Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини
Номер патенту: 97815
Опубліковано: 10.04.2015
Автори: Калиниченко Тетяна Олексіївна, Глухенька Галина Тимофіївна, Алгазінова Маргарита Костянтинівна, Аношина Милитина Юріївна
Формула / Реферат
Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини, що включає виділення еритроцитів, додавання кріозахисного розчину, швидке заморожування до мінус 196 °C, відтавання та відмивання від кріопротекторів, який відрізняється тим, що як кріозахисний розчин використовують суміш кріопротекторів - полівінілпіролідону і диметилсульфоксиду у співвідношенні 2:1, відмивання здійснюють у 2 цикли.
Текст
Реферат: Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини включає виділення еритроцитів, додавання кріозахисного розчину, швидке заморожування до мінус 196 °C, відтавання та відмивання від кріопротекторів. Як кріозахисний розчин використовують суміш кріопротекторів - полівінілпіролідону і диметилсульфоксиду у співвідношенні 2:1, відмивання здійснюють у 2 цикли. UA 97815 U (12) UA 97815 U UA 97815 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі консервування тканин та клітин людини і може бути використана для довгострокового зберігання та створення банку еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини при наднизькій температурі рідкого азоту (мінус 196 °C). Відомі способи кріоконсервування еритроцитів крові людини [1, 2, 3]. Недоліками способів [1, 2] є тривалий процес додавання до еритроконцентрату перед заморожуванням кріопротекторного розчину, що містить 30 % оксіетильованого гліцерину. Вадою способу [3] є недостатньо високі показники збереження еритроцитів під захистом кріопротекторного розчину полівінілпіролідону (ПВП) - полімерної речовини, що не проникає всередину клітини. Найближчим аналогом є спосіб швидкого заморожування еритроцитів людини при температурі рідкого азоту мінус 196 °C з кріоконсервантом, що містить 40 % гліцерину [4]. Спосіб включає отримання еритроцитів з крові, заготовленої на одному з глюкозо-нітратних розчинів. До еритроцитарної маси повільно (протягом 5-8 хвилин) при помішуванні додають розчин кріопротектора у співвідношенні 1:1, проводять 15-20-и хвилинну еквілібрацію при кімнатній температурі (для повної гліцеринізації еритроцитів) та заморожують шляхом занурення ємності з еритроцитами у рідкий азот. Після відтаювання проводять триразове відмивання клітин від гліцерину розчинами з концентрацією інгредієнтів, що послідовно знижується від гіпертонічної до ізотонічної (починаючи з 4 % натрію хлориду). До недоліків способу слід віднести трудомісткість виконання процедур, великі витрати кріопротектора та розчинів для дегліцеринізації (процедури видалення кріопротектора з розморожених клітин шляхом центрифугування з розчинами речовин, що не проникають до клітини, при зниженні їх концентрації від гіпертонічної до ізотонічної). Багаторазові процедури центрифугування мають негативний вплив на кінцеві якісні характеристики еритроцитарної маси. Задачею корисної моделі є підвищити збереженість еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини, кріоконсервованих при температурі рідкого азоту (мінус 196 °C), та спростити технологію розморожування. Вирішення задачі полягає у застосуванні суміші обволікаючого - ПВП і проникаючого диметилсульфоксид (ДМСО) кріопротекторів у співвідношенні 2:1 та зменшенні кількості циклів відмивання еритроцитів після розморожування. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. Концентрат еритроцитів отримують з пуповинної/плацентарної крові людини, заготовленої на гемоконсерванті ЦФДА-1. До нього при температурі оточуючого середовища 20-24 °C додають кріопротекторний розчин, основними діючими речовинами якого є низькомолекулярний ПВП в концентрації 20 % та ДМСО - 10 %, у співвідношенні еритроцитарного концентрату та кріопротекторного розчину 1:1 (об'єм до об'єму). Після відтаювання процедуру відмивання проводять у 2 цикли (шляхом дворазового центрифугування з сольовими розчинами, концентрація яких послідовно знижується від гіпертонічної до ізотонічної, починаючи з 2 % натрію хлориду). Приклад 1. До еритроконцентрату за прототипом повільно додавали у співвідношенні 1:1 (об'єм до об'єму) 40 %-й розчин гліцерину. Після 15-и хвилинної еквілібрації суспензію переносили у кріопробірки та швидко заморожували до температури мінус 196 °C шляхом занурення у рідкий азот. Після відігрівання на водяній бані при температурі 40 °C протягом 30 сек. еритроцити відмивали тричі шляхом центрифугування з розчинами хлориду натрію послідовно у концентраціях 4 %, 2 % і 0,9 %. Відмиті еритроцити ресуспендували у 0,9 % розчині хлориду натрію. Приклад 2. До еритроконцентрату за способом, що заявляється, повільно додавали у співвідношенні 1:1 (об'єм до об'єму) розчин кріопротекторів, що містить ПВП у концентрації 20 % і ДМСО у концентрації 10 %. Після 15-и хвилинної еквілібрації суспензію переносили у кріопробірки та швидко заморожували до температури мінус 196 °C шляхом занурення у рідкий азот. Після відігрівання на водяній бані при температурі 40 °C протягом 30 сек. еритроцити відмивали двічі шляхом центрифугування з розчинами хлориду натрію послідовно у концентраціях 2 % і 0,9 %. Відмиті еритроцити ресуспендували у 0,9 % розчині хлориду натрію. Оцінку способів проводили шляхом аналізу показників якості: гематокриту (Ht) зразків, осмотичної резистентності еритроцитів, вмісту вільного гемоглобіну (Hb v), а також продуктів перекисного окислення фосфоліпідів (за концентрацією ізольованих подвійних зв'язків (ІПЗ), кон'югатів - дієнових (ДК), триєнових (ТК), оксодієнових (ОДК) та кінцевих продуктів ПОЛ типу шифових основ (ШО)), які відображають зміни стану мембран еритроцитів у процесі заморожування-відтаювання [5]. Відтворення процедур за прикладами 1 і 2 проводили паралельно. У таблиці представлені результати оцінки якості еритроцитарної маси, кріоконсервованої за способом та прототипом. 60 1 UA 97815 U Таблиця № Приклад досліду 1 2 3 4 5 6 7 І II І II І II І II І II І II І II Ht ОРЕ, % Hbv, г/л 0,50 0,80 0,50 0,50 0,51 0,46 0,32 0,38 0,51 0,42 0,42 0,42 0,42 0,44 73,8 77,6 72,0 79,0 83,0 81,0 57,0 74,0 80,2 57,5 52,0 74,1 67,0 59,0 3,909 1,168 5,790 1,775 3,989 1,262 1,438 0,351 6,668 3,368 1,613 0,548 4,597 1,395 ІПЗ -1,668 -4,206 -1,926 -3,585 -0,919 -1,216 -1,104 -1,444 -2,054 -5,510 -2,763 -5,783 -0,403 -1,340 Δ показників перекисного окислення фосфоліпідів, Од.: ДК ТК ОДК -0,239 -0,310 -0,142 -5,619 -0,780 -0,531 -0,635 -0,817 -0,498 -6,195 -0,980 -0,664 -0,009 -0,023 0,019 -3,138 -0,158 -0,125 -0,278 -0,255 -0,157 -2,256 -0,348 -0,224 -0,182 -0,423 -0,192 -6,210 -0,587 -0,373 -0,693 -0,537 -0,342 -6,830 -0,759 -0,522 -0,050 -0,310 -0,160 -1,505 -0,556 -0,321 ШО -0,024 -0,027 -0,124 0,018 0,096 0,031 -0,028 0,060 0,120 0,120 -0,233 -0,257 -0,100 0,017 Примітки: І - найближчий аналог; II - спосіб, що заявляється; ΟΡΕ - осмотична резистентність еритроцитів у 0,45 % розчині NaCl; Δ - різниця показників до заморожування та після розморожування; (-Δ) - означає зниження показника після розморожування; ІПЗ - ізольовані подвійні зв'язки; ДК - дієнові кон'югати; ТК - триєнові кон'югати; ОДК - оксодієнові кон'югати; ШО - кінцеві продукти ПОЛ типу шифових основ; Ht - гематокрит; Hbv - вільний гемоглобін. 5 10 15 20 Представлені в таблиці результати вказують на підвищення якості розмороженої еритроцитарної маси при застосуванні суміші кріопротекторів різного механізму дії. Так, спостерігається суттєве зменшення показників вільного гемоглобіну, субстратів перекисного окислення ліпідів (за показниками ІПЗ) і продуктів перекисного окислення фосфоліпідів (за показниками ДК, ТК, ОДК та ШО). Це свідчить про покращення структурно-функціональних характеристик мембран клітин. Низька діюча концентрація ДМСО - 5 % дозволяє скоротити та спростити стадію видалення кріозахисних речовин. Джерела інформації: 6 1. Пат. UA № 24710, МПК A01N 1/02 Спосіб кріоконсервування еритроцитів /Грищенко В.І., Компанісц A.M., Ніколенко О.В. та ін.; ІПКіК ПАНУ - № U200702420, заявл. 05.03.2007; опубл. 10.07.2007, Бюл. № 10, 2007 р. 6 2. Пат. UA № 37636, МПК A01N 1/00 Спосіб кріоконсервування еритроцитів кордової крові людини /Грищенко В.І., Цуцаєва А.О., Ніколенко О.В. та ін.; ІПКІК НАНУ - № u200805743, заявл. 05.05.2008; опубл. 10.12.2008, Бюл. № 23, 2008 р. 3. Криоконсервирование эритроцитов глибоким замораживанием при применении низкомолекулярного поливинилпирролидона /Лаврик С.С., Полубояринова А.Г., Кушко О.В. и др. //Пробемы гематологи и переливання крови. - 1973. - 18, № 9. - С. 15-19. 4. Инструкция по криоконсервированию клеток крови. Утв. МИНЗДРАВОМ РФ 29.05.1995 г. 5. Белоус A.M. Криобиология /Белоус A.M., Грищенко В.И. К.: Наукова думка, 1994. - 431 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини, що включає виділення еритроцитів, додавання кріозахисного розчину, швидке заморожування до мінус 196 °C, відтавання та відмивання від кріопротекторів, який відрізняється тим, що як кріозахисний розчин використовують суміш кріопротекторів - полівінілпіролідону і диметилсульфоксиду у співвідношенні 2:1, відмивання здійснюють у 2 цикли. 2 UA 97815 U Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3
ДивитисяДодаткова інформація
Автори англійськоюKalynychenko Tetiana Oleksiivna, Anoshyna Militina Yuriivna, Hlukhen'ka Halyna Tymofiivna, Alhazinova Marharyta Kostiantynivna
Автори російськоюКалиниченко Татьяна Алексеевна, Аношина Милитина Юрьевна, Глухенькая Галина Тимофеевна, Алгазинова Маргарита Константиновна
МПК / Мітки
МПК: A61K 35/14, A01N 1/02
Мітки: еритроцитів, кріоконсервування, крові, спосіб, людини
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/5-97815-sposib-kriokonservuvannya-eritrocitiv-pupovinno-placentarno-krovi-lyudini.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб кріоконсервування еритроцитів пуповинної/плацентарної крові людини</a>
Попередній патент: Спосіб виробництва вівсяної крупи
Наступний патент: Мотор-барабан
Випадковий патент: Подрібнювач