Поживне середовище для виявлення helicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях

Реферат: Поживне середовище для виявлення Helicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях містить сухий ферментативний пептон, агар-агар, воду. Додатково містить суху адаптовану молочну суміш із залізом - Nutrilon при такому співвідношенні компонентів, мас. %: агар-агар 12; сухий ферментативний пептон 8-12; Nutrilon 1-3; вода - решта. UA 88360 U (54) ПОЖИВНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ HELICOBACTER PYLORI ПРИ ШЛУНКОВОКИШКОВИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ UA 88360 U UA 88360 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до медичної мікробіології, ендоскопії та гастроентерології і може бути використана для швидкого виявлення бактерій Helicobacter pylori (H. pylori) в біоптатах слизової оболонки шлунка бактеріологічним методом. Одне з ключових місць серед методів виявлення Н. pylori займає бактеріологічний метод. Культивування Н. pylori необхідне для класифікації і створення колекції штамів, для діагностичних тестів, визначення резистентності до антибіотиків, виробництва антигенів, визначення факторів вірулентності та ін. Однак через вибагливий характер росту Н. pylori для досягнення задовільних результатів культивування необхідне додавання до основ твердих чи рідких поживних середовищ крові чи сироватки [Tonkic A. Epidemiology and Diagnosis of Helicobacter pylori Infection / A. Tonkic, M. Tonkic, P. Lehours, F. Megraud // Helicobacter. - 2012. Vol. 7. - P. 1-8]. У той же час додавання ростових добавок, таких як сироватка чи кров може викликати розбіжності між експериментами завдяки відмінностям якісного складу заготовленої крові між різними партіями. Крім того, при доповненні поживних середовищ сироваткою можна ввести в них забруднюючі білки, які можуть перешкодити подальшій експериментальній процедурі, наприклад, при отриманні антигенів Н. pylori. Є безліч інших недоліків, пов'язаних з використанням сироватки, як ростової добавки, в тому числі різниця в ефективності сприяти формуванню колоній та вимоги зберігання в заморожених чи охолоджених умовах [Исаков В.А. Хеликобактериоз / В.А. Исаков, И.В. Домарадский - М.: Медпрактика-М, 2003. - 411 с.]. Як найближчий аналог можна навести середовище - кров’яний агар, що складається з агарагару, поживного пептону, крові та води і використовується для виявлення Н. pylori в різному посівному матеріалі [Справочник по микробиологическим питательным средам / М. М. Меджидов - М.: Libra, 2003. - 208 с.]. На цьому середовищі через 3-7 днів виростають характерні колонії хелікобактера: округлі, вологі, напівпрозорі, дрібні (0,5-1 мм), з рівними краями. Разом з тим дане середовище має всі вищеперераховані недоліки, що не дає можливості широкого його застосування. В основу корисної моделі поставлена задача створення поживного середовища для виявлення Н. pylori, в якому за рахунок зміни складу інгредієнтів досягається спрощення бактеріологічного методу, уникання недоліків, пов'язаних з використанням крові чи її похідних та зниження вартості посівів. Задачею заявленої корисної моделі є також створення поживного середовища для виявлення Н. pylori, в якому за рахунок нового складу компонентів, їх кількісного співвідношення досягається можливість скоротити тривалість інкубування матеріалу до 2-3 діб. Поставлена задача вирішується тим, що при приготуванні поживного середовища для виявлення Н. pylori замість крові використовують компонент: суху адаптовану молочну суміш із залізом Nutrilon при такому співвідношенні, мас. %: агар-агар 1-2; сухий ферментативний пептон 8-12; Nutrilon 1-3; вода - решта. Для того, щоб виконувати первинні посіви із біопсійного матеріалу, у середовище додатково вносять селективну добавку для пригнічення росту супутньої флори: ванкоміцин (2,5 мг/мл), налідиксова кислота (2,5 мг/мл) і амфотерицин В (0,25 мг/мл) (пункт 2 формули корисної моделі). Введення до складу середовища Nutrilon активізує ріст хелікобактера, збагачує його тригліцеридами, лінолевою кислотою, альфа-ліноленовою кислотою та залізом, яких недостатньо у ферментативному пептоні. Вони є необхідними для обмінних процесів мікробної клітини і утворення колоній на даному поживному середовищі. Концентрація поживних речовин у 100 мл готового середовища: лінолева кислота - 26,7-80,1 мг, альфа-ліноленова кислота 4,71-14,13 мг, залізо - 0,08-0,24 мг. Спільною ознакою з аналогом кров'яним агаром є наявність в складі агар-агару і поживного пептону. Відмінною ознакою від аналога кров'яного агару є наявність в складі замість крові складової - Nutrilon, що дозволяє покращити метаболічні процеси у клітинах бактерій і сприяє кращому їх росту при уникненні негативних ефектів застосування крові чи її похідних. Якісний та кількісний вміст усіх компонентів в заявлених складах є необхідним, оптимальним для проявлення їх позитивних властивостей та досягнення технічного результату. В результаті досліджень встановлено, що на середовищі, що використане як найближчий аналог, ріст хелікобактерів з'явився через 3-5 діб, в різних серіях дослідів відмічалась неоднорідність характеру і темпів росту одних і тих же штамів. На запропонованому середовищі через 2 доби після початку термостатування відмічався ріст поодиноких колоній, а на 3-тю добу ріст був максимальним, всі досліджувані штами характеризувались однаковими темпами росту. Корисна модель дозволяє при високому рівні чутливості скоротити термін бактеріологічних досліджень, здешевити та спростити приготування середовища, уникнувши недоліків наявності у середовищі крові чи її похідних. 1 UA 88360 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб виділення Н. руlоrі на запропонованому поживному середовищі здійснювали у наступній послідовності. Для виділення хелікобактера готували поживне середовище, при цьому у нього додавали вищезгадану суміш антибіотиків для пригнічення супутньої мікрофлори з подальшим посівом на поживне середовище. За контрольне брали поживне середовище - кров'яний агар з 5 % овечої крові. Під час ендоскопії брали біоптати слизової оболонки шлунка (тіло та антральний відділ). Біопсійний матеріал гомогенізували в стерильному фосфатному буфері і висівали в чашки Петрі на поживне середовище у дозі 1 мл. Засіяні чашки Петрі розташовували в термостаті кришками догори, термостатували при температурі 37±1 °C протягом 1-10 діб у мікроаерофільних умовах (що досягалось використанням газогенераторних пакетів Genbox microaer, bioMerieux, Франція). Поява росту колоній на 2-5 добу вказує на позитивний результат, а відсутність росту хелікобактерів після 10 діб вважається негативним результатом. Практичне здійснення запропонованих концентрацій інгредієнтів поживного середовища проводилось наступними дослідними серіями. Перша дослідна серія. Досліди проводили при мінімальних концентраціях всіх компонентів поживного середовища, мас. %: агар-агар - 1,0; сухий ферментативний пептон - 8,0; Nutrilon 1,0; вода - решта. Поживне середовище готували розмішуючи компоненти (які попередньо були перемелені в лабораторному млину протягом 10-55 хвилин) в 100 мл очищеної води і кип'ятили 3-5 хвилин до повного розплавлення агару, фільтрували через ватно-марлевий фільтр, розливали у відповідний посуд, стерилізували при температурі 120±1 °C протягом 15 хвилин в автоклаві, після охолодження до 45 °C додавали суміш антибактеріальних препаратів і поживне середовище розливали в асептичних умовах в стерильні чашки Петрі по 20 мл. Через 7-10 хвилин, як правило, проходило застигання середовища, на яке проводили посів. Готове поживне середовище має жовтувате забарвлення з рН 7,2±0,2. Засіяні чашки не перевертали і ставили в термостат при температурі 37±1 °C протягом 10 діб. Облік результатів проводили після 24 годин інкубування в термостаті, а в подальшому щоденно до закінчення строку. В результаті проведених досліджень встановлено, що ріст колоній через 48 години спостерігався на чашках з клінічними ізолятами на запропонованому середовищі. Слід визначити, що після третьої доби з'явився на вищезазначених чашках максимальний ріст, характерний для Н. pylori. На контрольному середовищі максимальний ріст з'являвся на 3-5 добу. Результати досліджень вибраних культур Н. pylori, підтверджує якість вибраних компонентів середовища. Друга серія досліджень. Методика досліджень проводилась по схемі, як в серії 1, але кількість компонентів була середньою в межах зазначених інтервалів. Так для поживного середовища ця кількість складала, мас. % агар-агар - 1,5; сухий ферментативний пептон - 10,0; Nutrilon - 2,0; вода - решта. Результати досліджень в порівнянні з першою серією суттєвої різниці не мали. Третя серія досліджень. Методика досліджень проводилась по схемі, як в серії 1, але кількість компонентів в поживному середовищі була максимальною в межах зазначених інтервалів. Так для поживного середовища ця кількість складала, мас. %: агар-агар - 2,0; сухий ферментативний пептон - 12,0; Nutrilon - 3,0; вода - решта. В результаті досліджень встановлено, що ріст колоній через 48 годин був більш інтенсивний, ніж у серії 1, але максимальний ріст був більш інтенсивний після 3-ї доби. Ріст культур хелікобактерів на контрольному середовищі спостерігався на 3-7 добу. Таким чином, запропоноване поживне середовище просте за способом його приготування, скорочує термін дослідження, зручне при виготовленні та зберіганні, не потребує роботи з кров'ю чи її похідними, є нешкідливим для працівників лабораторій, та не викликає екологічного забруднення зовнішнього середовища. Всі компоненти заявлених складових продаються в Україні, що є досить зручним для виробничих, науково-дослідних лабораторій медичного профілю. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Поживне середовище для виявлення Helicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях, що містить сухий ферментативний пептон, агар-агар, воду, яке відрізняється тим, що воно додатково містить суху адаптовану молочну суміш із залізом - Nutrilon при такому 2 UA 88360 U співвідношенні компонентів, мас. %: агар-агар 1-2; сухий ферментативний пептон 8-12; Nutrilon 1-3; вода - решта. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3