Спосіб культивування вірусу скручування листя картоплі в перещеплюваних лініях культур клітин ссавців

Реферат: Винахід належить до вірусології та біотехнології і може бути використаний при проведенні вірусологічних досліджень з метою виділення ізолятів вірусу скручування листя картоплі (ВСЛК) з рослинного матеріалу в чисту культуру, довгострокового зберігання вірусних ізолятів, вивчення фізико-хімічних, біологічних, серологічних властивостей та особливостей репродукції ВСЛК. Спосіб культивування вірусу скручування листя картоплі в перещеплюваних лініях UA 97981 C2 (12) UA 97981 C2 культур клітин ссавців передбачає приготування частково очищеного препарату вірусу шляхом гомогенізації рослин картоплі в фосфатному буферному розчині, емульгування з хлороформом та центрифугування. Деконтамінацію препарату проводять антибіотиками. Отриману суспензію вносять в пробірки з культурою клітин СНЕВ або ВНК-21. Після контакту вірусу з моношаром клітин останній відмивають та вносять підтримуюче середовище. Інокульовані пробірки з культурою клітин інкубують в термостаті до появи ознак цитопатичної дії вірусу. Запропонований винахід дозволяє виділити вірусний ізолят в чисту культуру упродовж 1-5 діб. UA 97981 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до вірусології та біотехнології і може бути використаний при проведенні вірусологічних досліджень з метою виділення ізолятів вірусу скручування листя картоплі (ВСЛК) з рослинного матеріалу в чисту культуру, довгострокового зберігання вірусних ізолятів, вивчення фізико-хімічних, біологічних, серологічних властивостей та особливостей репродукції ВСЛК. Відомо, що вірус скручування листя картоплі - типовий вид роду Polerovirus, має ізометричні віріони діаметром 24 нм з однією позитивною одноланцюговою РНК. В рослинах вірус локалізується у флоемі, передається щепленням та циркулятивно деякими видами попелиць, не передається інокуляцією інфекційним соком. Коло рослин-хазяїнів обмежено. Зустрічається в більшості місць, де вирощується картопля. Належить до економічно важливих вірусів [1]. Відомий спосіб культивування ВСЛК полягає у використанні для його накопичення рослин картоплі або рослин-індикаторів, на які вірус переносять з інфікованих рослин щепленням чи попелицями [2]. Після періоду накопичення, який становить близько 30 діб, листя інфікованих рослин використовують для отримання чистих препаратів ВСЛК. Прототипом може бути спосіб культивування ВСЛК в протопластах мезофілу тютюну або картоплі, який передбачає отримання культури протопластів, інфікування її очищеним і концентрованим препаратом ВСЛК та інкубування протопластів при постійному освітленні й температурі [3]. Строк виконання наведеного способу становить 20-30 діб. Недоліками відомих способів є трудомісткість, тривалий термін виконання, значні матеріальні витрати, які складаються з вартості вирощування рослин в умовах захищеного ґрунту та складного процесу інфікування рослин-індикаторів або отримання і підтримання культури протопластів. В основу винаходу поставлена задача спростити проведення процесу виділення ізоляту ВСЛК в чисту культуру, підвищити економічність і результативність. Поставлена задача досягається шляхом культивування вірусу скручування листя картоплі в перещеплюваних лініях культур клітин ссавців замість рослин картоплі, рослин-індикаторів та культури протопластів. Спосіб культивування вірусу скручування листя картоплі в перещеплюваних лініях культур клітин ссавців, що заявляється, здійснюють наступним чином. Для виділення ВСЛК використовують вегетуючі частини рослин картоплі або бульби. Для гомогенізації зразків застосовують 0,1 М фосфатний буферний розчин з рН 7,4. Отриману суспензію освітлюють емульгуванням з хлороформом у співвідношенні 5:1 та центрифугуванням упродовж 15 хвилин 3 при 2000 g. Деконтамінацію препаратів проводять пеніциліном (400 ОД/см ) і стрептоміцином 3 (200 мкг/см ). Отриману суспензію вносять в пробірки з культурою клітин нирки ембріона свині (СНЕВ) або нирки новонародженого сирійського хом'ячка (ВНК-21). Культуру клітин попередньо культивують з використанням оптимального живильного середовища (суміш із середовища 199 та середовища 0,5 % гідролізату лактальбуміну з додаванням 10 % сироватки ВРХ в співвідношенні 1:1) та тричі відмивають розчином Хенкса [4]. Після контакту вірусу з моношаром клітин упродовж 1 години при температурі 37±0,5 °C видаляють залишки рідини, відмивають моношар та вносять підтримуюче середовище 199. Інокульовані пробірки з культурою клітин інкубують у термостаті при температурі 37±0,5 °C до появи ознак цитопатичної дії вірусу (ЦПД). Інфіковану культуру клітин СНЕВ після появи ознак ЦПД перевірено методом зворотнотранскриптазної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТПЛР) [5]. З віріонної РНК-матриці за допомогою зворотної транскриптази синтезовано вірус-специфічну кДНК, яку потім ампліфікують (багаторазово копіюють). Олігонуклеотидні праймери, які використано для ампліфікації, мають наступні послідовності: sense-5-CgCgCTAACAgAgTTCAgCC, antisense-5'gCAATgggggTCCAACTCAT, та забезпечують при наявності ВСЛК в зразку ампліфікацію продукту ЗТ ПЛР розміром 336 нуклеотидних пар. Після закінчення ампліфікації пробірки зі зразками досліджено стандартним методом електрофорезу в агарозному гелі. На фіг. наведена електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК, яка демонструє наявність специфічної зони розміром 336 нуклеотидних пар та відповідає очікуваній в позитивному контролі та відсутність таких зон в негативних контролях. Отже, ізолят вірусу, який виділено з рослин картоплі, інфікованих ВСЛК, що при культивуванні в перещеплюваній лінії культури клітин СНЕВ виявляє цитопатичну дію, за даними ЗТ ПЛР є вірусом скручування листя картоплі. Наступні приклади наводяться для ілюстрації винаходу, але винахід ними не обмежується. 1 UA 97981 C2 5 10 15 20 25 30 35 Приклад 1. Препаратом ВСЛК, який отримують з листя картоплі сорту Сувенір чернігівський шляхом гомогенізації в 0,1 М фосфатному буфері (рН7,4), освітленням хлороформом у співвідношенні 3 5:1 та центрифугуванням упродовж 15 хвилин при 2000 g, в об'ємі 0,1 см заражають 4-добову культуру СНЕВ на пробірках. Моношар культури клітин тричі відмивають розчином Хенкса. Після контакту вірусу з моношаром клітин упродовж 1 години при 37±0,5 °C обережно видаляють залишки рідини, відмивають моношар та вносять підтримуюче середовище 199. Ознаки цитопатичної дії вірусу з'являються на п'яту добу. Клітини мають округлу форму з включеннями у вигляді дрібних зерен. Пробірки з ЦПД тричі заморожують-розморожують. 3 Пасажування проводять з розрахунку 0,1 см вірусовмісної суспензії на 1 пробірку культури СНЕВ. Ознаки цитопатичної дії вірусу з'являються через добу. Титр накопиченого вірусу 3 становить 5,5 lg ТЦД50/см . Приклад 2. Після адаптації ізоляту ВСЛК до репродукції в клітинах перещеплюваної культури СНЕВ 3 вірусною біомасою в титрі 8,5 lg ТЦД50/см заражають пробірки з моношаром клітин 4-добової 3 культури клітин ВНК-21 по 1000 ТЦД50 на пробірку (0,1 см ). Після годинного контакту і видалення залишків вірусовмісної суспензії, що використовується для інфікування, вносять підтримуюче середовище 199. Після культивування інфікованих клітин ВНК-21 ознаки цитопатичної дії з'являються через 3 добу. Титр накопиченого вірусу становить 6,5 lg TЦД50/см . Таким чином, підтверджено можливість культивування вірусу скручування листя картоплі в перещеплюваних лініях культур клітин ссавців, виділення вірусного ізоляту в чисту культуру упродовж 1-5 діб і зменшення затрат. Джерела інформації: 1. Краев В.Г. Современная классификация и номенклатура вирусов растений (По материалам Международного Комитета по таксономии вирусов) // Мікробіол. журнал.-2001. №2, Т. 63. - С. 20-66. 2. Home page of Description of plant vimses. Potato leafroll vims/ B. D. Harrison/ Scottish Crop Research Institute, Invergowrie, Dundee DD2 5DA, Scotland, UK - Режим доступу: http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=291. - Заголовок з екрану. 3. Н. Barker, В. D. Harrison. Infection of potato mesophyll protoplasts with Five Plant Viruses// Plant Cell Reports-1982 - № 1. -P. 247-249. 4. Рекомендації з діагностики, профілактики та ліквідації тешо-, ентеровірусних енцефаломієлітів свиней / Укладачі: Сорока B.I., Бокун А.О., Дерев'янко С.В. та ін. - Чернігів: Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, 2006.-28 с. 5. Singh R.P., Kurz J., Boiteau G., Bernard G. Detection of potato leafroll virus in single aphids by reverse transcription polymerase chain reaction and its potential epidemiological application // J.Virol. Methods.-1995. - № 55. - P. 133-143. 40 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 Спосіб культивування вірусу скручування листя картоплі в перещеплюваних лініях культур клітин, що включає приготування частково очищеного вірусного препарату з рослинних зразків та культивування вірусу скручування листя картоплі, який відрізняється тим, що культивування проводять в перещеплюваних лініях культур клітин ссавців. 2 UA 97981 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3