. W. Nimmich. Zur Isolirung und qualitativen Bausteinanalyse der K - Antigene von Klebsiellen// Z. Med. Mikrobiol. Immunol… - 1968. - vol. 154. - p. 117-131. 4. Scott, J.E. Aliphatic Ammonium salts in the Assay of Acidic Polysaccharides from Tissues.// Methods Biochem. Anal.-1960. - vol. 8. - p. 145-197. 074. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Тест-система імуноферментна для визначення антитіл високої специфічності проти поверхневих полісахаридів S. aureus, що включає виготовлення та очистку антигенного препарату, сорбування їх на полістироловій планшетці, виявлення зв'язаних антитіл за допомогою моноклональних антитіл проти імуноглобулінів людини, яка відрізняється тим, що 2 UA 79026 U містить адсорбовані полісахариди поверхневих антигенів S. aureus в лунках планшетки для імуноферментного аналізу в кількості 0,2 мкг. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3