Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини, що включає виділення еритроцитів, додавання кріозахисного розчину, швидке заморожування до мінус 196 °C, відтавання та відмивання від кріопротекторів, який відрізняється тим, що як кріозахисний розчин використовують суміш кріопротекторів - полівінілпіролідону і диметилсульфоксиду у співвідношенні 2:1, відмивання здійснюють у 2 цикли.

Текст

Реферат: Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини включає виділення еритроцитів, додавання кріозахисного розчину, швидке заморожування до мінус 196 °C, відтавання та відмивання від кріопротекторів. Як кріозахисний розчин використовують суміш кріопротекторів - полівінілпіролідону і диметилсульфоксиду у співвідношенні 2:1, відмивання здійснюють у 2 цикли. UA 97815 U (12) UA 97815 U UA 97815 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі консервування тканин та клітин людини і може бути використана для довгострокового зберігання та створення банку еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини при наднизькій температурі рідкого азоту (мінус 196 °C). Відомі способи кріоконсервування еритроцитів крові людини [1, 2, 3]. Недоліками способів [1, 2] є тривалий процес додавання до еритроконцентрату перед заморожуванням кріопротекторного розчину, що містить 30 % оксіетильованого гліцерину. Вадою способу [3] є недостатньо високі показники збереження еритроцитів під захистом кріопротекторного розчину полівінілпіролідону (ПВП) - полімерної речовини, що не проникає всередину клітини. Найближчим аналогом є спосіб швидкого заморожування еритроцитів людини при температурі рідкого азоту мінус 196 °C з кріоконсервантом, що містить 40 % гліцерину [4]. Спосіб включає отримання еритроцитів з крові, заготовленої на одному з глюкозо-нітратних розчинів. До еритроцитарної маси повільно (протягом 5-8 хвилин) при помішуванні додають розчин кріопротектора у співвідношенні 1:1, проводять 15-20-и хвилинну еквілібрацію при кімнатній температурі (для повної гліцеринізації еритроцитів) та заморожують шляхом занурення ємності з еритроцитами у рідкий азот. Після відтаювання проводять триразове відмивання клітин від гліцерину розчинами з концентрацією інгредієнтів, що послідовно знижується від гіпертонічної до ізотонічної (починаючи з 4 % натрію хлориду). До недоліків способу слід віднести трудомісткість виконання процедур, великі витрати кріопротектора та розчинів для дегліцеринізації (процедури видалення кріопротектора з розморожених клітин шляхом центрифугування з розчинами речовин, що не проникають до клітини, при зниженні їх концентрації від гіпертонічної до ізотонічної). Багаторазові процедури центрифугування мають негативний вплив на кінцеві якісні характеристики еритроцитарної маси. Задачею корисної моделі є підвищити збереженість еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини, кріоконсервованих при температурі рідкого азоту (мінус 196 °C), та спростити технологію розморожування. Вирішення задачі полягає у застосуванні суміші обволікаючого - ПВП і проникаючого диметилсульфоксид (ДМСО) кріопротекторів у співвідношенні 2:1 та зменшенні кількості циклів відмивання еритроцитів після розморожування. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. Концентрат еритроцитів отримують з пуповинної/плацентарної крові людини, заготовленої на гемоконсерванті ЦФДА-1. До нього при температурі оточуючого середовища 20-24 °C додають кріопротекторний розчин, основними діючими речовинами якого є низькомолекулярний ПВП в концентрації 20 % та ДМСО - 10 %, у співвідношенні еритроцитарного концентрату та кріопротекторного розчину 1:1 (об'єм до об'єму). Після відтаювання процедуру відмивання проводять у 2 цикли (шляхом дворазового центрифугування з сольовими розчинами, концентрація яких послідовно знижується від гіпертонічної до ізотонічної, починаючи з 2 % натрію хлориду). Приклад 1. До еритроконцентрату за прототипом повільно додавали у співвідношенні 1:1 (об'єм до об'єму) 40 %-й розчин гліцерину. Після 15-и хвилинної еквілібрації суспензію переносили у кріопробірки та швидко заморожували до температури мінус 196 °C шляхом занурення у рідкий азот. Після відігрівання на водяній бані при температурі 40 °C протягом 30 сек. еритроцити відмивали тричі шляхом центрифугування з розчинами хлориду натрію послідовно у концентраціях 4 %, 2 % і 0,9 %. Відмиті еритроцити ресуспендували у 0,9 % розчині хлориду натрію. Приклад 2. До еритроконцентрату за способом, що заявляється, повільно додавали у співвідношенні 1:1 (об'єм до об'єму) розчин кріопротекторів, що містить ПВП у концентрації 20 % і ДМСО у концентрації 10 %. Після 15-и хвилинної еквілібрації суспензію переносили у кріопробірки та швидко заморожували до температури мінус 196 °C шляхом занурення у рідкий азот. Після відігрівання на водяній бані при температурі 40 °C протягом 30 сек. еритроцити відмивали двічі шляхом центрифугування з розчинами хлориду натрію послідовно у концентраціях 2 % і 0,9 %. Відмиті еритроцити ресуспендували у 0,9 % розчині хлориду натрію. Оцінку способів проводили шляхом аналізу показників якості: гематокриту (Ht) зразків, осмотичної резистентності еритроцитів, вмісту вільного гемоглобіну (Hb v), а також продуктів перекисного окислення фосфоліпідів (за концентрацією ізольованих подвійних зв'язків (ІПЗ), кон'югатів - дієнових (ДК), триєнових (ТК), оксодієнових (ОДК) та кінцевих продуктів ПОЛ типу шифових основ (ШО)), які відображають зміни стану мембран еритроцитів у процесі заморожування-відтаювання [5]. Відтворення процедур за прикладами 1 і 2 проводили паралельно. У таблиці представлені результати оцінки якості еритроцитарної маси, кріоконсервованої за способом та прототипом. 60 1 UA 97815 U Таблиця № Приклад досліду 1 2 3 4 5 6 7 І II І II І II І II І II І II І II Ht ОРЕ, % Hbv, г/л 0,50 0,80 0,50 0,50 0,51 0,46 0,32 0,38 0,51 0,42 0,42 0,42 0,42 0,44 73,8 77,6 72,0 79,0 83,0 81,0 57,0 74,0 80,2 57,5 52,0 74,1 67,0 59,0 3,909 1,168 5,790 1,775 3,989 1,262 1,438 0,351 6,668 3,368 1,613 0,548 4,597 1,395 ІПЗ -1,668 -4,206 -1,926 -3,585 -0,919 -1,216 -1,104 -1,444 -2,054 -5,510 -2,763 -5,783 -0,403 -1,340 Δ показників перекисного окислення фосфоліпідів, Од.: ДК ТК ОДК -0,239 -0,310 -0,142 -5,619 -0,780 -0,531 -0,635 -0,817 -0,498 -6,195 -0,980 -0,664 -0,009 -0,023 0,019 -3,138 -0,158 -0,125 -0,278 -0,255 -0,157 -2,256 -0,348 -0,224 -0,182 -0,423 -0,192 -6,210 -0,587 -0,373 -0,693 -0,537 -0,342 -6,830 -0,759 -0,522 -0,050 -0,310 -0,160 -1,505 -0,556 -0,321 ШО -0,024 -0,027 -0,124 0,018 0,096 0,031 -0,028 0,060 0,120 0,120 -0,233 -0,257 -0,100 0,017 Примітки: І - найближчий аналог; II - спосіб, що заявляється; ΟΡΕ - осмотична резистентність еритроцитів у 0,45 % розчині NaCl; Δ - різниця показників до заморожування та після розморожування; (-Δ) - означає зниження показника після розморожування; ІПЗ - ізольовані подвійні зв'язки; ДК - дієнові кон'югати; ТК - триєнові кон'югати; ОДК - оксодієнові кон'югати; ШО - кінцеві продукти ПОЛ типу шифових основ; Ht - гематокрит; Hbv - вільний гемоглобін. 5 10 15 20 Представлені в таблиці результати вказують на підвищення якості розмороженої еритроцитарної маси при застосуванні суміші кріопротекторів різного механізму дії. Так, спостерігається суттєве зменшення показників вільного гемоглобіну, субстратів перекисного окислення ліпідів (за показниками ІПЗ) і продуктів перекисного окислення фосфоліпідів (за показниками ДК, ТК, ОДК та ШО). Це свідчить про покращення структурно-функціональних характеристик мембран клітин. Низька діюча концентрація ДМСО - 5 % дозволяє скоротити та спростити стадію видалення кріозахисних речовин. Джерела інформації: 6 1. Пат. UA № 24710, МПК A01N 1/02 Спосіб кріоконсервування еритроцитів /Грищенко В.І., Компанісц A.M., Ніколенко О.В. та ін.; ІПКіК ПАНУ - № U200702420, заявл. 05.03.2007; опубл. 10.07.2007, Бюл. № 10, 2007 р. 6 2. Пат. UA № 37636, МПК A01N 1/00 Спосіб кріоконсервування еритроцитів кордової крові людини /Грищенко В.І., Цуцаєва А.О., Ніколенко О.В. та ін.; ІПКІК НАНУ - № u200805743, заявл. 05.05.2008; опубл. 10.12.2008, Бюл. № 23, 2008 р. 3. Криоконсервирование эритроцитов глибоким замораживанием при применении низкомолекулярного поливинилпирролидона /Лаврик С.С., Полубояринова А.Г., Кушко О.В. и др. //Пробемы гематологи и переливання крови. - 1973. - 18, № 9. - С. 15-19. 4. Инструкция по криоконсервированию клеток крови. Утв. МИНЗДРАВОМ РФ 29.05.1995 г. 5. Белоус A.M. Криобиология /Белоус A.M., Грищенко В.И. К.: Наукова думка, 1994. - 431 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини, що включає виділення еритроцитів, додавання кріозахисного розчину, швидке заморожування до мінус 196 °C, відтавання та відмивання від кріопротекторів, який відрізняється тим, що як кріозахисний розчин використовують суміш кріопротекторів - полівінілпіролідону і диметилсульфоксиду у співвідношенні 2:1, відмивання здійснюють у 2 цикли. 2 UA 97815 U Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Kalynychenko Tetiana Oleksiivna, Anoshyna Militina Yuriivna, Hlukhen'ka Halyna Tymofiivna, Alhazinova Marharyta Kostiantynivna

Автори російською

Калиниченко Татьяна Алексеевна, Аношина Милитина Юрьевна, Глухенькая Галина Тимофеевна, Алгазинова Маргарита Константиновна

МПК / Мітки

МПК: A61K 35/14, A01N 1/02

Мітки: еритроцитів, кріоконсервування, крові, спосіб, людини

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/5-97815-sposib-kriokonservuvannya-eritrocitiv-pupovinno-placentarno-krovi-lyudini.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини</a>

Подібні патенти