Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника альтернаріозу роду alternaria (nees) аналізом пероксидази

Реферат: Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника альтернаріозу аналізом пероксидази, що включає зараження бульб картоплі інокулюмом збудника хвороби і їх аналіз. Із різних за групою стиглості сортів картоплі виділяють пероксидазу, визначають її активність, та підбирають стійкі до даного захворювання сорти. UA 97683 U (12) UA 97683 U UA 97683 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від негативної дії шкідливих організмів. В сільському господарстві відомий метод інфрачервоної мікроскопії для діагностики ушкодження і стійкості зернових до шкідників [3]. В картоплярстві відомі польові та лабораторні способи визначення стійкості сортів картоплі до збудника альтернаріозу роду Alternaria (Nees) [7]. Польовий спосіб визначення стійкості картоплі заснований на безпосередньому зараженні рослин картоплі спорами грибів роду Alternaria (Nees), та вивчається у природних польових умовах. Протягом вегетаційного періоду, після сходів починається прояв симптомів хвороби і відповідно здійснюють облік уражених зразків картоплі [7]. Лабораторний спосіб включає в себе зараження паростків та бульб картоплі інокулюмом чистої культури (найближчий аналог) [1,5, 9, 10]. Спосіб за найближчим аналогом, полягає в тому, що він включає в себе зараження бульб картоплі інокулюмом збудника альтернаріозу. Після 49 днів проводився облік реакції рослим на внесення культури патогену. Згадані способи та спосіб-найближчий аналог мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. Їх використання пов'язане з витратами часу, який займає цілий вегетаційний період розвитку рослин картоплі та патогену. 3. Їх використання потребує зараження зразків картоплі збудником альтернаріозу, що є збудником шкодочинного захворювання і потребує суворого дотримання правил роботи з даним організмом. В основу корисної моделі поставлена задача: розробити спосіб визначення стійкості картоплі до збудника альтернаріозу шляхом аналізу пероксидази різних за стиглістю сортів картоплі. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі шляхом виділення ферментів з різних за стійкістю до хвороби сортів картоплі, із наступним аналізом ферментативної активності пероксидази виявлена вища активність у стійких сортів картоплі, тому даним способом можна відібрати стійкі сорти картоплі до збудника альтернаріозу роду Altemaria (Nees). 1. Запропонований спосіб дозволяє визначити стійкість за значно коротший термін часу - 1 день (при застосуванні аналогу - протягом 49 днів). 2. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що шляхом аналізу пероксидази вдається відібрати стійкі до альтернаріозу сорти картоплі. ПРИКЛАДИ ЗДІЙСНЕННЯ СПОСОБІВ. Приклад 1. Для дослідницької роботи використовують різні за стиглістю сорти картоплі: Загадка, Скарбниця, Фантазія, Світанок Київський, Віринея, Лугівська, Поліське Джерело, Червона Рута. Зразки бульб сортів картоплі заражують, вносячи інокулюм збудника альтернаріозу (двотижнева культура патогену на картопляно-глюкозному агарі) шприцом на глибину 10 мм. Інокульовані бульби зберігались протягом 6-7 тижнів при 25-30 °C до прояву захворювання, по закінченні даного терміну проводять облік уражених рослин картоплі. Ступінь ураження визначали на основі оцінки кожної окремої бульби, за даною шкалою: Бал ураження 0 0,1-1 2-3 4-5 Розвиток хвороби, % 0 5-10 20-30 50 45 50 Статистичну обробку даних проводили за Масловим Ю.І. [8]. В результаті проведених досліджень, ступінь ураження сортів картоплі: Скарбниця та Загадка склав 5 балів, сорт Світанок Київський - 4 бали, сорти Фантазія та Віринея - 3 бали, Лугівська - 2 бали, а сорти Поліське Джерело та Червона Рута - 1 бал. Отримані результати представлено в таблиці. 1 UA 97683 U Таблиця Активність пероксидази сортів картоплі та їх ступінь стійкості до збудника альтернаріозу Ступінь стійкості бульб (найближчий аналог) 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8 2 Загадка Скарбниця Фантазія Світанок Київський Віринея Лугівська Поліське Джерело Червона Рута Кількість уражених бульб 3 5 5 5 4 3 2 1 1 4 5 5 5 5 5 5 0 0 Активність пероксидази. (М±m) (Спосіб, що заявляється) 5 34,3±0,25 24,3±0,06 18,7±0,46 14,15±0,11 15,9±0,19 10,7±0,03 10,1±0,15 4,39±0,13 НІР  0,6 Примітка. 1, 2, 3 - ступінь ураження зразків картоплі збудником альтернаріозу 5 10 15 20 25 30 35 Приклад 2. Як і у прикладі 1 використовували різні за групою стиглості сорти картоплі. Для визначення активності, з окисно-відновних ферментів відібрали пероксидазу, яка приймає участь в окислювально-відновлювальних реакціях фотосинтезу, в процесах дихання, метаболізмі білків і регулюванні процесів росту, детоксикації перекису водню, катаболізмі фенольних сполук, в утворенні супероксидного радикалу О 2 , руйнуванні високо активного радикалу ОН в реакціях з Н2О2. Фермент приймає участь в утворенні фітоімунітету. Це дає підставу назвати пероксидазу „аварійним" ферментом [4. 6]. 3 5г паросткової частини бульб виділяють екстракт шляхом розтирання з 5 мл трис-боратного буферу (рН 7,8) та центрифугуванням за 6000 об./хв. протягом 10 хвилин. Для визначення пероксидазної активності 1 мл екстракту інкубують з 1 мл 0,1 % розчином Н2О2 та забарвлюють 0,01 % розчином бензидину протягом 5-10 хвилин до появи блакитного забарвлення. Визначають величину екстинкції на спектрофотометрі "Ломо-46" за 600 нм. Активність пероксидази визначали за формулою: А = EK/t за методом Бояркіна A.M. [2], де: А - активність ферменту (у мкмоль бензидину х 100/1 г.хв.); Е - величина екстинкції; К - коефіцієнт пропускання світла при 600 нм; t - час інкубації ферменту з субстратом та прояви забарвлення. В результаті проведеної науково-дослідницької роботи встановлено, що сорти картоплі різних груп стиглості, володіють різною стійкістю до альтернаріозу. Якщо у стійких сортів картоплі, активність коливалась у межах 4,39-10,1 то у сприйнятливих вона склала 24,3-34,3 мкмоль/1 г хв. За такою ознакою можна відібрати стійкі до альтернаріозу сорти картоплі. У сортів картоплі "Скарбниця" та "Загадка", що відносяться до групи ранніх сортів. спостерігався високий ступінь ураження (5 балів), і їх активність пероксидази коливалась у межах 24,3-34,3 мкмоль/1 г хв (додаток 1, таблиця 1). Таким чином, шляхом визначення активності пероксидази сортів картоплі, вдається визначити їх ступінь стійкості до патогену. Процес визначення активності пероксидази 8 зразків картоплі до альтернаріозу на спектрофотометрі при 600 нм склав 1 годину, а способом зараження - внесенням інокулюму (найближчий аналог)- 49 днів. Запропонований спосіб визначення стійкості картоплі до альтернаріозу було підтверджено експериментальною перевіркою, яка здійснювалась при ураженні патогеном сортів, отриманих і Інституту картоплярства НААН України. Джерела інформації: 1. Андреева В. А. Фермент пероксидаза. - М.: Наука, 1988. - 128 с 2. Бояркин A.M. Определение активности пероксидазы. /Биохимия.-1961. - Вып. 34. С. 628632. 2 UA 97683 U 5 10 15 20 3. Вилкова Н.А., Шапиро И.Д., Борщева Т.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок к клопам. В сб. Методы исследований патологических изменений растений. -М: Колос, 1976. - С. 216-219. 4. Витол И.С. Использование пероксидазы и глютомат дегидрогеназы в качестве биохимических маркеров в биотехнологических исследованиях на картофеле. Витол И.С, Мелик-Саркисов B.C., Аветисов В.Ы., Дубровский И.Г//Доклады ВАСХНИЛ. 1989. - №10. - С. 1415. 5. Ермаков А. И. Методы биохимического исследования растения. Л.: Агропромиздат, 1987. - 430 с. 6. Капустин А.В. Фермент пероксидаза - універсальний маркер зимостійкості рослин //Інтродукція рослин, 2000. № 1. - С. 152-154. 7. Кононученко В.В. Методичні рекомендації щодо проведення досліджень і картоплею. / В.В. Кононученко - Немішаєве, 2002. - 183 с. 8. Маслов Ю.И. Методы биохимического анализа растений. - М.: Колос, 1978. - 338 с. 9. Патент України на корисну модель № 17048 МКВ А01С1/00 від 15.09.2006р. Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника рак. Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perс. /Зеля А.Г., Костишин С.С, Мельник П.О., Тома З.Г., Барбакар М.1. заявл. 16.02.2006 р., опубл. 15.09.2006р. // Офіційний бюлетень. Промислова власність, Бюл. № 9. - С. 78. 10. Починок Х.Н. Методы биохимического анализа растений. Х.Н. Починок. - Киев: Наукова думка, 1979. - С. 166-169. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника альтернаріозу аналізом пероксидази, що включає зараження бульб картоплі інокулюмом збудника хвороби і їх аналіз, який відрізняється тим, що із різних за групою стиглості сортів картоплі виділяють пероксидазу, визначають її активність, та підбирають стійкі до даного захворювання сорти. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3