Спосіб стабілізації протипухлинних засобів на основі водного розчину сполуки платини з дезоксирибонуклеїновою кислотою

1. Спосіб стабілізації протипухлинних засобів на основі водного розчину сполуки платини з дезоксирибонуклеїновою кислотою (Pt-ДНК), який відрізняється тим, що в як стабілізуючий агент використовують суміш основи фторурацилу з C2 2 (11) 1 3 ступає іон платини, координований такими лігандами-носіями, які поглинаються пухлинними клітинами практично так само інтенсивно, як і нормальними. Тому засоби, що містять цисплатин, характеризуються не тільки високою протипухлинною активністю, але й високою токсичністю. Не менш активними, але значно менш токсичними є протипухлинні засоби, які базуються на водному розчині полімерного комплексу платини з дезоксирібонуклеїновою кислотою (Pt-ДНК). Цей комплекс представляє собою продукт реакції цисплатину та ДНК, в якому один із лігандів-носіїв іону платини є нуклеотидом, вбудованим в структуру двохнитчатих спіралей макромолекул ДНК, які інтенсивно поглинаються тільки пухлинними клітинами, що швидко розмножуються і, як наслідок, протипухлинні засоби, що містять сполуку PtДНК, з високим ступенем вибірковості вражають пухлинні тканини при несуттєвому враженні нормальних тканин [Лечение неоперабельних опухолей органов брюшной полости. С.А.Шалимов и др.1998, стр.103]. Мономерний комплекс цисплатин та полімерний комплекс Pt-ДНК, які є основними речовинами в засобах, недостатньо розчинні і хімічно нестабільні в воді, тому в засоби, які створені на їх водних розчинах, вводять фармацевтичні добавки. В якості добавок використовують фармакологічно прийнятні солі, регулятори рН і інші стабілізуючі агенти, переважно такі, які за рахунок власної біологічної активності, яка виявляється одночасно зі здатністю підвищувати розчинність та хімічну стійкість основної речовини, дозволяють забезпечити ефективність лікування при кращій переносимості. Відомий спосіб стабілізації протипухлинного засобу на основі водного розчину цисплатину з концентрацією 0,1-1,0мг/мл, в якому використовують натрій хлористий в кількості 1-20мг/мл, соляну кислоту до рН2,0-3,0 та маніт (діуретик) в кількості 2-150мг/мл [Пат. СССР 1192596 А, публ. 15.11.85]. Відомі водні розчини сполуки Pt-ДНК, стабілізовані натрієм хлористим та натрієм лимоннокислим (засобом, що попереджує згортання крові) в кількостях, які відповідають мольному співвідношенню платини, фосфору ДНК, натрію хлористого та натрію лимоннокислого 4:6:30:3 [Пат. України 60597, публ.15.07.05; 61543, публ. 15.08.05; 66476 А, публ. 17.05.04]. Найбільш ефективні і найменш токсичні з відомих протипухлинних засобів на основі водного розчину сполуки Pt-ДНК стабілізують натрієм хлористим, натрієм лимоннокислим, амонієм хлористим (засобом, що викликає відхаркуючу дію і підсилює дію діуретиків) та додатково стабілізуючим агентом, який являє собою натрієву сіль фторурацилу, при співвідношенні компонентів в розчині, мас.%. сполука Pt-ДНК 0,130-0,153 натрій хлористий 0,080-0,090 натрій лимоннокислий 0,040-0,053 амоній хлористий 0,015-0,018 натрієва сіль фторурацилу 0,025-0,370. [Пат. України 70456, публ. 15.10.05]. 90233 4 Натрієва сіль фторурацилу підсилює протипухлинний та послаблює токсичний ефекти основної речовини, так як вона має здатність виступати, як в ролі модулятора фармакологічної дії макромолекул Pt-ДНК в організмі, так і в ролі стабілізатора концентрації макромолекул Pt-ДНК в водному розчині засобу. Проте водний розчин сполуки Pt-ДНК в відомих засобах має рН6,5-7,5, при якому використання натрієвої солі фторурацилу дозволяє стабілізувати концентрацію Pt-ДНК в розчині при температурі вище 35°С. Зниження температури сприяє виділенню з розчину макромолекул сполуки Pt-ДНК в вигляді пухкого осаду та натрієвої солі фторурацилу в вигляді кристалів основи фторурацилу, що викликає зменшення концентрації основної речовини та стабілізуючого агенту в розчині дозованої лікарської форми засобу і негативно впливає на його протипухлинну активність і терапевтичну ефективність. Крім того, випадання осаду обмежує умови зберігання таких препаратів і можливість їх транспортування з метою їх реалізації в аптечній мережі. До того ж вказаний недолік обмежує застосування водних препаратів Pt-ДНК місцевими аплікаціями та внутрішньоочеревинними інфузіями, виключаючи внутрішньовенні та внутрішньоартеріальні інфузії, ендолімфатичні ін'єкції та інтерстиціальний шлях введення. Задача винаходу полягає в створенні способу стабілізації протипухлинних засобів на основі водного розчину комплексу Pt-ДНК. Така стабілізація забезпечить підвищену вибіркову специфічну дію комплексу Pt-ДНК та його підвищену терапевтичну ефективність. Також будуть забезпечені розширені умови зберігання засобів та розширений діапазон їх застосування, при яких макромолекули вказаного комплексу не виділяються з розчину в вигляді осаду при температурах нижче 35°С. Поставлена задача вирішується за рахунок використання в якості стабілізатора суміші основи фторурацилу, урацилу та сечовини, а також за рахунок використання розчину з пониженою концентрацією протонів. В відповідності з винаходом для стабілізації протипухлинних засобів на основі водного розчину сполуки платини з дезоксирібонуклеїновою кислотою, які додатково можуть вміщувати натрій хлористий, натрій лимоннокислий та амоній хлористий або будь-які інші прийнятні розчинники та наповнювачі, в якості стабілізуючого агенту використовують суміш основи фторурацилу з урацилом та сечовиною в мольному співвідношенні PtДНК, основи фторурацилу, урацилу та сечовини, що складає 1:(6-12):(0,6-1,2):(0,6-1,2), при зниженні концентрації протонів в розчині до рН8,49,9. В складі засобу макромолекули Pt-ДНК можуть вміщувати одну з ДНК, виділену з природних джерел або синтезованих методами генної інженерії з молекулярною масою, не обмежуючись цим, 0,3-20млн. дальтон. Для доведення рН розчину в засобах до 8,49,9 використовують обо гідроксид натрію, або 5 гідроксид калію, або гідроксид амонію, або якийнебудь інший фармакологічно прийнятний регулятор рН. Відоме використання основи фторурацилу як структурного фрагменту тегафуру - попередника фторурацилу в організмі - для виготовлення протипухлинної композиції, яка вміщує тегафур та урацил в мольному співвідношенні 1:4 [Пат. США 5534513]. Відоме використання сечовини як діуретика, кератолітика, засобу, що знижує внутрішньочерепний та внутрішньочний тиск [М.М. Туркевич. Фармацевтична хімія, 1973, стор.45], а також як ексціпієнта, який добавляють в тверді дозовані лікарські форми для перорального введення. Відоме застосування високих концентрацій сечовини і підвищення рН більше, ніж до 11, для розкручування спіралізованих нитей природної двох-ланцюгової ДHК [А.Ленинджер. Биохимия. 1976, стр.737]. Про використання основи фторурацилу, урацилу та сечовини окремо або в вигляді суміші, а також про використання регуляторів рН в якості агентів, які перешкоджають виділенню з розчину макромолекулярних сполук металів з ДНК в вигляді осаду, в рівні техніки відомості відсутні. Також не відомо про використання сечовини в дозованих лікарських формах для панентерального введення. Ефективні інтервали концентрацій і співвідношення основної речовини і солей в водному розчині, стабілізованому за способом, що заявляється, відповідають концентраціям і співвідношенням, встановленим при розробці відомого способу одержання сполуки Pt-ДНК в водному розчині для внутрішньо-очеревинних, внутрішньовенних та внутрішньо артеріальних інфузій, які мають pH6,6-7,5 і видержуються при температурі 35-40°С. Інтервали концентрацій основи фторурацилу, урацилу та сечовини детерміновані мольним співвідношенням нуклеотиду Pt-ДНК, 90233 6 основи фторурацилу, урацилу та сечовини, що складає 1:(6-12):(0,6-1,2):(0,6-1,2). Інтервали концентрації регулятора pH обмежені знизу значеннями, які виключають можливість кристалізації основи фторурацилу, а зверху - фармацевтичними вимогами. Запропонований спосіб стабілізації не дозволяє виділятися з розчину макромолекулам PtДНК та молекулам основи фторурацилу, що в свою чергу забезпечує отримання протипухлинних засобів з такими концентраціями компонентів, які не змінюються в їх дозованих лікарських формах при температурі витримування готового продукту в інтервалі 25-5°С при тривалому зберіганні. Спосіб стабілізації, що заявляється, був застосований в технології одержання протипухлинних засобів, перелікованих в таблиці 1, які відрізнялися один від одного природою ДНК, що передувала сполуці Pt-ДНК. На практиці спосіб стабілізації протипухлинних засобів здійснювали наступним чином. В водний розчин, який вміщував сполуку Pt-ДНК, натрій хлористий, натрій лимоннокислий, амоній хлористий, вводили водний розчин додаткового стабілізуючого агенту, що містив суміш основи фторурацилу, урацилу та сечовини. Одночасно разом з водним розчином стабілізуючого агенту додатково вводили водний розчин регулятора pH, який вміщує натрію гідроксид до pH11-12, яким в розчині цільового засобу pH доводили до 8,4-9,9. Конкретні умови способу стабілізації протипухлинних засобів, наведених в таблиці 1, із зазначенням кількості вихідних компонентів в розчині основної речовини, в розчині додаткового стабілізуючого агенту і в розчині регулятора pH наведені в таблиці 2, де приклади 1-9 стосуються способу, що заявляється, а приклади 10 і 11 відомого способу. Таблиця 1 №протипухлинного засобу 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Характеристика ДНК-попередниці сполуки Pt-ДНК Співвідношення Молекулярна A T Походження маса, млн. дальтон Г Ц Генно-інженерна ДНК філадельфійської хромосоми 1,38 0,3-0,5 Молоки лососевих и осетрових риб 1,43 0,3-0,5 Селезінка щура 1,43 3-4 Селезінка великої рогатої худоби, марки Б 1,36 4-7 Селезінка поросяти, марки Б 1,43 5-6 Пухлина печінки людини 1,54 18-20 Лейкозна пухлина Швеця щура 1,04 17-18 Селезінка великої рогатої худоби, марки А 1,36 7-14 Селезінка поросяти, марки А 1,43 12-16 Позначення в таблиці: А - аденін, Т - тімін, Г - гуанін, Ц - цитозін. 7 90233 8 Таблица 2 Умови виконання способу Кількість вихідних компонентів, г/л №протипухлинного №прикладу в розчині стабілізуючого аге- в розчині резасобу в розчині основної речовини нта гулятора рН Pt-ДНК NaCI Na3Cyt NH4Cl NaFu Fu Ura Urea NaOH 1 1 1,30 0,83 0,53 0,17 2,75 0,236 0,127 0,75 2 2 1,53 0,87 0,50 0,15 3,23 0,255 0,149 0,73 3 3 1,48 0,80 0,46 0,18 3,12 0,224 0,132 0,80 4 4 1,50 0,90 0,48 0,15 2.38 0,205 0,122 0,63 5 5 1,30 0,85 0,45 0,16 2,06 0,158 0,106 0,68 6 6 1,30 0,80 0,40 0,15 1,37 0,118 0,063 0,60 7 7 1,40 0,85 0,46 0,16 1,47 0,147 0,080 0,70 8 8 1,53 0,90 0,53 0,18 1,62 0,139 0,099 0,80 9 9 1,48 0,88 0,42 0,17 2,34 0,157 0,108 0,75 10 8 1,50 0,90 0,50 0,18 1,89 11 9 1,48 0,80 0,53 0,15 1,82 Позначення в таблиці: NaCI - натрій хлористий; Na3Cyt - натрій лимоннокислий; NH4Cl - амоній хлористий; NaFu - натрієва сіль фторурацилу; Fu - основа фторурацилу; Ura - урацил; Urea - сечовина; NaOH натрію гідроксид. Характеристики способу, що заявляється, в залежності від умов виконання та температури витримування засобу порівнювали з характеристиками відомого способу по даним, наведеним в таблиці 3, де приклади 1-9 стосуються способу, що заявляється, а приклади 10 і 11 - відомого способу. Таблица 3 №проти- температура №прикладу пухлинного витризасобу мування засобу,°С 1 1 25 2 2 20 3 3 20 4 4 15 5 5 10 6 6 5 7 7 5 8 20 8 8 15 8 10 9 15 9 9 10 9 5 8 38 10 8 15 9 38 11 9 10 Характеристика способу концентрація компонентів в розчині засобу,мг/мл Мольне співвідNaOH до ношення нуклеPtNaCI Na3Cyt NH4Cl NaFu Fu досяг- отиду Pt-ДНК, ДНК нення рН Fu, Ura i Urea 1,30 0,87 0,53 0,17 2,75 9,5 1:12:1,2:1,2 1,53 0,83 0,50 0,15 3,22 9,4 1:12:1,1:1,2 1,48 0,80 0,46 0,18 3,12 9,8 1:12:1:1,1 1,50 0,90 0,48 0,15 2,37 8,7 1:9:0,9:1,0 1,30 0,85 0,45 0,16 2,05 8,8 1:9:0,8:1,0 1,30 0,80 0,40 0,15 1,37 8,5 1:6:0,6:0,6 1,40 0,84 0,45 0,17 1,47 8,9 1:6:0,7:0,7 1,53 0,90 0,53 0,18 1,62 9,9 1:6:0,6:0,8 1,53 0,87 0,51 0,16 1,62 9,9 1:6:0,6:0,8 1,53 0,90 0,52 0,17 1,62 9,8 1:6:0,6:0,8 1,48 0,88 0,42 0,16 2,32 9,2 1:9:0,7:0,9 1,48 0,87 0,40 0,15 2,32 9,3 1:9:0,7:0,9 1,48 0,88 0,41 0,16 2,32 9,1 1:9:0,7:0,9 1,50 0,90 0,50 0,18 1,89 7,0 1,04 0,90 0,50 0,18 1,47 6,8 1,48 0,85 0,53 0,15 1,82 8,0 0,63 0,85 0,53 0,15 1,19 7,6 Відмінності в характеристиках способу, що заявляється і відомого, підтверджуються різними інтервалами значень рН, виміряними потенціометричне, та відсутністю температурної залежності концентрацій основної речовини і додаткового стабілізуючого агенту, які контролюються методами кількісного аналізу. Відмінності в концентраціях, які виникають при температурі нижче 35°С в відомому способі, підтверджуються в прикладах таблиці зменшенням концентрації сполуки Pt-ДНК від 1,50мг/мл до 1,04мг/мл, тобто на 30,7%, a NaFu від 1,89мг/мл до 1,47мг/мл, тобто на 22% в водному розчині засобу, витриманому при 15°С. При витримуванні засобу біля 10°С концентрація зменшується для Pt-ДНК від 1,48мг/мл до 0,63мг/мл, тобто уже на 57,4%, а для NaFu від 1,82мг/мл до 9 90233 1,19мг/мл, тобто на 34,4%. Концентрації основної речовини і додаткового стабілізуючого агенту в прикладах способу, що заявляється, відповідають концентраціям в розчинах, витриманих при температурах вище 35°С, що підтверджує можливість способу забезпечити умови, при яких макромолекули Pt-ДНК та молекули основи фторурацилу не виділяються з розчину при витримуванні цільового продукту в інтервалі температур 25-5°С. Протипухлинну активність, яку здатні забезпечити засобам спосіб стабілізації, що заявляється, та відомий спосіб, досліджували в тесті цитотоксичності на моделі адаптованих для культивування клітин злоякісної астроцитоми головного мозку людини. Клітини підтримували в поживному середовищі Ігла з додаванням ембріональної телячої сироватки, глюкози та інсуліну при постійному режимі газового складу і температурі 36,5°С в інкубаторі. В період інтенсивного росту клітини конт 10 рольної культури обробляли фізіологічним розчином, а клітини експериментальних культуррозчинами засобів, стабілізованих по способу, що заявляється, і по відомому способу, які попередньо витримували при температурі 10°С. Протипухлинну активність оцінювали по цитотоксичності, яку характеризували відносною по відношенню до контролю кількістю клітин, що загинули через 24 години після обробки засобами. Результати підрахунку відносної кількості клітин, що загинули, поданого в відсотках, наведені в таблиці 4, де під №1 приведені показники контрольної культури клітин, оброблених фізіологічним розчином, під №№2-5 - показники експериментальних культур, оброблених розчинами засобів, стабілізованих по способу, що заявляється, під №6 - показники експериментальної культури, оброблених розчином засобу, стабілізованого по відомому способу. Таблица 4 ТемпеКультура ратура виклітин три№№п/п мування засобу, °С 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 Засіб Фізіологічний розчин Засіб №8, стабілізований по способу в прикладі 8 Засіб №9, стабілізований по способу в прикладі 9 Засіб №5, стабілізований по способу в прикладі 5 Засіб №3, стабілізований по способу в прикладі 3 Засіб №9, стабілізований по способу в прикладі 9 Дані таблиці 4 свідчать про те, що при порівнянні кількісної оцінки протипухлинної активності в тесті цитотоксичності спосіб стабілізації, що заявляється, суттєво перевищує відомий. Витримані при однаковій температурі 10°С та застосовані в однакових об'ємах 0,02мл з однаковими кількостями 1,48мг/мл Pt-ДНК при температурі вище 35°С водні розчини засобу, стабілізованого по відомому способу, після введення в середовище культивування об'ємом 1л створюють-в ній концентрацію основної речовини всього 12,6мг/л, яка викликає загибель тільки 32,2%, тоді як водні розчини засобу, стабілізованого по способу, що заявляється, після введення в середовище культивування створюють в ній концентрацію Pt-ДНК 29,6мг/л, яка викликає загибель 80,4-82,1% клітин. Таким чином, запропонований спосіб стабілізації зберігає високу протипухлинну активність та терапевтичну ефективність засобів на основі водного розчину сполуки Pt-ДНК навіть при температурах 25-5°С, що значно спрощує його зберігання, Комп’ютерна верстка Т. Чепелева Кількість мл Концентрація Відсоток засобу на Pt-ДНК в клітин, 1л середо- середовищі що загивища кулькультинули ти-вування вування 0,02 1,7 0,02 30,6 86,4 0,02 29,6 80,4 0,02 26,0 78,8 0,02 29,6 82,1 0,02 12,6 32,2 транспортування та розширює можливості використання. Протипухлинні засоби, стабілізовані по способу, що заявляється, можуть бути використані в різних дозованих формах. Досвід клінічного застосування протипухлинних засобів, стабілізованих по способу, що заявляється, показав, що їх використання в дозованих формах, як для внутрішньо очеревинного і місцевого шляхів введення, так і для внутрішньовенного, внутрішньо артеріального, ендолімфатичного та інтерстиціального, підвищує ефективність терапії первинних та метастатичних пухлин, локалізованих в області голови, шиї, легень, нирок, органів травлення та опорно-рухового апарату. Підвищення ефективності виражається в збільшенні тривалості життя хворих та покращання якості їх життя, як під час проведення курсів лікування, так і в віддалений після лікування період часу. При цьому яких-небудь тяжких клінічних або лабораторних проявів побічних ефектів у хворих не було виявлено. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601