Спосіб очистки нуклеїнових кислот з біологічних об’єктів

Реферат: Спосіб очистки нуклеїнових кислот з біологічних об'єктів, що включає синтез магнітного силікатного адсорбенту, лізис клітин, адсорбцію нуклеїнових кислот на поверхні магнітного силікатного адсорбенту, промивку від домішок та елюцію нуклеїнових кислот в низькосольовий розчин. Для лізису клітин використовують гексадецилпіридиній хлорид. Як магнітний силікатний адсорбент використовують частки магнетиту покриті SiO 2, з масою поверхневого шару SiO2 50,0-75,0 % від загальної маси адсорбенту. UA 89521 U (12) UA 89521 U UA 89521 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до способів очистки нуклеїнових кислот (ДНК та РНК) з біологічних об'єктів, тваринного та рослинного походження. Запропонований спосіб може бути використаний в галузі експериментальної молекулярної біології, біохімії та медицині. Відомі способи очистки нуклеїнових кислот (НК), які включають руйнування клітин, одночасний лізис клітин, адсорбцію НК на силікатному сорбенті, промивку від домішок та елюцію НК в низькосольовий буфер [1, 2]. Недоліками наведеного способу є використання центрифугування та немагнітних силікатних часток, що призводить до значного збільшення часу очистки НК. Відомі способи очистки НК, які включають лізис клітин, адсорбцію НК на магнітному силікатному сорбенті, промивку від продуктів лізису та елюцію НК в низькосольовий буфер [3, 4, 5]. Недоліками наведених способів є використання часток сорбенту з високою дисперсністю по розміру (0,02-15 мкм), забрудненість сорбенту іонами Fe, що заважають спектрофотометричному аналізу НК, оскільки також дають піки в діапазоні 260-280 нм (НК - 260 нм), тривалий час проведення виділення цільового матеріалу. Найбільш близьким способом, який застосовують за тим же призначенням, що і заявлений, є спосіб який включає синтез магнітного силікатного адсорбенту, лізис клітин, адсорбцію НК на поверхні магнітного силікатного адсорбенту, промивку від домішок та елюцію НК в низькосольовий розчин [6]. Зазначений спосіб вибраний як прототип. Причини, які перешкоджають одержанню технічного результату для ефективної очистки НК з біологічного матеріалу на основі силікатних магнітних сорбентів, в зазначеному прототипі, є використання як прекурсору для покриття магнітних часток діоксидом кремнію (SiO2) силікату натрію, що підвищує час синтезу магнітного сорбенту, в способі не використовується поверхнево-активна речовина (ПАВ), який поряд з гуанідінтіоціанатом (ГТЦ) додатково сприяє денатурації білкової маси, що призводить до підвищення чистоті цільового матеріалу ДНК. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення відомих способів для забезпечення істотного підвищення чистоти та швидкості очистки НК з біологічних об'єктів. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб очистки НК з біологічних об'єктів, включає синтез магнітного силікатного адсорбенту, лізис клітин, адсорбцію НК на поверхні магнітного силікатного адсорбенту, промивку від домішок та елюцію нуклеїнових кислот в низькосольовий розчин, згідно з корисною моделлю, для лізису клітин використовують гексадецилпіридиній хлорид (ГДПХ), а як магнітний силікатний адсорбент використовують частки магнетиту покриті SiO2, з масою поверхневого шару SiO2 50,0-75,0 % від загальної маси адсорбенту, при цьому як прекурсор для покриття магнітних часток діоксидом кремнію використовують алкоксисилан. Саме поєднання наведених відомих ознак і сукупність суттєвих ознак способу, що заявляється, забезпечує істотне підвищення чистоти та швидкості очистки НК шляхом синтезу магнітного силікатного сорбенту, лізисом біологічного матеріалу, адсорбцією НК на поверхні магнітного силікатного адсорбенту, промивкою від домішок та елюцією НК в низькосольовий розчин. Таким чином, підвищення чистоти та швидкості очистки НК, здійснюють за рахунок використання в лізуючому буфері ГДПХ та ГТЦ, зменшення кількості стадій синтезу адсорбенту, при підвищенні його якості, та зменшенні часу очистки НК в способі, що заявляється за рахунок використання адсорбенту з магніточутливим ядром. Перевагами даного способу очистки НК являється одержання високоочищеного препарату НК, вільного від інгібіторів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), що забезпечує більш високу аналітичну чутливість в порівнянні зі способами, які використовують немагнітний сорбент, або магніточутливий адсорбент синтезований за іншими способами, вищий процент виходу цільних НК, здешевлення апаратної бази (використання недорогого магнітного штативу в порівнянні з високооборотною центрифугою), зменшення тривалості аналізу без втрати якості очистки НК. Очистка НК на основі силікатних сорбентів базується на властивості нуклеїнових кислот зв'язуватися з поверхнею силікатного сорбенту в буферних розчинах хаотропних агентів високої концентрації. Хаотропний агент в комплексі з введеним в розчин ПАВ одночасно виконують лізуючу функцію при виділенні НК з біологічного матеріалу. Після чого НК десорбують в воду або низькосольовий буфер. Відомо різні способи одержання магнітного адсорбенту та очистки НК на основі силікатних сорбентів. Одержання адсорбенту включає синтез магнітного компоненту (Fe, Ni, Co, Fe3O4, γ - Fe2O3), нанесення шару (SiO2) на його поверхню з використанням різних прекурсорів (силікат натрію, тетраетоксисилан, тетраметоксисилан) та різними способами нанесення функціонального шару на поверхню магнітного матеріалу. Вважається, що для ефективної очистки НК з біологічного матеріалу оптимальний середній розмір часток адсорбенту має знаходитись в межах 0,5-2 мкм. 1 UA 89521 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Спосіб, що заявляється може бути реалізований наступним чином. Запропонований спосіб очистки НК включає лізуючий буфер з ГТЦ, ГДПХ для лізису клітин, солюбілізації клітинного дебрису, а також денатурації клітинних нуклеаз, адсорбцію НК у високосольовому буфері (рН = 8,5) на магнітному силікатному сорбенті; сольовий буфер для промивки від домішок нецільового біологічного матеріалу; екстрагуючий низькосольовий буфер; магніточутливий адсорбент на основі магнетиту (Fe3O4) з вмістом SiO2 50-75 % на поверхні Fe3O4. Практична реалізація способу, що заявляється, який включає адсорбцію НК в буферах з високими концентраціями хаотропного агенту на магнітному силікатному сорбенті, промивку його від продуктів лізису та елюцію нуклеїнових кислот в низькосольовому буфері, як сорбент використовують силікатний магнітний матеріал з розмірами часток в області 0,5-2 мкм, що підвищує питому поверхню адсорбенту, а магніточутливий компонент, що сприяє підвищенню швидкості виділення НК з розчину підтверджує його ефективність. Вихід чистої НК складає 2-6 мкг із 100 мкл гомогенату, в залежності від біологічного матеріалу. Тривалість очистки НК із 2-12 рідких проб складає 25-30 хвилин. Суть способу пояснюється прикладом виконання. Приклади Синтез магнітного силікатного сорбенту проводять наступним чином. Спочатку одержують Fe3O4 за реакцією співосадження розчину дво- і тривалентного заліза у лужному середовищі. Проводять його промивку в 0,5 М соляній кислоті. Далі проводять посадку шару SiO 2 на поверхню Fe3O4 шляхом лужного гідролізу алкоксисилану в спиртовому середовищі в розрахунку на отримання 50-75 % SiO2 на поверхні Fe3O4 від загальної маси адсорбенту. Порошок сорбенту диспергують в деіонізованій, бідистильованій воді шляхом ультразвукової обробки. Далі проводять виділення НК із 100 мкл цільної крові. В пробірку на 1,5 мл вносять 100 мкл досліджуваного зразку, додають 400 мкл лізуючого розчину та 20 мкл суспензії магнітного силікатного сорбенту. Вміст пробірки перемішують протягом 5 хв. в ротаторі при кімнатній температурі. Далі пробірку поміщають в магнітний штатив на 15 сек., при цьому обережно видаляють прозорий супернатант і добавляють 200 мкл лізуючого розчину та 1 мл буферу для відмивки. Далі перемішують вміст пробірки не виймаючи її з лунок магнітного штативу. Знову видаляють прозорий супернатант та добавляють 1 мл буферу для відмивки. Наведену процедуру перемішування повторюють ще один раз. Далі видаляють прозорий супернатант та просушують в твердотілому термостаті при температурі 65 °C протягом 2-3 хв. Добавляють в пробірку 100 мкл буферу для елюції НК та термостатують 5 хв. при температурі 65 °C. Переносять прозорий супернатант з виділеною НК в чисту пробірку. Для оцінки виділеної ДНК проводять електрофорез в агарозному гелі (0,7 %), електроліт - ТВЕ (1 %), при U=100 В, початкова І = 55 мА, флуоресцентний барвник - бромистий етидій, маркер ДНК - GeneRuler 1 kb DNA Ladder. Приклад 2 Виділення НК проводять за способом як описано в прикладі 1, але як біологічний матеріал використовують зіскоб букального епітелію. Приклад 3 Виділення НК проводять за способом як описано в прикладі 1, але як біологічний матеріал використовують гомогенат рослинного матеріалу. На кресленні зображена електрофореграмма: 1 - ДНК із цільної крові; 2 - ДНК із зіскобу букального епітелію; 3 - ДНК із гомогенату рослинного матеріалу; 4 - маркер ДНК. Джерела інформації: 1. Патент РФ № 2119954, опуб. 10.10.1998. 2. Патент Україна № 16192, опуб. 17.07.2006, бюл. № 7. 3. Патент США № 6027945, опуб. 22.02.2000. 4. Патент США № 6284470, опуб. 04.09.2001. 5. Патент США № 8017332, опуб. 13.09.2011. 6. Патент США № 6368800, опуб. 09.04.2002. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб очистки нуклеїнових кислот з біологічних об'єктів, що включає синтез магнітного силікатного адсорбенту, лізис клітин, адсорбцію нуклеїнових кислот на поверхні магнітного силікатного адсорбенту, промивку від домішок та елюцію нуклеїнових кислот в низькосольовий розчин, який відрізняється тим, що для лізису клітин використовують гексадецилпіридиній хлорид, а як магнітний силікатний адсорбент використовують частки магнетиту покриті SiO 2, з 2 UA 89521 U масою поверхневого шару SiO2 50,0-75,0 % від загальної маси адсорбенту, при цьому як прекурсор використовують алкоксисилан. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3