Спосіб одержання вуглеводвмісних біополімерів-мімікринів

Реферат: Спосіб одержання вуглеводвмісних біополімерів - мімікринів полягає у вирощуванні бактерій в культуральному середовищі, осадженні клітин бактерій. З культурального середовища після вирощування бактерій виділяють осад шляхом трикратного осадження етанолом з подальшим кип'ятінням розчиненого осаду і очищенням на колонці методом гель-фільтрації. Потім за допомогою афінної хроматографії з використанням сефарози з пришитим імуноглобуліном до гемаглютиніну вірусу грипу отримують імунологічну споріднену гемаглютинінподібну структуру – мімікрин. UA 89522 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ВУГЛЕВОДВМІСНИХ БІОПОЛІМЕРІВ-МІМІКРИНІВ UA 89522 U UA 89522 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії, ветеринарії та медицини і може бути використана для отримання вуглеводвмісних біополімерів - мімікринів. В останні роки досить активно проводяться дослідження, пов'язані з вивченням різних аспектів антигенної мімікрії, тобто наявності у різних гомологічних чи негомологічних білкових або нуклеотидних структур ділянок, які містять тотожні послідовності. На підставі досі накопиченої інформації про структуру й функції ряду вірусних білків встановлено, що вони містять специфічні послідовності, гомологічні ендогенним регуляторним пептидам або білкам макроорганізму. Хвороботворні бактерії долають тканинні бар'єри макроорганізму шляхом контакту з поверхневими структурами клітин оскільки на поверхні бактерій є фрагменти молекул, подібні до зв'язуючих сайтів деяких фізіологічно активних сполук хазяїна. Вважають, що молекулярна мімікрія у збудників посилила міжвидове розмаїття молекул, причетних до захисту хазяїв проти вірусів та інших мікробів. З іншого боку, патогенні мікроорганізми здатні протистояти захисним антитілозалежним реакціям хазяїна, використовуючи деякі механізми молекулярної мімікрії. Нами попередньо було показано [1], що деякі бактерії виділяють в культуральне середовище сполуки, які інгібують нейрамінідазну активність вірусів грипу і парагрипу. Ці сполуки були названі нейрамінінами, а потім мімікринами за їх здатність перехресно реагувати з різними антитілами. Спосіб отримання нейрамінінів з бактерій полягав у вирощуванні їх в культуральному середовищі, осадженні клітин шляхом центрифугування з подальшою екстракцією речовин з надосадкової рідини етанолом і осадженням цих речовин центрифугуванням. Але отримані за способом нейрамініни містили багато домішок, які зменшували специфічність реакції. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу одержання вуглеводвмісних біополімерів - мімікринів, в якому за рахунок нових дій по виділенню осаду з культурального середовища після вирощування бактерій та нових дій режимів та речовин по його обробці забезпечується отримання гемаглютинінподібної структури - мімікрину. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання вуглеводвмісних біополімерів мімікринів включає вирощування бактерій в культуральному середовищі, осадженні клітин бактерій. Новим у способі є те, що з культурального середовища після вирощування бактерій виділяють осад шляхом трикратного осадження етанолом з подальшим кип'ятінням розчиненого осаду і очищенням на колонці методом гель-фільтрації, а потім за допомогою афінної хроматографії з використанням сефарози з пришитим імуноглобуліном до гемаглютиніну вірусу грипу отримують імунологічну споріднену гемаглютинінподібну структуру мімікрин. В конкретних варіантах реалізації способу для вирощування застосовують клітини бактерій роду Staphylococcus aureus, або Bacillus subtills. Застосування таких клітини бактерій покращує структуру отримуваного мімікрину. В конкретних варіантах реалізації способу після трикратного осадження етанолом подальше кип'ятіння розчиненого осаду здійснюють протягом 10 хв. Суть корисної моделі пояснює графічне зображення, на якому показана перехресна взаємодія моноклональних антитіл до гемаглютиніну ГА-1 вірусу грипу H1N1 і фракцією 13 мімікрину в імуноблоті: 1 - ГА-1 з моноклональних антитіл (МКА) проти вірусу грипу H1N1; 2 - фракція 13 мімікрину з МКА проти вірусу грипу H1N1; 3 - негативний контроль. Приклад Після культивування мікроорганізмів мадосадкову рідину, яку отримували після центрифугування при 8000 об/хв. протягом 30 хв., змішували з етиловим спиртом в об'ємах 1:1,5 (культура:спирт) і етанолову преципітацію продовжували протягом 12 год. при 4 °C. Осад після екстракції відмивали 60 % етиловим спиртом, знову центрифугували за тих же умов, що описані вище, і отриманий осад розчиняли у 10 мл фосфатного буферу. Таку етанолову преципітацію проводили тричі. Преципітат, розчинений в буферному розчині, кип'ятили протягом 10 хв. і осад видаляли центрифугуванням при 10000 об/хв. протягом 20 хв. Надосадкову рідину, яка містить мімікрини наносили на колонку сефарози з пришитими антитілами проти гемаглютиніну (ГА) вірусу грипу в концентрації 1 МГ/МЛ і зв'язування здійснювали при 4 °С протягом 1 год. Ацетатним буфером 0,01 Μ відмивали незв'язані компоненти препарату, а потім ацетатним буфером градієнтної молярності елюювали препарат. Фракції препарату, одержані методом афінної хроматографії, досліджували на спектрофотометрі і визначали їх антигемаглютинуючу активність по взаємодії з сироватками до 1 UA 89522 U ГА і мімікрину (МІ), а також нейраміпідазну активність препаратів. Гемаглютинінподібна структура - мімікрин була eлюїована 0,5 Μ ацетатним буфером (таблиця 1). Таблиця 1 Характеристика фракцій після афінної хроматографії № фракції 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 5 10 оптична густина 280 0 0 0,2±0,006 0,6±0,018 1,0±0,03 0,6±0,018 0,3±0,01 0,090±,001 0,03±0,01 0,010±,003 0,005±0,001 0,1±0,003 0,2±0,006 оптична густина 230 0 0 0,4±0,013 1,0±0,03 1,6±0,48 1,0±0,3 0,6±0,018 0,25±0,019 0,09±0,027 0,05±0,015 0,04±0,012 0,15±0,04 2,0±0,6 Фракції зняті з колонки по різному реагували з сироватками до гемаглютиніну та мімікрину. Фракції 3, 4 та 7, 8 не взаємодіяли з сироваткою до гемаглютинінів ГА-1 та ГА-3. Фракція 13 реагувала з моноклональними антитілами проти ГА-1 в імуноферментному аналізі та імуноблоті. Методом імуноблоту з моноклональними антитілами до вірусу грипу H 1N1 та сироваткою до гемаглютинінподібної структури мімікрину з фракції 13 одержано характерне фарбування, що свідчить про перехресну взаємодію антитіл до грипу і мімікрину (Фіг. 1). Антинейрамнідазну активність визначали по здатності фракцій мімікрину пригнічувати нейрамінізадну активність вірусу грипу (таблиця 2). Таблиця 2 Визначення антинейрамінідазної активності фракцій мімікрину № фракції оптична густина 549 1 Контроль вірусу 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2 1,2+0,036 0,8±0,024 0,4±0,012 0,1±0,003 0,25±0,075 0,3±0,009 0,5±0,015 0,7±0,021 0,8±0,024 0,85±0,025 1,4±0.042 0,45±0,013 0,3±0,009 Нейрамінідаза (%) активність інгібіція 3 4 100 0 66,4±1,99 33,6±1,01 33,2±0,996 66,8±2,004 8,3±0,249 91,7±2,75 20,75±0,623 79,25±2,378 24,9±0,747 75,1±2,25 41,5±1,245 48,5±1,46 58,1±1,745 41,9±1,26 66,4±1,99 33,6±1,008 70,55±2,117 29,45±0,884 117±3,51 + 17±0,51 37,35±1,121 62,65±1,88 24,9±0,747 75,1±2,253 15 20 Як видно з таблиці 2, фракції препарату мімікрину 3, 4, 5, 12 та 13 на 60-90 % пригнічували нейрамінідазну активність вірусу грипу. Препарат 7 фракції дещо збільшував її. За амінокислотним складом фракції препарату кількісно відрізнялися один від одного. Так, у вихідному препараті мімікрину золотистого стафілококу були відсутні аргінін, цистеїн, а в препаратах з фракцій 3, 5, 7, 13 спостерігалася відсутність проліну, метіоніну та тирозину. Моносахаридний склад у всіх фракціях мімікрину представлений глюкозою та манозою, але 2 UA 89522 U 5 співвідношення цих компонентів було різним. В препараті з фракції 3 співвідношення глюкози та манози становило 16:1, фракції 5 0,5:17, в 7-ої - 14:22, у 13 - вуглеводний компонент повністю був відсутній. Таким чином, методом афінної хроматографії з використанням сефарози з пришитим імуноглобуліном до гемаглютиніну (ГА) вірусу грипу отримана гемаглютинінподібна структура мімікрин. Джерела інформації: 1. Авторское свидетельство № 924949 от 04.10.1982. Способ получения ингибитора нейраминидазы // Фролов А.Ф., Шапиро А.В., Рыбалко СЛ. и др. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 1. Спосіб одержання вуглеводвмісних біополімерів - мімікринів, який полягає у вирощуванні бактерій в культуральному середовищі, осадженні клітин бактерій, який відрізняється тим, що з культурального середовища після вирощування бактерій виділяють осад шляхом трикратного осадження етанолом з подальшим кип'ятінням розчиненого осаду і очищенням на колонці методом гель-фільтрації, а потім за допомогою афінної хроматографії з використанням сефарози з пришитим імуноглобуліном до гемаглютиніну вірусу грипу отримують імунологічну споріднену гемаглютинінподібну структуру - мімікрин. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що для вирощування застосовують клітини бактерій роду Staphylococcus aureus або Bacillus subtilis. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що після трикратного осадження етанолом подальше кип'ятіння розчиненого осаду здійснюють протягом 10 хв. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3