Спосіб одержання водорозчинних селеноглікопротеїнів та композиція, що їх містить

Реферат: UA 114082 C2 (12) UA 114082 C2 Винахід стосується способу одержання водорозчинних селеноглікопротеїнів з рН 4,0 та 6,0 залежними фракціями шляхом кислотного гідролізу та композиції, що містять такі селеноглікопротеїни. UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка є частковим продовженням і просить пріоритет заявки на патент Сполучених Штатів Америки серійного номера 13/051646, поданої 18 березня 2011 року, в якій проситься пріоритет попередньої заявки на патент Сполучених Штатів Америки серійного номера 61/315265, поданої 18 березня 2010 року, кожна з яких включена в цей документ шляхом посилання в повному обсязі. ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ Даний винахід відноситься до композицій розчинного селену і способам їх отримання, виділення і очищення. Зокрема, в даному винаході представлені способи отримання водорозчинних селеноглікопротеїнів (наприклад, шляхом екстракції селеноглікопротеїнів із збагачених селеном дріжджів), способи доповнення селенодефіцитної композиції шляхом змішування водорозчинних селеноглікопротеїнів зі вказаною селенодефіцитної композицією, композиції, що включають водорозчинні селеноглікопротеїни, і способи їх введення. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Селен є слідовим елементом, важливим для належної фізіологічної функції організму людини. Селен поглинається з їжі, що містить різну кількість селену. Відомо, що селен відіграє вирішальну роль у підтриманні фізіологічного метаболізму, зростання, репродуктивного здоров'я і імунітету. Селен входить до складу різних органічних молекул, включаючи, наприклад, амінокислоти, такі як 1-селенометіонін, селеноцистеїн і селеноцистин. Тому селен може бути складовою частиною білків, багато з яких є структурно важливими для організму. Більше того, селен є важливим компонентом ряду ферментів, які впливають на метаболізм, репродукцію, запобігання раку і імунний захист у людей (дивись, наприклад, Rayman, M, Lancet 356:233-241 (2000)). У багаточисельних дослідженнях була зроблена спроба виявити потенційну користь для здоров'я, обумовлену застосуванням низьких доз селену. Наприклад, було показано, що низькі концентрації неорганічної форми селену мають деяку потенційно благотворну дію на здоров'я (дивись, наприклад, Furnsinn et al., Int. J of Obesity and Related Metab. Dis., 19, 458-463 (1995)). Проте, при підвищених дозах благотворний вплив змінюється на протилежний, і виникає небезпечна токсичність. Дослідження останніх двох десятиліть дозволяють передбачити, що селен є ефективним для зниження захворюваності на рак, при введенні тваринам у дозах лише в 5-10 разів вище за харчову потребу (дивись, наприклад, El-Bayoumy, The role of selenium in cancer prevention, Philadelphia, Lippincott, 1-15, 1991). Хіміопрофілактичні дослідження з селеном у системах моделей на тваринах показали, що цей елемент ефективний для більшості, якщо не всіх систем органів, і захищає від канцерогенної дії (дивись, наприклад, El-Bayoumy, The role of selenium in cancer prevention, Philadelphia, Lippincott, 1-15, 1991). Епідеміологічні дослідження і випробування з підгодовуваннями також підтверджують його ефективність при зниженні захворюваності на рак печінки, ободової кишки, простати і легенів (дивись, наприклад, Yu et al. Biol Trace Elem Res, 56: 117-124 (1997); Clark et al., J Am Med Assoc, 276: 1957-1963 (1996); Yoshizawa et al., J Natl Cancer Inst, 90: 1219-1224 (1998); Brooks, et al., J Urol, 166: 2034-2038 (2001)). В інших дослідженнях була показана відсутність благотворного впливу зниження селену на ракові захворювання (дивись, наприклад, Garland et al., J. Am. Coll Nutr., 12: 400-11 (1993); Ghadirian et al., Cancer Detect Prev, 24: 305-13 (2000)). Були досліджені багаточисельні форми селену. Вони включають неорганічний селен, такий як селеніт натрію, а також органічні джерела, включаючи селенові дріжджі. Існує значна різниця між токсичністю неорганічного і органічного селену, неорганічні сполуки зазвичай абсорбуються і використовуються менш ефективно, а також є токсичнішими, ніж органічні джерела селену. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід відноситься до розчинних композицій селену і способам їх отримання, виділення і очищення. Зокрема, в даному винаході представлені способи отримання водорозчинних селеноглікопротеїнів (наприклад, шляхом екстракції селеноглікопротеїнів із збагачених селеном дріжджів), способи доповнення селенодефіцитної композиції за рахунок змішування водорозчинних селеноглікопротеїнів зі вказаною селенодефіцитної композицією, композиції, що включають водорозчинні селеноглікопротеїни, і способи їх уведення. Відповідно, в деяких варіантах реалізації в даному винаході представлений спосіб отримання розчинних селеноглікопротеїнів, що включає: забезпечення збагачених селеном дріжджів, дія на збагачені селеном дріжджі кислотних умов з подальшим центрифугуванням для отримання i) осаду, що містить не розчинний у кислому середовищі матеріал; і (ii) рідкої фази, що включає екстракт збагачених селеном дріжджів, розчинний у кислотних умовах; осадження селеноглікопротеїнів з рідкої фази, що містить екстракт збагачених селеном дріжджів, розчинний у кислотних умовах шляхом підвищення рН рідкої фази, і (d) виділення осаджених 1 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 селеноглікопротеїнів з рідкої фази. У деяких варіантах реалізації дія кислотних умов на збагачені селеном дріжджі відбувається при температурі вище кімнатної (наприклад, вище, ніж близько 20-25 °C). Даний винахід не обмежується температурою вище кімнатної, при якій збагачені селеном дріжджі піддаються дії кислотних умов. Дійсно, можуть бути використані різні температури, включаючи, але не обмежуючись цим, близько 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 90, 95, 97, 99 °C або вище). Так само, даний винахід не обмежується кислотними умовами, які впливають на збагачені селеном дріжджі. У деяких варіантах реалізації збагачені селеном дріжджі піддають дії умов, в яких рН складає близько 6,5, близько 6, близько 5,5, близько 5, близько 4,5, близько 4, близько 3,5, близько 3, близько 2,5, близько 2, близько 1,5, близько 1 або менше. У бажаному варіанті реалізації дія на збагачені селеном дріжджі кислотних умов включає дію на збагачені селеном дріжджі рН 1,5. У деяких варіантах реалізації дія на збагачені селеном дріжджі кислотних умов відбувається протягом певного періоду часу. Даний винахід не обмежується часом, протягом якого збагачені селеном дріжджі піддають дії кислотних умов. У деяких варіантах реалізації збагачені селеном дріжджі піддають дії кислотних умов протягом близько 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 або більше годин. У деяких варіантах реалізації збагачені селеном дріжджі піддають дії кислотних умов протягом від одного до двадцяти чотирьох годин. У деяких варіантах реалізації збагачені селеном дріжджі піддають дії кислотних умов протягом від п'яти до десяти годин. У бажаному варіанті реалізації збагачені селеном дріжджі піддають дії кислотних умов протягом близько восьми годин. У деяких варіантах реалізації кислотні умови створюють та/або підтримують за допомогою кислотного буфера та/або додаванням кислоти. Даний винахід не обмежується типом використаної кислоти. Дійсно, може бути використана будь-яка кислота. У деяких варіантах реалізації кислотою є хлороводнева кислота, хоча може бути використана будь-яка кислота. У деяких варіантах реалізації селеноглікопротеїни осаджують з рідкої фази, що включає екстракт збагачених селеном дріжджів, розчинний у кислотних умовах, за рахунок підвищення рН рідкої фази. У деяких варіантах реалізації осаджені селеноглікопротеїни виділяють з рідкої фази центрифугуванням з утворенням осаду осаджених селеноглікопротеїнів з подальшим видаленням рідкої фази з осаженних селеноглікопротеїнів. Даний винахід не обмежується значенням або мірою, до якої підвищують рН екстракту для осадження селеноглікопротеїнів з рідкої фази. У деяких варіантах реалізації рН рідкої фази підвищують до 1,85. У деяких варіантах реалізації рН рідкої фази підвищують до 3,0. У деяких варіантах реалізації рН рідкої фази підвищують до 4,0. У деяких варіантах реалізації рН рідкої фази підвищують до 6,0. У деяких варіантах реалізації селеноглікопротеїни осаджують і виділяють з рідкої фази за різних рН умов для отримання декількох рН різних фракцій розчинних селеноглікопротеїнів. Наприклад, в деяких варіантах реалізації одну рідку фазу, що містить екстракт збагачених селеном дріжджів, розчинний в кислотних умовах, використовують для отримання першої фракції розчинних селеноглікопротеїнів, осаджених при першому рН (наприклад, рН 1,85), другої фракції розчинних селеноглікопротеїнів, осаджених при другому рН (наприклад, рН 3,0), третьої фракції розчинних селеноглікопротеїнів, осаджених при третьому рН (наприклад, рН 4,0), і четвертої фракції розчинних селеноглікопротеїнів, осаджених при четвертому рН (наприклад, рН 6,0). У деяких варіантах реалізації осадження селеноглікопротеїнів з рідкої фази за рахунок підвищення рН рідкої фази включає декілька послідовних рН-залежних реакцій осадження рідкої фази. У деяких варіантах втілення композиція, що включає розчинні селеноглікопротеїни, містить лише одну, рН-залежну фракцію селеноглікопротеїнів (наприклад, розчинних селеноглікопротеїнів з рідкої фази, що містить екстракт збагачених селеном дріжджів, розчинний за кислотних умов, осаджених при рН4,0). У деяких варіантах реалізації композиція, що включає розчинні селеноглікопротеїни, містить дві або більше рН-залежні фракції селеноглікопротеїнів (наприклад, розчинні селеноглікопротеїни з рідкої фази, що включає екстракт збагачених селеном дріжджів, розчинний у кислотних умовах, осаджені при двох або більше різних значеннях рН). У деяких варіантах реалізації збагачені селеном дріжджі висушують, нежиттєздатні збагачені селеном дріжджі містять 2% або менше неорганічного селену. У даному винаході представлені також композиції, що містять розчинні селеноглікопротеїни, отримані відповідно до даного винаходу. Наприклад, в деяких варіантах реалізації в даному винаході представлена селенодефіцитна композиція, що містить розчинні селеноглікопротеїни за даним винаходом. У деяких варіантах реалізації розчинні селеноглікопротеїни за даним винаходом додають та/або змішують з вказаною селенодефіцитної композицією. Даний винахід не обмежується типом селенодефіцитної композиції або матеріалом, до якого додають або з яким змішують розчинні селеноглікопротеїни за даним винаходом, такі композиції або матеріали включають, але не обмежуючись цим, добавки до раціону, ліки, фармацевтичні засоби, харчові 2 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 продукти, тваринні корми і інші типи матеріалів. У деяких варіантах реалізації додавання або змішування (наприклад, домішування) селеноглікопротеїна включає змішування в композицію селеноглікопротеїна і одного або декількох інших типів селену. У деяких варіантах реалізації розчинні селеноглікопротеїни за даним винаходом додають або змішують з композиціями, що містять селен (наприклад, для збільшення та/або поповнення загальної кількості селену). У даному винаході представлена також композиція, що містить розчинні селеноглікопротеїни і носій. У деяких варіантах реалізації селеноглікопротеїни є визначеною рН-залежною фракцією селеноглікопротеїнів. Даний винахід не обмежується типом використаного носія. Дійсно, можуть бути використані різні носії, включаючи, але не обмежуючись цим, дендримери, полімеросоми, наночастки, полімери з повільним вивільненням, нанокапсули та/або молекулярно фіксовані полімери. В одному бажаному варіанті реалізації носієм є полімер з повільним вивільненням. У іншому бажаному варіанті реалізації носієм є молекулярно фіксований полімер. У іншому бажаному варіанті реалізації носієм є полімеросома, що використовується для інкапсуляції селеноглікопротеїна. Даний винахід не обмежується типом використаної полімеросоми. Дійсно, можуть бути використані будь-які полімеросоми, відомі в даній області. У деяких варіантах реалізації полімеросома включає полі(етиленоксид) (PEO) блокспівполімер. Проте даний винахід не обмежується цим. Може бути використаний будь-який відомий блокспівполімер, включаючи, наприклад, полі(етилетилен) (PEE), полі(бутадієн) (PB або PBD), полі(стирол) (PS) і полі(ізопрен) (PI). У деяких варіантах реалізації полімер включає полі(ε-капролактон) (PCL) диблок-співполімер. У деяких варіантах реалізації полімеросома включає диблок-співполімери на основі полі(етиленоксид)-блок-полі(ε-капролактон) (PEO-b-PCL). У деяких варіантах реалізації полімеросома включає блокспівполімер, який є триблок-, тетраблок-, пентаблок- або щонайменше шестиблоковим співполімером. У деяких варіантах реалізації полімеросома отримана зв’язуванням полі(молочної кислоти), полі(гліколіду), полі(молочно-співгліколевої кислоти) та/або полі(3-гідроксибутирата) з PEO. Даний винахід не обмежується розміром полімеросоми, що інкапсулює селеноглікопротеїн. У композиціях і способах за даним винаходом знаходять застосування різні розміри, включаючи, але не обмежуючись цим, полімеросоми, що інкапсулюють селеноглікопротеїни, розмір яких складає близько 50-300 нм у діаметрі, хоча можуть бути використані більші (наприклад, близько 350 нм, 400 нм, 500 нм або більше) або дрібні (наприклад, близько 40 нм, 30 нм, 20 нм або менше) полімеросоми, що інкапсулюют селеноглікопротеїни. ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ На Фігурі 1 представлене послідовне приготування розчинних селеноглікопротеїнів (SGP) з SEL-PLEX шляхом кислотної екстракції і подальшого осадження одного варіанту реалізації даного винаходу. На Фігурі 2 показаний процес рН-залежного осадження селеноглікопротеїнів одного варіанту реалізації даного винаходу. На Фігурі 3 показана теплокарта, що ілюструє вплив різних обробок з додаванням селену, описаних у Таблицях 3 і 4 Прикладу 3, на рівні генної експресії в грудному скелетному м'язі курей у порівнянні з базовим контрольним зразком. На Фігурі 4 показана діаграма Венна, що зображує різний вплив фракції SGP 4,0 і SEL-PLEX на профіль генної експресії в грудному м'язі. На Фігурі 5 представлені ілюстративні гени, які зазвичай регулюються селенітом натрію (SS), SEL-PLEX (SP) і фракцією селеноглікопротеїна (SGP) рН 4,0. На Фігурі 6 зображені ілюстративні гени, які зазвичай регулюються SEL-PLEX (SP) і фракцією селеноглікопротеїна (SGP) рН 4,0, але не селенітом натрію (SS). На Фігурі 7 зображені ілюстративні гени, які унікально регулюються фракцією селеноглікопротеїна (SGP) рН 4,0, і не регулюються селенітом натрію (SS) або SEL-PLEX (SP). На Фігурі 8 зображений ілюстративний ген, який унікально регулюється фракцією селеноглікопротеїна (SGP) рН 4,0, і не регулюється селенітом натрію (SS) або SEL-PLEX (SP). На Фігурі 9 зображений ілюстративний ген, який унікально регулюється фракцією селеноглікопротеїна (SGP) рН 4,0, і не регулюється селенітом натрію (SS) або SEL-PLEX (SP). На Фігурі 10 зображений ілюстративний ген, який унікально регулюється фракцією селеноглікопротеїна (SGP) рН 4,0, і не регулюється селенітом натрію (SS) або SEL-PLEX (SP). На Фігурі 11 зображена теплокарта, що представляє вплив різних обробок з додаванням селену, описаних у Таблицях 3 і 4 Прикладу 3, на рівні генної експресії в печінковій тканині в порівнянні з базовим контрольним зразком. На Фігурі 12 зображене вивільнення SGP з нанокапсул при pH 5,1 і pH 7,4 протягом двох тижнів. 3 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фігурі 13 представлені зображення кріогенної тунельної електронної мікроскопії (кріоТЕМ) полімеросом, що інкапсулюють селеноглікопротеїн, при рН 7,4. ВИЗНАЧЕННЯ Для полегшення розуміння даного винаходу нижче представлене визначення ряду термінів і виразів: При використанні в даному документі, терміни «пептид», «поліпептид» і «білок» відносяться до первинної послідовності амінокислот, які зв'язані ковалентними «пептидними зв'язками». Загалом, пептид складається з декількох амінокислот, зазвичай з 2-50 амінокислот, і він коротший за білок. Термін «поліпептид» включає пептиди і білки. Термін «глікопротеїн(и)» або «глікопептид(и)» відноситься до білка або пептида, який містить один або більше вуглеводних залишків, ковалентно пов'язаних з поліпептидним ланцюгом. Термін «селенопротеїн(и)» або «селенопептид(и)» відноситься до білка або пептиду, який містить один або декілька атомів селену. Як правило, атоми селену включені в білки у складі амінокислот, що містять селен, включаючи селеноцистеїн і селенометіонін. Термін «селеноглікопротеїн(и)», «селеноглікопептид(и)» або «SGP» відноситься до глікопротеїну або глікопептиду, які містять один або більше атомів селену. Як правило, «селеноглікопротеїни» містять одну або декілька амінокислот, що містять селен. «Селеноглікопротеїни» можуть містити ряд вуглеводів у будь-якій кількості різних форм. Терміни «зразок», «проба» використовуються в своєму найширшому сенсі і охоплюють зразки і проби, отримані з будь-якого джерела. При використанні в даному документі, термін «зразок» використовується для позначення біологічних зразків, отриманих з тварин (включаючи людей), і охоплює рідини, тверді речовини і тканини. У деяких варіантах реалізації даного винаходу біологічні зразки включають спинномозкову рідину (CSF), серозну рідину, сечу і слину, кров і продукти крові, такі як плазма, сироватка і тому подібні. Проте ці приклади не слід тлумачити як обмежуючі типи зразків, які знаходять застосування за даним винаходом. При використанні в даному документі, термін «дріжджі» і «дріжджові клітини» відноситься до еукаріотичних мікроорганізмів, що класифіковані в царство «Гриби», мають клітинну стінку, клітинну мембрану і внутрішньоклітинні компоненти. Дріжджі не утворюють специфічних таксономічних або філогенетичних груп. На даний час відомо близько 1500 видів; за оцінками, описаний лише 1% зі всіх видів дріжджів. Термін «дріжджі» часто використовується як синонім для S. cerevisiae, проте філогенетична різноманітність дріжджів демонструється їх розміщенням в обох розділах Ascomycota і Basidiomycota. Термін «дріжджі» охоплює пивні дріжджі, винокурні дріжджі і пекарські дріжджі. Дріжджі, що брунькуються («істинні дріжджі»), класифікують у загін Saccharomycetales. Більшість видів дріжджів розмножуються вегетативним способом шляхом брунькування, хоча деякі розмножуються простим діленням надвоє. Дріжджі є одноклітинними, хоча деякі види стали багатоклітинними за рахунок утворення ланцюжку зв'язаних клітин, що брунькувались, відомі як pseudohyphae, або false hyphae. Розмір дріжджів може в значній мірі варіюватися залежно від вигляду, і зазвичай мають 3-4 мкм у діаметрі, хоча деякі дріжджі можуть досягати понад 40 мкм. При використанні в даному документі, терміни «збагачені селеном дріжджі» і «селенізовані дріжджі» відносяться до будь-яких дріжджів (наприклад, Saccharomyces cerevisiae), які вирощені в середовищі, що містить неорганічні солі селену. Даний винахід не обмежується використаною сіллю селену. Дійсно, передбачається, що в даному винаході можуть застосовуватись різні солі селену, включаючи, але не обмежуючись цим, селеніт натрію або селенат натрію. Вільний селенометіонін (наприклад, не пов'язаний з клітиною або дріжджами) також може використовуватись як джерело для збагачених селеном дріжджів, оскільки дріжджі інкорпорують цю форму селену. При вирощуванні, через хімічну схожість між селеном і сіркою, дріжджі інкорпорують селен замість сірки, яка зазвичай міститься в сірковмісних органічних сполуках в клітині. Сполукою, що містить селен, у таких дріжджових композиціях є селенометіонін, який вбудовується в поліпептиди/білки. Кількість загального клітинного селену, присутнього у формі селенометіоніна в таких композиціях варіюється, але може складати від 10 до 100%, 20-60%, 50-75% або між 60 і 75%. Решта кількості органічного селену в селенізованих дріжджових композиціях переважно утворюється з проміжних сполук шляхом біосинтезу селенометіоніна. Сюди входять, але не обмежуючись цим, селеноцистеїн, селеноцитатіонін, селеногомоцистеїн і селено-аденозилселенометіонін. Кількість залишкової неорганічної солі селену в кінцевому продукті зазвичай досить низька (наприклад, 2 мг/кг) при хіміопрофілактиці раку (дивись, наприклад, Ip. J. Nutr. 128: 1845-1854 (1998)), було також показано, що дефіцит селену підсилює канцерогенез молочної залози (дивись, наприклад, Ip and Daniel, Cancer Res. 45: 61-65 (1985); включений у даний документ шляхом посилання в повному обсязі) і УФВ-індукованого раку шкіри (дивись, наприклад, Pence et al., 102: 759-761 (1994); включений у даний документ шляхом посилання в повному обсязі). Білки клітинної оболонки дріжджів зв'язані з полісахаридами клітинної оболонки хімічними зв'язками, і для вивільнення білка з клітинної оболонки дріжджів у розчин ці зв'язки необхідно зруйнувати. Стандартною практикою екстракції білка з клітинних оболонок дріжджів є руйнування цих зв'язків за допомогою лужного гідролізу (рН 11,5, 80 °C) з подальшим центрифугуванням для виділення білків з глюканових полісахаридів, які не є розчинними у воді. При розробці варіантів реалізації за даним винаходом були виконані експерименти в спробах екстрагувати селеноглікопротеїни з використанням стандартної практики лужного гідролізу. Ці спроби екстрагувати селеноглікопротеїни з клітинних оболонок дріжджів з використанням стандартної практики лужного гідролізу виявились невдалими. Пізніше стало зрозуміло, що невдача при екстракції селеноглікопротеїнів з клітинних оболонок дріжджів з використанням стандартної практики лужного гідролізу обумовлена розкладанням селеноглікопротеїнів. Пізніше були зроблені спроби екстрагувати селеноглікопротеїни з використанням модифікованого способу лужного гідролізу (pH 11,5, 60 °C). Ці спроби екстракції селеноглікопротеїнів з клітинних оболонок дріжджів також виявились невдалими. Як правило, лужні способи екстракції білків з дріжджів не працюють при екстракції селеноглікопротеїнів з дріжджів. Тому при розробці варіантів реалізації за даним винаходом були зроблені додаткові спроби екстрагувати селеноглікопротеїни з використанням кислотної екстракції (pH 5, 80 °C). Як описано в даному документі, спосіб кислотної екстракції виявився успішним; селеноглікопротеїни не були зруйновані, і екстракція була можливою. Таким чином, у деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені нові способи отримання селеноглікопротеїнів (SGP), композицій селеноглікопротеїнів (SGP) (наприклад, отриманих з використанням способів кислотної екстракції (наприклад, рН-залежних фракцій селеноглікопротеїна)), композицій, що включає інкапсульовані селеноглікопротеїни (SGP), а також способи їх застосування (наприклад, для забезпечення переваги in vivo (наприклад, зміни профілів генної експресії) у пацієнта (наприклад, людини, тварини і так далі)). Зокрема, експерименти, які були виконані при розробці варіантів реалізації даного винаходу, показали, що композиції (наприклад, такі, що включають SGP (наприклад, виділені за способом даного винаходу) і способи за даним винаходом можуть бути використані для забезпечення біологічно доступного селену для пацієнта (наприклад, збільшення за допомогою цього вмісту селену в тканині та∕або м'язах пацієнта (наприклад, приводячи за допомогою цього до стабілізації та∕або покращення здоров'я суб'єкта))). У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені способи отримання SGP, композицій, що включають інкапсульовані (наприклад, інкапсульовані в полімеросому) SGP, а також способи їх застосування для зміни клітинної функції (наприклад, забезпечуючи за допомогою цієї благотворної дії на систему суб'єкта (наприклад, включаючи, але не обмежуючись цим, м'язово-скелетну систему, неврологічну систему, нервову систему, ендокринну систему, метаболічну систему та∕або імунну систему). У даному винаході представлені також способи застосування SGP окремо або в комбінації з одним або декількома іншими активними агентами для лікування або запобігання захворюванню (наприклад, зростання раку та∕або метастаза). У даному винаході представлені також способи застосування SGP для покращення здоров'я тварин (наприклад, сільськогосподарських тварин). У деяких варіантах реалізації композиції за даним винаходом використовують для доповнення, покращення і посилення цілющої та∕або живильної цінності харчових продуктів (наприклад, м'яса, молочних продуктів, яєць і так далі). У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені композиції, включаючі SGP, і способи їх застосування як терапевтичні засоби, харчових добавок та∕або для профілактичного лікування (наприклад, для загального здоров'я, для зміцнення імунної системи, для нейродегенеративних захворювань, для покращення когнітивної функції, для лікування або профілактики раку, зростання пухлини та∕або метастаза і так далі), а також способи їх отримання, виробництва, очищення, виділення, екстракції і визначення. У даному винаході представлені також SGP і способи застосування SGP для годування тварин та∕або доповнення кормів для тварин. У даному винаході представлені також розчинні композиції селену (наприклад, SGP) і способи їх застосування, отримання і очищення. Наприклад, у деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені розчинні SGP (дивись, наприклад, Приклади 1-2, в яких описано 9 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отримання (наприклад, виділення і визначення) рН-залежних фракцій SGP) і композиції, а також способи їх введення (дивись, наприклад, Приклади 3-4). У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлений селен (наприклад, органічний селен (наприклад, рН-залежна фракція SGP SEL-PLEX або інших збагачених селеном дріжджів) у розчинній формі, який вводять суб'єктові різними способами (наприклад, пероральним, локальним, внутрішньовенним і так далі). У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлена розчинна композиція селену (наприклад, органічного селену) з низьким вмістом волокон. У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені композиції і способи для систем доставки розчинного органічного селену (наприклад, селеноглікопротеїни, інкапсульовані в полімеросому, нанокапсули, полімери і так далі). Дріжджі (наприклад Saccharomyces cerevisiae), вирощені в середовищі, що містить селен (наприклад, неорганічний селен (наприклад, селеніт натрію (Na2SeO3))) метаболізують селен (наприклад, неорганічний селен) і вбудовують селен замість сірки в цистеїн і метіонін, у результаті чого утворюються білки, що містять селеноамінокислоти (SeCys і SeMet) (Demirci et al. J. Agric. Food Chem. 47, 2496-2500 (1999)., Demirci & Pometto. J. Agric. Food Chem. 47, 24912495 (1999), Ouerdane & Mester. J.Agric.Food Chem. 56,11792-11799, (2008), кожний із яких включений у даний документ шляхом посилання в повному обсязі). Компанія ALLTECH, Inc. (Ніколасвілл, штат Кентуккі, США) виробляє висушені розпилюванням збагачені селеном дріжджі, що продаються під назвою SEL-PLEX, як кормова і харчова добавка, що містить «органічний селен» (дивись, наприклад, Korhola et al. Res. 18, 65-68, (1986), включений у даний документ шляхом посилання в повному обсязі). Мінімальна концентрація селена в SEL-PLEX складає 1500 м.д., і білки є єдиним його носієм (дивись, наприклад, Surai. Nottingham University Press 2002, 234-236 (2002), Kelly & Power. J. Dairy Sci. 78, 237-242 (1995), McSheehy et al. Analyst 130, 35-37 (2005), включені у даний документ шляхом посилання в повному обсязі). У дріжджах існує дві групи білків: білки, що присутні всередині клітин дріжджів, и білки, зв'язані с маннаном клітинної оболонки дріжджів (дивись, наприклад, Sedmak, публікація заявки на патент США №: US 2006/0263415, включена у даний документ шляхом посилання в повному обсязі). Близько 17,0 мас.% комерційого SEL-PLEX розчиняється у воді, і цей матеріал містить менше 6,5% загального селена, що присутній у SEL-PLEX. Дослідження, виконані при відкормі курчат, у яких як джерела селену використовували SEL-PLEX і селеніт натрію, показали, що SEL-PLEX значно краще переносить селен у грудний м'яз курчат. Для перорального введення SEL-PLEX були відкриті багаточисленні біоактивні засоби (дивись, наприклад, Rayman. The Lancet 356, 233-241 (2000), McKenzie Trends in Immunology 19, 342-345 (1998), Tapiero. Biomedicine & Pharmacotherapy 57, 134-144 (2003), Combs & Grey Pharmacol. Ther. 79, 179-192 (1998), Clark et. al. J. Am. Med. Assoc. 276, 1957-1963 (1996), включені в даний документ шляхом посилання в повному обсязі). У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлене виділення та фізичне і химическое визначення розчинних селеноглікопротеїнів (SGP) із дріжджів (наприклад, Saccharomyces cerevisiae), вирощених у середовищі, що містить селен (наприклад, неорганічний селен (наприклад, селеніт натрію)), а також їх активна участь у доставці «органічного селена» в тканини (наприклад, людини, тварини, кур і так далі), шляхом годування суб'єкту їжею (наприклад, кормом), доповненою або такою, що іншим чином містить SGP за даним винаходом (дивись, наприклад, Приклади 1-4). У даному винаході представлена направлена на тканини, внутрішньовенна, пероральна та/або трансдермальна доставка активних, розчинних селенових компонентів (наприклад, рН-залежних фракцій SGP збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)). У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені системи доставки «органічного селена» у формі повільного вивільнення (наприклад, нанокапсули, полімерні сфери і полімеросоми з інкапсульованими SGP) (дивись, наприклад, Приклади 5-9). У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлена композиція, що включає полімеросому с інкапсульованими SGP. У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлена посилена доставка і покращений біорозподіл SGP шляхом інкапсулювання SGP всередині полімеросом на основі полі(етиленоксид)-блок-полі(εкапролактон) (PEO-b-PCL). Описане виділення різних компонентів дріжджевих клітин шляхом екстракції клітинних оболонок із внутрішньоклітинних компонентів дріжджевих клітин (дивись, наприклад, Otero et al. J. Chem. Tech. Biotechnol. 66, 67-71 (1996), включений у даний документ шляхом посилання в повному обсязі). Ці методики виділення не використовувались для екстракції висушенних розпилюванням дріжджів, що містять селен. Стандартні, лужні умови (рН 9,0-14,0), що використовуються в даній області техніки при екстрації глікопротеїнів із дріжджів (дивись, наприклад, Roberge et. al. J.Agric. Food Chem. 51, 4191-4197 (2003), включений у даний 10 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 документ шляхом посилання в повному обсязі), виявились невдалими, оскільки замісники SeH або SeMe видалялись із аминокислот селеноцистина або селенометіоніна. Іншими словами, задані замісники розкладались, і в результаті при спробі екстракції в лужних умовах, використаних для екстракції дріжджів, що містять селеноглікопротеїни, губився селен, що був присутній у первинних SGP (дивись, наприклад, Таблицю 12 Приклада 8). Відповідно, у деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені композиції селеноглікопротеїнів (наприклад, такі, що включають рН-залежну фракцію селеноглікопротеїнів, описану в даному документі) і способи їх застосування. В деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені способи отримання, очищення, виділення, екстракції, виділення, осадження та/або визначення селеноглікопротеїнів (наприклад, із збагачених селеном дріжджів). У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені композиції і способи доставки розчинних композицій селена (наприклад, SGP (наприклад, рН-залежних фракцій SGP)) суб'єктові, включаючи композиції харчових добавок (наприклад, таких, що включають SGP (наприклад, фармацевтичні засоби, нутрицевтики, добавки, харчові продукти і так далі)). У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені композиції і способи покращеної доставки (наприклад, прямої доставки, доставки с відтермінованим вивільненням і так далі) селену (наприклад, SGP (наприклад, полімеросому, нанокапсул, наночасток, полімерів і так далі). Композиції і способи за даним винаходом знаходять застосування в різних областях, включаючи, але не обмежуючись цим, дієтичне (наприклад, змішування з кормом або для годування тварин іншим способом), профілактичне, терапевтичне, а також дослідницьке застосування. Відповідно, в деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені композиції кормів для тварин (наприклад, такі, що включають SGP (наприклад, розчинні SGP (наприклад, розчинний органічний селен))), способи виробництва композицій і способи забезпечення харчування (наприклад, такого, що включає SGP (наприклад, розчинний SGP (наприклад, розчинний органічний селен))) тваринам, що включають забезпечення тварин такими композиціями. II. Екстракція, виділення, очищення і застосування У деяких варіантах реалізації даного винаходу розчинний селен отримують у формі селеноглікопротеїнів (SGP). У деяких варіантах реалізації SGP екстрагують із загального джерела селенопротеїнів (наприклад, збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)). У деяких варіантах реалізації екстракція та∕або очищення SGP включає одну або декілька рНзалежних етапів екстракції/осадження (наприклад, як описано в Прикладах 1 і 2). У деяких варіантах реалізації екстракція і очищення SGP включає одну або декілька рН-залежних стадій фракціонування. У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлена кислотна екстракція збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX) для солюбілізації SGP (наприклад, без денатурації та∕або руйнування SGP). У деяких варіантах реалізації даного винаходу показано, що рН-залежне осадження SGP з кислотного екстракту (наприклад, як описано в прикладах 1-2) дає збільшений вміст селеноглікопротеїнів, понижений вміст незасвоюваних волокон і високу концентрацію селену (наприклад, концентрацію селену, яка є вищою, ніж присутній у SEL-PLEX). Таким чином, у деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені SGP, екстраговані із збагачених селеном дріжджів, в яких вміст селену в SGP вищий, ніж вміст селену в матеріалі, з якого екстрагували SGP (наприклад, у мас./мас.%, м.д. і так далі). У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлений селен у формі рНзалежної фракції SGP (наприклад, фракції рН 4,0 або рН 6,0) збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX), яка демонструє таку ж або дуже схожу міру біодоступності при введенні пацієнтові у порівнянні з біодоступністю селену з первинного джерела збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX) (дивись, наприклад, Приклад 3, Таблиця 5). У деяких варіантах реалізації SGP екстрагують із загального джерела селенопротеїнів (наприклад, клітин збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)). У деяких варіантах реалізації частина селенопротеїнів у джерелі селенопротеїна включає SGP (наприклад, 0,1%... 0,2%...0,5%... 1,0%... 2,0%... 5,0%... 10%... 20%... 50% або більше SGP). У деяких варіантах реалізації джерело селенопротеїна включає клітини (наприклад, дріжджові клітини), які були вирощені у присутності середовища, що містить Se (наприклад, Se-збагаченого середовища). У деяких варіантах реалізації клітини (наприклад, дріжджові клітини), що містять Se, піддають екстракції, виділенню і очищенню селенопротеїнів, внаслідок чого отримують джерело селенопротеїна або збагачену селенопротеїном композицію (наприклад, SGP-збагачену композицію). У деяких варіантах реалізації зразок, що включає селенопротеїни і SGP, є збагаченим SGP. У деяких варіантах реалізації джерело селенопротеїна або збагачена селеном композиція (наприклад, джерело збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)) піддають одній або 11 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 декільком стадіям для отримання виділених, очищених, розділених і екстрагованих SGP. У деяких варіантах реалізації джерело селенопротеїна змішане (наприклад, у рідкому носієві (наприклад, воді, буфері, солі і так далі)) з утворенням білкової суспензії, суміші, лізата і розчину. У деяких варіантах реалізації джерело селенопротеїна (наприклад, джерело збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)) змішують при високій температурі (наприклад, вище за точку замерзання, вище за кімнатну температуру, 30 °C… 40 °C… 50 °C… 60 °C... 70 °C… 80 °C… 90 °C або вище). У деяких варіантах реалізації джерело селенопротеїна (наприклад, джерело збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)) змішують при низьких рН (наприклад, у кислотних умовах (наприклад, рН близько 0,5, близько 1,0, близько 1,5, близько 2,0, близько 3,0, близько 4,0, близько 4,5, близько 5,0, близько 5,5, близько 6,0 або близько 6,5). У деяких варіантах реалізації джерело селенопротеїна (наприклад, джерело збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)) змішують обережно, змішують швидко, змішують ретельно, змішують енергійно і так далі. У деяких варіантах реалізації джерело селенопротеїна (наприклад, джерело збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)) змішують при низькому рН (наприклад, у кислотних умовах (наприклад, рН близько 0,5, близько 1,0, близько 1,5, близько 2,0, близько 3,0, близько 4,0, близько 4,5, близько 5,0, близько 5,0, близько 6,0 або близько 6,5) і високій температурі (наприклад, вище за точку замерзання, вище за кімнатну температуру, 30 °C… 40 °C… 50 °C… 60 °C… 70 °C… 80 °C… 90 °C або вище)). У деяких варіантах реалізації рН суміші підтримують додаванням кислоти або основи. У деяких варіантах реалізації суміш, що містить селенопротеїн, центрифугують для виділення рідкої/розчинної і твердої/нерозчинної фаз. У деяких варіантах реалізації швидкість центрифуги вибирають так, щоб вона була достатньою для розділення вказаних фаз. У деяких варіантах реалізації рідка фаза включає розчинні SGP. У деяких варіантах реалізації рН рідкої фази доводять (наприклад, підвищують) для осадження частині SGP. У деяких варіантах реалізації виконують підвищення рН рідкої фази, від слабкого до помірного (наприклад, рН підвищують приблизно на 0,1...0,2...0,5...1,0...2,0) для осадження SGP, які були розчинними при первинному рН, але не при підвищеному рН. У деяких варіантах реалізації рН рідкої фази підвищують істотно (наприклад, рН підвищують приблизно на 1,0…2,0…3,0…4,0…5,0…6,0) для осадження великої частини SGP, які були розчиними при первинному рН. У деяких варіантах реалізації селеноглікопротеїни осаджують і виділяють з рідкої фази за різних рН умов для отримання декількох рН-залежних фракцій розчинних селеноглікопротеїнів. Наприклад, у деяких варіантах реалізації одну рідку фазу, що включає екстракт збагачених селеном дріжджів, розчинний за кислотних умов, використовують для отримання першої фракції розчинних селеноглікопротеїнів, осаджених при першому рН (наприклад, рН 1,85), другої фракції розчинних селеноглікопротеїнів, осаджених при другому рН (наприклад, рН 3,0), третьої фракції розчинних селеноглікопротеїнів, осаджених при третьому рН (наприклад, рН 4,0) і четвертій фракції розчинних селеноглікопротеїнів, осаджених при четвертому рН (наприклад, рН 6,0). У деяких варіантах реалізації осадження селеноглікопротеїнів з рідкої фази за рахунок підвищення рН рідкої фази включає декілька послідовних рН-залежних реакцій осадження рідкої фази. У деяких варіантах реалізації осаджені SGP виділяють з рідкої фракції з відрегульованим рН шляхом центрифугування (наприклад, при достатній швидкості для отримання окремо рідкої і твердої фаз). У деяких варіантах реалізації SGP, які були виділені з рідкої фази, висушують заморожуванням для отримання твердої фракції SGP. У деяких варіантах реалізації процес підвищення рН рідкої фази і центрифугування для виділення фракції SGP повторюють для отримання фракцій SGP з різною розчинністю (наприклад, розчинні нижче рН 1,5... розчинні нижче рН 2... розчинні нижче рН 3... розчинні нижче рН 4... розчинні нижче рН 5... розчинні нижче рН 6 і так далі). У деяких варіантах реалізації виконують одну стадію регулювання рН і центрифугування для отримання однієї фракції, SGP заданої розчинності, що містить (наприклад, розчинною нижче рН 1,5... розчинною нижче рН 2... розчинною нижче рН 3... розчинною нижче рН 4... розчинною нижче рН 5... розчинною нижче рН 6 і так далі). У деяких варіантах реалізації рідка фаза, яка залишається після видалення останньої фракції SGP, знаходить застосування як компонент живильного середовища для клітин, що використовуються для подальшого вироблення селенопротеїнів або SGP. У деяких варіантах реалізації композиція, що включає розчинні селеноглікопротеїни, містить лише одну, рНзалежну фракцію селеноглікопротеїнів (наприклад, розчинні селеноглікопротеїни з рідкої фази, що включає екстракт збагачених селеном дріжджів, розчинний за кислотних умов, осаджений при рН 4,0). У деяких варіантах реалізації композиції, що включають розчинні селеноглікопротеїни, містять дві або більше рН-залежних фракцій селеноглікопротеїнів (наприклад, розчинних селеноглікопротеїнів з рідкої фази, що включає екстракт збагачених 12 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 селеном дріжджів, розчинний за кислотних умов, осаджений при двох або більше різних значеннях рН). У бажаних варіантах процес екстракції SGP з джерела селенопротеїна (наприклад, збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)) і рН-залежного фракціонування суміші SGP (дивись, наприклад, Фігури 2 і 3) включає дві стадії (дивись, наприклад, Приклади 1-2, Фігури 1 і 2). На першій стадії суспензію збагачених селеном дріжджів в 0,3 н. HCl (рН 1,5) перемішують і нагрівають при 80 °C протягом 8 годин. рН суміші підтримують при рН 1,5 додаванням концентрованої HCl протягом першої години екстракції. Через вісім годин суміш центрифугують, а рідку фазу відокремлюють. рН розчину доводять до 1,85 додаванням 2,0 н. NaOH, і SGP, які мають обмежену розчинність при даному рН, осаджують з розчину і відокремлюють від рідини (рН 1,85) другим центрифугуванням, а потім висушують заморожуванням для отримання твердої фракції SGP з рН 1,85. У деяких варіантах реалізації рідкі речовини (рН 1,85) змішують з твердими речовинами (рН 1,5) з першого центрифугування, що призводить до зміни рН суміші до рН 1,6. Велика частина SGP, розчинних при рН 1,6, переходить у рідку фазу, без збільшення об'єму стічного потоку, утвореного на цій стадії процесу. Велика частина побічного продукту з цієї стадії процесу є твердими речовинами з другого центрифугування. Потік твердих відходів складається приблизно з 56,5 мас.% збагачених селеном дріжджів, узятих для екстракції, і містить цінний матеріал клітинних оболонок дріжджів, що містять селен, який містить: 38,91% білка і 2477 м.д. селену. У деяких варіантах реалізації ці тверді речовини утилізували (наприклад, окремо або в комбінації з іншим матеріалом (наприклад, збагаченими селеном дріжджами)) як екологічну живильну добавку в кормах для тварин. На другій стадії (дивись, наприклад, Фігуру 3) рідку фазу (рН 1,6) з другого центрифугування (дивись Фігуру 2) переносять у змішувач і доводять рН до 3,0 додаванням 2,0 н. NaOH, і SGP, які мають обмежену розчинність при даному рН, осаджують з розчину і виділяють з рідини (рН 3,0) третім центрифугуванням і, нарешті, висушують заморожуванням для отримання твердої фракції SGP з рН 3,0 (дивись, наприклад, Приклади 1-2 і Фігури 2 і 3). Рідку фазу (рН 3,0) з третього центрифугування переносять у змішувач і доводять рН до 4,0 додаванням 2,0 н. NaOH, і SGP, які мають обмежену розчинність при даному рН, осаджують з розчину і виділяють з рідини (рН 4,0) четвертим центрифугуванням і, нарешті, висушують заморожуванням для отримання твердої фракції SGP з рН 4,0. Рідку фазу (рН 4,0) з четвертого центрифугування переносять у змішувач і доводять рН до 6,0 додаванням 2,0 н. NaOH, і SGP, які мають обмежену розчинність при даному рН, осаджують з розчину і виділяють з рідини (рН 6,0) п'ятим центрифугуванням, а потім висушують заморожуванням для отримання твердої фракції SGP з рН 6,0. Єдиний стічний потік, утворений на другій стадії процесу, є потоком стічної води, що містить 13,4 мас.% твердих речовин (у порівнянні з масою збагачених селеном дріжджів, використаних в екстракції), з яких білкова фракція складає близько 13,3 мас.%, хлорид натрію - 3,6 мас.%, а моно- і олігосахариди глюкози і манози складають близько 80 мас.%. Цей потік «стічної води» з рН 6,0 і концентрацією селену 242 м.д. може бути повернений у цикл або повторно використаний іншим чином для отримання нової партії дріжджів, що містять селен (наприклад, може бути використаний у живильному середовищі). У деяких варіантах реалізації SGP, осаджений при рН 4,0, демонструє вищу доставку селену (наприклад, у м'язову тканину) у порівнянні із збагаченими селеном дріжджами (наприклад, SEL-PLEX), і набагато вищу доставку в порівнянні з неорганічними формами селену (наприклад, селенітом натрію) (дивись, наприклад, Приклад 3). Крім того, рН-залежні фракції селеноглікопротеїнів (наприклад, рН 6,0) відрізняються по складу від збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX) і забезпечують можливість доставки аналогічних кількостей селену при витраті набагато меншої кількості первинного матеріалу (наприклад, збагачених селеном дріжджів). У деяких варіантах реалізації процедура екстракції SGP включає 4 або менше стадій регулювання рН і центрифугування описаної вище процедури (наприклад, 1 стадія регулювання рН і центрифугування, 2 стадії регулювання рН і центрифугування, 3 стадії регулювання рН і центрифугування, 4 стадії регулювання рН і центрифугування). III. Корм для тварин «Корм для тварин» відноситься до будь-якої їжі, що використовується для годування одомашнених тварин (наприклад, крупної рогатої худоби, кіз, овець, коней, свійських птахів, буйволів, альпаків, лам, віслюків, мулів, кроликів, курей, гусаків, індичок або свиней). Корм для тварин часто включає сіно, солому, силос, пресовані і гранульовані корми, олії і змішані корми, а також пророщені зерна і боби. У 2006 році у всьому світі у галузі тваринництва було витрачено 635 мільйонів тонн кормів, а швидкість щорічного приросту складає близько 2%. Використання сільськогосподарських угідь для вирощування кормів, а не харчових продуктів 13 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 для людини може бути спірним; деякі види кормів, такі як кукурудза (маїс) можуть слугувати як їжа для людей, тоді як інші, такі як трава - не можуть. Для забезпечення тварин джерелом енергії, в кормах для тварин присутні також харчові добавки (наприклад, селен), які використовуються організмом. У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені харчові композиції (наприклад, композиції розчинного селену (наприклад, SGP), які дозволяють створювати композиції тваринних кормів, що включають селен (наприклад, підвищені концентрації селену в порівнянні із стандартними кормовими композиціями (наприклад, розчинного селену)), який знижує загальні витрати, підвищує перетворення їжі і зберігає і покращує якість продуктів тваринництва (наприклад, м'яса, яєць, молочних продуктів і тому подібних), отриманих з сільськогосподарських тварин, які їх отримують, у порівнянні із звичайними тваринними кормами. Наприклад, у деяких варіантах реалізації даного винаходу представлена композиція харчової добавки, що включає SGP, яка може бути змішана та/або включена в корм для тварин і може вводитись (наприклад, згодовуватися) тварині для забезпечення такого ж або покращеного ефекту на показники зростання тварини (наприклад, у порівнянні з тваринними кормами з іншими формами доповнюючого селену (наприклад, збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX)). У деяких варіантах реалізації композиція харчової добавки за даним винаходом збільшує кількість циркулюючого селену (наприклад, того, що знаходиться в крові та/або сироватці) в організмі суб'єкта (наприклад, людини або тварини), яка приймає вказану композицію. У деяких варіантах реалізації біодоступною є вища доля введеного селену в розчинних композиціях селену за даним винаходом (наприклад, SGP), ніж в інших селенових композиціях (наприклад, селеніті натрію або збагачених селеном дріжджах (наприклад, SELPLEX)). Тобто в деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені композиції, що включають селеноглікопротеїни, які містять вищу долю та/або частину селену, яка є доступною (наприклад, біодоступною) для суб'єкта в порівнянні з іншими формами селену (наприклад, збагаченими селеном дріжджами), що означає, що необхідні менші кількості композиції, включаючою селеноглікопротеїн за даним винаходом (наприклад, для отримання таких же кількостей біодоступності). У деяких варіантах реалізації композиція харчової добавки за даним винаходом (наприклад, такої, що включає SGP за даним винаходом) підвищує кількість селену (наприклад, того, що знаходиться в м'язах або іншій тканині) в організмі пацієнта (наприклад, людини або тварини, яка приймає вказану композицію. У деяких варіантах реалізації введення SGP і розчинного селену приводить до збільшеної біодоступності селену в сироватці, жировій тканині, м'язовій тканині і так далі. У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлений спосіб підвищення ефективності, з якою тварина використовує живильні речовини в кормі для тварини, що включає забезпечення тварини живленням, що включає композицію харчової добавки за даним винаходом, причому вказана доповнююча композиція підсилює здатність тварини переробляти і використовувати живильні речовини, присутні в кормі. У деяких варіантах реалізації композиція харчової добавки даного винаходу збільшує кількість циркулюючих антіоксидантів (наприклад, селену, що знаходиться в крові та/або сироватці) в організмі суб'єкта, що приймає вказану композицію. У деяких варіантах реалізації композиція харчової добавки за даним винаходом збільшує кількість антіоксидантів (наприклад, селену, що знаходиться в жировій тканині, м'язах і так далі) в організмі суб'єкта, що приймає вказану композицію. IV. Фармацевтичні засоби, нутрицевтики і добавки Харчові рівні селену встановлені Управлінням по контролю якості харчових продуктів і лікарських засобів (FDA) (дивись Зведення Федеральних правил, 21, 101.9(c)(8)(iv), січень 1994 року). Люди і тварини можуть безпечно метаболізувати обмежені кількості неорганічних і органічних форм селену і можуть перетворювати неметильований селен у моно- або ди-, або триметильовані похідні, з яких монометильовані похідні є найбільш токсичними (дивись, наприклад, Bedwal, R. S., et al., Medical Hypotheses, 41 (2):150-159 (серпень 1993 року)). FDA адаптувало орієнтовні норми денного вжитку (RDI) на рівні 70 мікрограмів селену для годуючих жінок і RDI 55 мікрограмів для не годуючих дорослих. Доза селену в 600 мікрограмів на день описана як безпечна (дивись, наприклад, Ferris G. M. Lloyd, et al., App. Clin. Biochem.,26:83-88 (1989). Приблизно при цій дозі нормальна активність ферменту глутатіон-редуктази безпечно перетворює селеноглутатіон на селенід водню в печінці і еритроцитах, який повністю виводиться з організму. Отже, при таких низьких дозах організм здатний безпечно метаболізувати і виводити селен, присутній у формі вільного металу. Проте, як і для багатьох елементів (наприклад, селену), при вищих рівнях або концентраціях дози благотворний ефект 14 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5560 анулюється і виникає небезпечна токсичність (дивись, наприклад, Furnsinn, C. et al., Internat'l J. of Obesity and Related Metab. Dis., 19(7):458-463 (1995)). Введення селену в природній формі зачіпає науковий і медичний компроміс, оскільки при введенні відносно низьких концентрацій селен забезпечує благотворну дію на здоров'я, проте при високих концентраціях селен демонструє надзвичайну токсичність, так що потенційна користь для здоров'я втрачається, і основним питанням стає токсичність. Як описано вище, у даному винаході представлені деякі форми селену (наприклад, SGP, водорозчинний селен), які забезпечують благотворну дію на суб'єкта. Дані показали, що органічні форми селену (наприклад, селенометіонін і збагачені селеном дріжджі) можуть бути менш токсичними і краще абсорбуються, ніж неорганічні форми (дивись, наприклад, Mahan, Proceedings of the 15th Annual Symposium Nottingham University Press, Ноттінгем, Великобританія, сс. 523-535 (1999). Не дивлячись на це, у деяких варіантах реалізації використовуються багато форм селену в комбінації один з одним (наприклад, для забезпечення благотворного впливу на здоров'я суб'єкта). Природні джерела селену включають, але не обмежуючись цим, збагачені селеном (наприклад, селенізовані) дріжджі. Використаний штам дріжджів не є таким, що обмежує. У деяких бажаних варіантах даного винаходу SGP (наприклад, отримані із збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX), як описано в Прикладах 1-2) є бажаною формою селену для препаратів і композицій за даним винаходом. У деяких варіантах реалізації композиції, що включають водорозчинний селен та/або SGP, забезпечують більш біологічно доступну форму селену у порівнянні з іншими формами селену. Проте інші форми селену також можуть знаходити застосування в даному винаході, включаючи похідні або модифікації водорозчинного селену та/або SGP, SEL-PLEX або інших форм збагачених селеном дріжджів, селенометіоніна, селеноцистеїна, селенітних сполук, селенатних сполук або їх похідних, солей або модифікацій. Так, у деяких бажаних варіантах кожна з цих форм селену може бути використана як компонент композиції. Альтернативно, кожна з описаних вище форм селену може бути зв'язана (наприклад, хімічно або фізично) з ліками або терапевтичним засобом з утворенням похідних ліків, що містять селен. Крім того, композиції і препарати не обмежуються однією формою селену. Дійсно, композиція або препарат може включати декілька форм селену (наприклад, SGP і SEL-PLEX або селеніт натрію і водорозчинний селен). Інші форми селену, що знаходять застосування в різних варіантах реалізації даного винаходу, описані в патентах США №№ 6911550, 6197295, 5221545, 6 і 6576233, і заявках на патент США №№ 20010043925, 20050069594, 20050089530 і 20080107755, які включені в даний документ шляхом посилання в повному обсязі. Відповідно, в даному винаході представлені композиції фармацевтичних засобів, нутрицевтиків та/або добавок (наприклад, харчові та/або дієтичні композиції або лікарські засоби), які включають одну або декілька форм селену (наприклад, SGP, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен) і так далі), самостійно або в комбінації щонайменше з одним іншим засобом, таким як стабілізатор, інший терапевтичний засіб(и), живильна речовина(а) і мінерали; і можуть бути введені в будь-якому стерильному, біосумісному носієві, включаючи, але не обмежуючись цим, сольовий розчин, буферний сольовий розчин, декстрозу, воду і так далі. Способи за даним винаходом знаходять застосування при лікуванні (наприклад, профілактично або терапевтично) захворювань (наприклад, нейродегенеративних захворювань, раку і так далі) або змінених фізіологічних станів. Селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP))) може бути введений суб'єктові (наприклад, пацієнтові) внутрішньовенно у фармацевтично прийнятному носієві, такому як фізіологічний сольовий розчин. Можуть бути використані стандартні способи внутрішньоклітинної доставки (наприклад, доставка через ліпосоми). Такі способи добре відомі фахівцям в даній області. Композиції за даним винаходом застосовні для парентерального введення, такого як внутрішньовенне, підшкірне, внутрішньом'язове і внутрішньочеревне. У деяких варіантах реалізації композиції (наприклад, SGP та/або фармацевтичні композиції, що містять їх) вводять перорально. Як добре відомо в області медицини, дози для будь-якого суб'єкта можуть залежати від багатьох чинників, включаючи розмір пацієнта, площу поверхні тіла, вік, конкретну сполуку, що підлягає введенню, стать, час і спосіб введення, загальний стан здоров'я і взаємодія з іншими ліками, які вводять паралельно. Відповідно, у деяких варіантах реалізації композиції та/або препарати, що містять селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі) вводять 15 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 суб'єктові самостійно або в комбінації з іншими формами селену, ліками, низькомолекулярними сполуками, або у фармацевтичних композиціях, де він змішаний з формотворним засобом(ами) або іншими фармацевтично прийнятними носіями. У деяких варіантах реалізації фармацевтично прийнятним носієм є фармацевтично інертний носій. У інших варіантах реалізації композиції, що включають селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі) окремо самостійно конкретним суб'єктам, страждаюніж на захворювання або стан. У інших варіантах реалізації даного винаходу композиції, що включають селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі) вводять самостійно конкретним суб'єктам для покращення загального стану здоров'я або здоров'я якої-небудь системи організму. Композиції, що включають селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі) самостійно або в комбінації з однією або декількома іншими формами селену можуть бути додані в пиття або їжу (наприклад, ENSURE, POWERBAR і тому подібні), полівітамінні, живильні продукти, їжу і так далі для щоденного вжитку. Залежно від мети, яку необхідно змінити при лікуванні (наприклад, генна експресія, пов'язана із старінням, та/або регуляція генної експресії, пов'язаної з раком та/або зростанням пухлини або метастазом), ці композиції фармацевтичних засобів, добавок та/або нутрицевтиків складають і вводять системно або локально. Методики складання і введення композиції можна знайти в останньому виданні "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Ра.). Відповідні способи можуть включати, наприклад, пероральне або трансмукозальне введення; а також парентеральну доставку, включаючи внутрішньом'язове, підшкірне, інтрамедуллярне, інтратекальне, внутрішньошлуночкове, внутрішньовенне, внутрішньочеревне або інтраназальне введення. Для ін'єкцій композиції, що містять селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі) готують у вигляді водних розчинів, бажано у фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенкса, розчин Рінгера або фізіологічний буферний сольовий розчин. Для тканинного або клітинного введення в композиції використовують пенетранти, що відповідають конкретному бар'єру, через який відбувається проникнення. Такі пенетранти загальновідомі в даній області техніки. У інших варіантах реалізації композиції, що містять селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі) готують з використанням фармацевтично прийнятних носіїв, добре відомих в даній області, в дозах, застосовних для перорального введення. Такі носії забезпечують можливість складати композиції, що містять селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі) у вигляді пігулок, пілюль, капсул, рідин, гелів, сиропів, суспензій, суспензій і тому подібного, для перорального або назального застосування пацієнтом, який підлягає лікуванню. Фармацевтичні композиції, придатні дли використання, в даному винаході включають композиції, в яких активні інгредієнти (наприклад, композиції, що містять селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі) містяться в ефективній кількості для досягнення заданої мети. Наприклад, ефективна кількість фармацевтичного засобу може бути таким, щоб змінювати експресію певного гена (наприклад, KTLG, GRB2, DNAJ3, TGFB1, MAPK8, C1R, UBE4A, SMPX, USP22 та/або PTP4A1). Визначення ефективних кількостей знаходиться в рамках можливостей фахівця в даній області. У даному винаході представлені також рН-залежні SGP і композиції, що включають їх, для застосування для профілактичного і терапевтичного лікування раку (наприклад, для запобігання або уповільнення прогресу раку/пухлини та/або метастаза). Наприклад, у бажаному варіанті рНзалежну фракцію SGP збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX) вводять суб'єктові для регуляції експресії (наприклад, заданим чином) гена, пов'язаного із зростанням раку та/або метастаза). Як описано в даному документі, було встановлено, що деякі розчинні фракції SGP мають біологічні властивості (наприклад, здатність регулювати генну експресію), які не має первинний матеріал, з якого була отримана розчинна фракція SGP (наприклад, збагачені селеном дріжджі (наприклад, SEL-PLEX)) (дивись, наприклад, Приклад 4 і Фігури7-11). У бажаному варіанті реалізації рН-залежна фракція SGP збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX) є рН 4,0 залежною фракцією, хоча інші фракції (наприклад, рН 3,0, рН 6,0 і так далі) також знаходять застосування в композиціях і способах за даним винаходом. Окрім активних інгредієнтів ці фармацевтичні композиції, що містять селен (наприклад, розчинний селен (наприклад, водорозчинний селен), SGP і так далі), можуть містити відповідні фармацевтично прийнятні носії, що включають формотворні засоби і допоміжні речовини, які полегшують переробку активних сполук у препарати, які можуть бути використані 16 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фармацевтично. Препарати, складені в композиції для перорального введення, можуть бути у формі пігулок, драже, капсул або розчинів. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть випускатись за відомими способами (наприклад, традиційними процесами змішування, розчинення, гранулювання, отримання драже, розтирання в порошок, емульгування, інкапсуляції, включення в який-небудь носій або ліофілізації). Фармацевтично композиції для парентерального введення включають водні розчини активних сполук у водорозчинній формі. Крім того, суспензії активних сполук можуть бути отримані як відповідні маслянисті суспензії для ін'єкції. Відповідні ліпофільні розчинники або рідкі носії включають жирні олії, такі як кунжутна олія, або складні ефіри синтетичних жирних кислот, такі як етилолеат, або тригліцериди, або ліпосоми. Водні суспензії для ін'єкцій можуть містити речовини, які збільшують в'язкість суспензії, такі як карбоксиметилцелюлоза натрію, сорбіт або декстран. Необов'язково, суспензія може також містити відповідні стабілізатори або агенти, які збільшують розчинність сполук для забезпечення можливості отримання висококонцентрованих розчинів. Фармацевтичні препарати для перорального применеия можуть бути отримані змішуванням активних сполук з твердим формотворним засобом, необов'язковим подрібненням отриманої суміші, і переробки цієї суміші в гранули, після додавання, при необхідності, відповідних допоміжних речовин, для отримання пігулок або ядер драже. Відповідними формотворними засобами є вуглеводні або білкові наповнювачі, такі як цукри, включаючи лактозу, сахарозу, маніт або сорбіт; крохмаль з кукурудзи, пшениці, рису, картоплі і так далі; целюлоза, така як метилцелюлоза, гідроксипропілметил-целлюлоза або натрію карбоксиметилцелюлоза; і смоли, включаючи гуміарабік і трагакант; а також білки, такі як желатин і колаген. При необхідності можуть бути додані засоби для покращення розпадаємості пігулок або солюбілізатори, такі як поперечно зшитий полівінілпіролідон, агар, альгінова кислота або їх солі, такі як альгінат натрію. Ядра драже забезпечують відповідними покриттями, такими як концентровані розчини цукру, які можуть також містити гуміарабік, тальк, полівінілпіролідон, карбопол гель, поліетиленгліколь та/або діоксид титану, розчини глазурі і відповідні органічні розчинники або суміші розчинників. До покриттів пігулок або драже можуть бути додані барвники або пігменти для ідентифікації продукту або для визначення кількості активної сполуки (тобто дози). Фармацевтичні препарати, які можуть бути використані перорально, включають тверді і м'які капсули з желатину, герметичні капсули з желатину і покриття, такого як гліцерин або сорбіт. Тверді капсули можуть містити активні інгредієнти, змішані з наповнювачем або зв’язуюніжи речовинами, такими як лактоза або крохмалі, змащуючими речовинами, такими як тальк або стеарат магнію, і, необов'язково, стабілізаторами. У м'яких капсулах активні сполуки можуть бути розчинені або суспендовані у відповідних рідинах, таких як жирні кислоти, рідкий парафін або рідкий поліетиленгліколь із стабілізаторами або без них. Композиції, що включають сполуки за даним винаходом, змішані з фармацевтично прийнятним носієм, можуть бути приготовані, поміщені у відповідний контейнер і маркіровані для лікування вказаного стану. Для композицій або препаратів, що включають селен, стани, вказані на етикетці, можуть включати лікування стану, пов'язаного з профілактичним або терапевтичним лікуванням захворювання або стану (наприклад, раку, нейродегенеративного захворювання і когнітивної функції). Фармацевтична композиція може бути представлена у вигляді солі і може бути утворена з багатьма кислотами, включаючи, але не обмежуючись цим, хлороводневу, сірчану, оцтову, молочну, винну, яблучну, бурштинову і так далі. Солі мають схильність бути більш розчинними у водних або інших протонних розчинниках, ніж відповідні форми вільної основи. В інших випадках бажаний препарат може бути ліофілізованим порошком в 1 мМ-50 мМ гістидині, 0,1%2% сахарозі, 2%-7% маніті в діапазоні рН від 4,5 до 5,5, який змішують з буфером перед застосуванням. Для будь-якої сполуки, використаної в способах за даним винаходом, терапевтично ефективна доза може бути спочатку визначена з аналізів у клітинних культурах. Потім, бажано, доза може бути підібрана в моделях на тваринах (зокрема, в мишачих моделях) для досягнення заданого діапазону циркулюючої концентрації. Терапевтично ефективна доза відноситься до такої кількості, яка покращує або запобігає симптомам стадії захворювання або стану (наприклад, шляхом зміни генної експресії). Токсичність і терапевтична ефективність таких сполук може бути визначена стандартними фармацевтичними процедурами в клітинних культурах або експериментальних тваринах, наприклад, для визначення LD50 (дози, летальної для 50% популяції) і ED50 (дози, терапевтично ефективної для 50% популяції). Співвідношення доз між токсичним і терапевтичним ефектом є 17 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 терапевтичним індексом, і він може бути виражений як відношення LD 50/ED50. Сполуки, які демонструють високі терапевтичні індекси, є бажаними. Дані, отримані з цих аналізів у клітинних культурах і додаткових дослідженнях на тваринах, можуть бути використані для підбору діапазону доз для застосування у людей. Доза таких сполук, бажано, лежить у діапазоні циркулюючих концентрацій, який включає ED50 з невеликою токсичністю або без неї. Доза варіюється в межах цього діапазону в залежності від використаної лікарської форми, сприйнятливості пацієнта і способу введення. Точна доза може бути вибрана суб'єктом або лікуючим лікарем, з урахуванням пацієнта, який підлягає лікуванню. Дози і введення регулюються для забезпечення достатніх рівнів активних часток або для підтримки заданого ефекту (наприклад, зміни генної експресії у суб'єкта). Додаткові чинники, які можуть бути взяті до уваги, включають міру хворобливого стану; вік, масу і стать пацієнта; харчування, час і частоту введення, комбінацію(ї) ліків, сприйнятливість і переносимість/реакцію на терапію. Фармацевтичні композиції тривалої дії слід вводити кожні 3-4 дні, один раз на тиждень або один раз на два тижні, або один раз на місяць, залежно від періоду напіввиведення і швидкості виведення з організму конкретної композиції. У деяких варіантах реалізації селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP і так далі) вводять у денній дозі від 25 до 600 мкг на день (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен та/або SGP вводять суб'єктові так, щоб забезпечувати пацієнтові від 25 до 600 мкг селену щодня). У бажаних варіантах реалізації селен вводять у денній дозі від 50 до 200 мкг на день. У інших бажаних варіантах реалізації селен вводять у денній дозі від 100 до 200 мкг на день. Можуть бути використані дози за межами 25 - 600 мкг. У деяких варіантах реалізації однократну дозу селену (наприклад, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP і так далі) вводять один раз на день. У інших варіантах реалізації щодня може бути введено 2, 3, 4 або більше доз (наприклад, один раз вранці і один раз увечері, або один раз кожні 4-6 годин). Наприклад, у деяких варіантах реалізації селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP) водять суб'єктові трьома окремими, більш ніж трьома окремими, двома окремими або менше, ніж двома окремими дозами. У деяких бажаних варіантах реалізації денну дозу вводять у капсулі з тимгодиним вивільненням. У деяких бажаних варіантах реалізації денна доза складає 25-75 мкг селену (наприклад, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP і так далі). В інших бажаних варіантах реалізації денна доза складає 200 мкг селену (наприклад, органічного селену, дріжджів, які містять селен, SEL-PLEX, розчинної селену, водорозчинного селену, SGP і так далі). Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть бути введені багатьма способами залежно від того, чи необхідне локальне або системне лікування, а також від області, що підлягає лікуванню. Введення може бути локальним (включаючи офтальмічне і введення в слизові оболонки, включаючи вагінальну і ректальну доставку), легеневим (наприклад, шляхом інгаляції або інсуфляції порошків або аерозолів, включаючи введення за допомогою розпилювача; інтратекальним, інтраназальним, епідермальним і трансдермальним), пероральним або парентеральним. Парентеральне введення включає внутрішньовенну, внутрішньоартеріальну, підшкірну, внутрішньочеревну або внутрішньом'язову ін'єкцію або інфузію; або внутрішньочерепним, наприклад, інтратекальним або внутрішньошлуночковим введенням. Композиції і препарати, що включають селен, імовірно є особливо застосовними для перорального введення. Композиції фармацевтичних засобів, що містять селен (наприклад, такі, що містять SGP) нутрицевтиків та/або добавок для локального введення можуть включати трансдермальні пластири, мазі, лосьйони, креми, гелі, краплі, супозиторії, спреї, рідини і порошки. Можуть бути необхідні або бажані стандартні фармацевтичні носії, водні, порошкові або олійні основи, загусники і тому подібні. Композиції і препарати для перорального введення включають порошки або гранули, суспензії або розчини у воді або неводному середовищі, капсули, саше або пігулки. Можуть бути бажані загусники, ароматизатори, розчинники, емульгатори, диспергатори або з’вязуючі речовини. Композиції і препарати для парентерального, інтратекального або внутрішньошлуночкового введення можуть включати стерильні водні розчини, які можуть містити також буфери, розчинники або інші відповідні добавки, такі як, але не обмежуючись цим, підсилювачі проникності, сполуки-носії і інші фармацевтично прийнятні носії або формотворні засоби. Так, у деяких варіантах реалізації композиції фармацевтичних засобів, нутрицевтиків та/або добавок за даним винаходом включають, але не обмежуючись цим, розчини, емульсії і композиції, що містять ліпосоми. Ці композиції можуть бути отримані з різних компонентів, які 18 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 включають, але не обмежуючись цим, заготовлені рідини, самоемульгуючі тверді речовини, і самоемульгуючі напівтверді речовини. Композиції фармацевтичних засобів, нутрицевтиків та/або добавок за даним винаходом, які можуть бути для зручності представлені в одиничній лікарській формі, можуть бути отримані відповідно до стандартних методик, добре відомих у фармацевтичній промисловості. Такі методики включають стадію змішування активних інгредієнтів з фармацевтичним носієм(ями) або формотворним засобом(ами). Як правило, такі композиції готують рівномірним і ретельним змішуванням активних інгредієнтів з рідкими носіями або тонко подрібненими твердими носіями, або з ними обома, а потім, при необхідності, формуванням продукту. У деяких варіантах реалізації композиції за даним винаходом, що містять селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP), можуть бути приготовані у вигляді будь-якої з багаточисельних можливих лікарських форм, таких як, але не обмежуючись цим, пігулки, капсули, рідкі сиропи, м'які гелі, супозиторії та клізми. Композиції за даним винаходом можуть бути приготовані також у вигляді наночасток (наприклад, нанокапсули), бульбашок, ліпосом, полімерів (наприклад, молекулярно фіксовані полімери (MIP), біорозкладаних полімерів з повільним вивільненням, полікатіонних полімерів з тимгодиним вивільненням і так далі. Композиції за даним винаходом можуть бути представлені у вигляді суспензій у водних, неводних або змішаних середовищах. Водні суспензії можуть додатково містити речовини, що збільшують в'язкість суспензії, включаючи, наприклад, карбоксиметилцелюлозу натрію, сорбіт та/або декстран. Суспензія може також містити стабілізатори. В одному варіанті реалізації даного винаходу композиції фармацевтичних засобів / або добавок можуть бути приготовані і використовуватись у вигляді пін. Піни включають такі композиції як, але не обмежуючись цим, емульсії, мікроемульсії, креми, желе і ліпосоми. Хоча ці композиції, в основному, близькі за природою, вони відрізняються за складом і консистенцією кінцевого продукту. Композиції за даним винаходом, що містять селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP і так далі), можуть додатково містити допоміжні компоненти, що зазвичай містяться у фармацевтичних композиціях. Так, наприклад, композиції можуть містити додаткові, сумісні, біологічно активні матеріали, такі як, наприклад, протизудні засоби, в’яжучі засоби, місцеві анестетики або протизапальні засоби, або можуть містити додаткові матеріали, що застосовуються при фізичному змішуванні різних лікарських форм композицій за даним винаходом, такі як барвники, ароматизатори, консерванти, антиоксиданти, замутнювачі, загусники і стабілізатори. Проте при додаванні такі матеріали не повинні надмірно перешкоджати біологічній активності компонентів або композицій за даним винаходом. Композиції можуть бути стерилізовані і, при необхідності, змішані з допоміжними агентами, наприклад, змащуючими добавками, консервантами, стабілізаторами, зволожуючими засобами, емульгаторами, солями для зміни осмотичного тиску, буферами, барвниками, смаковими добавками та/або ароматичними речовинами і тому подібними, які не проявляють несприятливої взаємодії з нуклеїновою кислотою(ами) композиції. У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені композиції фармацевтичних засобів, нутрицевтиків та/або добавок, що містять (а) одну або декілька форм селену (наприклад, SGP (наприклад, рН-залежну фракцію SGP), розчинний селен, водорозчинний селен, SEL-PLEX) і (b) один або декілька інших агентів (наприклад, живильна речовина, мінерал, терапевтичний засіб і так далі). У даний винахід входять також способи, що включають спільне введення сполук, що включають селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP), описаних у даному документі, з одним або декількома додатковими активними агентами (наприклад, терапевтичним засобом (наприклад, терапевтичним засобом для лікування раку, терапевтичним засобом для лікування хвороби Альцгеймера), антіоксидантом і так далі). Дійсно, в наступному аспекті даного винаходу представлені способи посилення терапій та/або композицій фармацевтичних засобів, нутрицевтиків та/або добавок шляхом спільного введення композиції, що включає селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP (наприклад, рН-залежну фракцію SGP) і так далі) за даним винаходом з профілактичною або терапевтичною композицією фармацевтичного засобу, нутрицевтика та/або добавки. При спільному введенні агенти можуть вводитись паралельно або послідовно. В одному варіанті реалізації сполуки, описані в даному документі, вводять до іншого активного агента(ів). Композиції і способи введення можуть бути будь-якими з описаних вище. Крім того, кожен з двох або більше агентів, що спільно вводяться, можуть бути введені з використанням різних способів або різних композицій. У деяких варіантах реалізації композиція даного винаходу вводиться спільно із засобом для лікування раку. 19 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно, в деяких варіантах реалізації композицію, що містить одну або декілька форм селену (наприклад, SGP (наприклад, рН-залежну фракцію SGP), розчинний селен, водорозчинний селен, SEL-PLEX) вводять системно або локально для інгібування проліферації клітин пухлини і ангіогенезу, та/або ініціації загибелі клітин пухлини в онкологічних пацієнтів. Наприклад, у деяких варіантах реалізації композицію, що включає рН-залежну фракцію SGP (рН 4,0) збагачених селеном дріжджів (наприклад, SEL-PLEX) вводять суб'єктові в таких умовах, що у суб'єкта сприятливим чином регулюється експресія одного або декількох генів, пов'язаних із зростанням раку/пухлини та/або метастаза (наприклад, підвищуючи регулюється або знижуючи регулюється) (дивись, наприклад, Приклад 4). Композиції можуть бути введені внутрішньовенно, інтратекально, внутрішньочеревно, а також перорально. Більше того, вони можуть бути введені самостійно або в комбінації з антипроліферативними ліками. При розгляді комбінацій, мається на увазі, що даний винахід не обмежується конкретною природою вказаної комбінації. Даний винахід охоплює комбінації у вигляді простих сумішей, а також хімічних гібридів. Прикладом останнього є композиція, що містить одну або декілька форм селену, ковалентно зв'язаного із заданим носієм або з активним фармацевтичним засобом. Ковалентне зв’язування може бути виконане за допомогою будь-якого з багатьох наявних у продажу зв’язуючих сполук. Даний винахід не обмежується конкретною природою терапевтичного препарату. Наприклад, такі композиції можуть бути представлені разом з фізіологічно переносимими рідкими, гелеподібними або твердими носіями, розчинниками, ад’ювантами або формотворними засобами. Ці терапевтичні препарати можуть бути введені ссавцям для ветеринарного застосування, як для домашніх, так і для сільськогосподарських тварин, а також для клінічного застосування для людей так само, як і інші терапевтичні засоби. Як правило, доза, необхідна для терапевтичної ефективності, варіюється відповідно до типу використання і способу введення, а також особливих вимог індивідуальних реципієнтів. Такі композиції зазвичай готують у вигляді рідких розчинів або суспензій, або в твердих формах. Пероральні композиції для лікування раку зазвичай включають такі зазвичай використовувані добавки як зв’язуючі речовини, наповнювачі, носії, консерванти, стабілізатори, емульгатори, буфери і формотворні засоби, як, наприклад, фармацевтичні марки маніту, лактози, крохмалю, стеарата магнію, сахарину натрію, целюлози, карбонату магнію і тому подібні. Ці композиції набувають форми розчинів, суспензій, пігулок, пілюль, капсул, композицій стійкого вивільнення або порошків, і зазвичай містять 1-95% активного інгредієнта, бажано, 2%70%. Композиції також готують у вигляді засобів для ін'єкції, у вигляді рідких розчинів або суспензій; також можуть бути приготовані тверді форми, придатні для розчинення або суспендування в рідині перед ін'єкцією. Композиції за даним винаходом часто змішують з розчинниками або формотворними засобами, які є фізіологічно переносимими і сумісними. Відповідними розчинниками і формотворними засобами є, наприклад, вода, сольовий розчин, декстроза, гліцерин або подібні, а також їх комбінації. Крім того, при необхідності композиції можуть містити невеликі кількості допоміжних речовин, таких як зволожуючі засоби або емульгатори, стабілізатори або рН-буферні агенти. У даному винаході знаходить застосування широкий діапазон терапевтичних засобів. Наприклад, будь-який терапевтичний засіб, який може бути спільно введений з композицією, що містить одну або декілька форм селену за даним винаходом, є придатним для застосування в даному винаході. У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлене введення суб'єктові ефективної кількості композиції, що містить одну або декілька форм селену, і щонайменше одного протиракового засобу (наприклад, звичайного протиракового засобу, такого як хіміотерапевтичні ліки та/або променева терапія). Механізм дії протиракового засобу, придатного для застосування в даному документі, включає, але не обмежуючись цим, агенти, що викликають апоптоз, агенти, які ініціюють/викликають пошкодження нуклеїнових кислот, агенти, що інгібують синтез нуклеїнових кислот, агенти, що порушують утворення мікротрубочок, а також агенти, які порушують синтез або стійкість білків. Класи протиракових засобів, придатних для застосування в композиціях і способах за даним винаходом включають, але не обмежуючись цим: 1) алкалоїди, включаючи інгібітори мікротрубочок (наприклад, вінкристин, вінбластин і віндезин і так далі), стабілізатори мікротрубочок (наприклад, паклітаксел (таксол) і доцетаксел і так далі) і інгібітори хроматинової 20 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функції, включаючи інгібітори топоізомерази, такі як епіподофіллотоксини (наприклад, етопозид (VP-16) і теніпозид (VM-26) і так далі, і агенти, що націлені на топоізомеразу I (наприклад, камптотецин і ізиринотекан (CPT-11) і так далі); 2) агенти, що ковалентно зв'язують ДНК (алкілуючі агенти), включаючи азотні іприти (наприклад, мехлоретамин, хлорамбуцил, циклофосфамід, іфосфамід і бусульфан (мілеран) і так далі), нітрозосечовини (наприклад, кармустин, ломустин і семустин і так далі) і інші алкілуючі агенти (наприклад, дакарбазин, гідроксиметилмеламін, тіотепа і мітоцицин і так далі); 3) агенти, що не ковалентно зв'язують ДНК (протипухлинні антибіотики), включаючи інгібітори нуклеїнових кислот (наприклад, дактиноміцин (актиноміцин D) і так далі), антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (дауноміцин і церубідин), доксорубіцин (адриаміцин) і ідарубіцин (ідаміцин) і так далі), антрацендіони (наприклад, антрациклінові аналоги, такі як мітоксантрон і так далі), блеоміцини (бленоксан) і так далі, а також плікаміцин (мітраміцин) і так далі; 4) антиметаболити, включаючи антифолати (наприклад, метотрексат, фолекс і мексат і так далі), пуринові антиметаболіти (наприклад, 6меркаптопурин (6-MP, пуринетол), 6-тіогуанін (6-TG), азатіоприн, ацикловір, ганцикловір, хлордезоксиаденозин, 2-хлордезоксиаденозин (CDA) і 2'-дезоксикоформіцин (пентостатин) і так далі), піримідинові антагоністи (наприклад, фторпіримідини (наприклад, 5-фторурацил (адруцил), 5-фтордезоксиуридин (FdUrd) (флоксуридин)) і так далі), а також цитозинові арабінозиди (наприклад, цитозар (ara-C) і флударабін і так далі); 5) ферменти, включаючи Lаспарагіназу і гідроксисечовину і так далі; 6) гормони, включаючи глюкокортикоїди, такі як антиестроген (наприклад, тамоксифен і так далі), нестероїдні антиандрогени (наприклад, флутамід і так далі) і інгібітори ароматази (наприклад, анастрозол (аримідекс) і так далі); 7) платинові сполуки (наприклад, цисплатин і карбоплатин і так далі); 8) моноклональні антитіла, кон’юговані з протираковими ліками, токсинами та/або радіонуклідами і так далі; 9) модифікатори біологічної відповіді (наприклад, інтерферони (наприклад, IFN-α і так далі) і інтерлейкіни (наприклад, IL-2 і так далі); 10) адоптивну імунотерапію; 11) гепатопоетичні чинники зростання; 12) агенти, що викликають диференціювання клітин пухлини (наприклад, повністю-транс-ретиноєва кислота і так далі); 13) методики генної терапії; 14) методики антисмислової терапії; 15) пухлинні вакцини; 16) терапії, направлені проти пухлинних метастазів (наприклад, батимістат і так далі); і 17) інші інгібітори ангіогенезу. У бажаних варіантах за даним винаходом представлено введення ефективної кількості композиції, що містить одну або декілька форм селену за даним винаходом, і щонайменше одного стандартного протиракового засобу, який викликає апоптоз та/або запобігає проліферації ракових клітин у суб'єкта. У деяких бажаних варіантах реалізації суб'єкт страждає на захворювання, що характеризується метастазом. У інших бажаних варіантах реалізації за даним винаходом представлене введення ефективної кількості композиції, що містить одну або декілька форм селену, і таксан (наприклад, доцетаксел) суб'єктові, страждаючому на захворювання, що характеризується надекспресією білків сімейства Bcl-2 (наприклад, Bcl-2 та/або BCL-XL). Таксани (наприклад, доцетаксел) є ефективним класом протиракових хіміотерапевтичних засобів (дивись, наприклад, K. D. Miller and G. W. Sledge, Jr. Cancer Investigation, 17:121-136 (1999)). Хоча даний винахід не обмежується яким-небудь конкретним механізмом, таксанопосередкована загибель клітин імовірно відбувається за рахунок внутрішньоклітинної стабілізації мікротрубочок з подальшою ініціацією апоптичного шляху (дивись, наприклад, S. Haldar et al., Cancer Research, 57:229-233 (1997)). У деяких інших варіантах реалізації спеціально маються на увазі цисплатин і таксол для застосування з композицією, що містить одну або декілька форм селену за даним винаходом. У деяких варіантах реалізації будь-який фармацевтичний засіб, що зазвичай використовується в контексті терапії раку, знаходить застосування в даному винаході. Стандартні протиракові засоби, що застосовні для введення з описаними композиціями, що містять одну або декілька форм селену, включають, але не обмежуючись цим, адриаміцин, 5-фторурацил, етопозид, камтотецин, метотрексат, актиноміцин-D, мітоміцин С або, бажаніше, цисплатин. У деяких варіантах реалізації за даним винаходом терапевтичні засоби лікування додатково включають один або декілька агентів, що безпосередньо зшивають нуклеїнові кислоти (наприклад, ДНК) для полегшення руйнування ДНК, що призводить до синергетичних антинеопластичних агентів за даним винаходом. Наприклад, можуть бути використані такі агенти, як цисплатин і інші ДНК-алкілуючі агенти. Агенти, що можуть ушкоджувати ДНК, включають також сполуки, що перешкоджають реплікації ДНК, митозу і хромосомній сегрегації. Такі хіміотерапевтичні сполуки включають, але не обмежуючись цим, адриаміцин, відомий також як доксорубіцин, етопозид, верапаміл, подофіллотоксин і тому подібні. Ці сполуки широко використовують у клінічних умовах для лікування неоплазми, і їх вводять болюсними ін'єкціями внутрішньовенно в дозах, що 21 UA 114082 C2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2 знаходяться в діапазоні від 25-75 мг/M з інтервалом 21 день для адриаміцина, до 35-50 мг/M для етопозида, внутрішньовенно, або подвійною внутрішньовенною дозою перорально. Агенти, які порушують синтез і точність відтворення попередників і субодиниць нуклеїнових кислот, також призводять до руйнування ДНК і знаходять застосування як хіміотерапевтичні засоби в даному винаході. Було розроблено багато попередників нуклеїнових кислот. Особливо застосовними є засоби, які пройшли обширні випробування і є легкодоступними. Тому такі агенти як 5-фторурацил (5-FU) бажано використовуються неопластичними тканинами, що робить ці агенти особливо застосовними для направленої дії на неопластичні клітини. Дози, що доставляються, можуть варіюватися від 3 до 15 мг/кг/день, хоча інші дози можуть істотно варіюватися відповідно до різних чинників, включаючи стадію захворювання, податливість клітин до вказаної терапії, міру стійкості до цих агентів і тому подібні. У бажаних варіантах протиракові засоби (наприклад, антиангіогенні чинники, розглянуті в даному документі) використовують у даному документі як засоби, які піддаються спільному введенню з композицією, що містить одну або декілька форм селену, або іншим чином пов'язані з композицією, що містить одну або декілька форм селену, так що вони можуть бути доставлені в організм суб'єкта, тканину або клітину без втрати здатності піддаватись протираковій дії. Детальніший опис протиракових терапевтичних засобів, таких як платинові комплекси, верапаміл, подофіллотоксин, карбоплатин, прокарбазин, мехлоретамін, циклофосфамід, камптотецин, іфосфамід, мелфалан, хлорамбуцил, бісульфан, нітрозомочевина, адриаміцин, дактиноміцин, даунорубицин, доксорубицин, блеоміцин, плікоміцин, мітоміцин, етопозид (VP16), тамоксифен, таксол, трансплатина, 5-фторурацил, вінкристин, вінбластин і метотрексат, а також інші аналогічні протиракові засоби, фахівці в даній області можуть знайти, звернувшись до будь-якої кількості інструктивних керівництв, включаючи, але не обмежуючись цим, Physician's Desk reference and to Goodman and Gilman's "Pharmaceutical Basis of Therapeutics" ninth edition, Eds. Hardman et al., 1996. V.Антиоксиданти У деяких варіантах реалізації за даним винаходом антиоксиданти вводять спільно з композиціями або препаратами за даним винаходом. Даний винахід не обмежується конкретним типом використаного антіоксиданту. Дійсно, мається на увазі, що різні антиоксиданти є застосовними в даному винаході, включаючи, але не обмежуючись цим, алкіловані дифеніламіни, N-алкіловані фенілендіаміни, феніл-.альфа.-нафтиламін, алкілований феніл-.альфа.-нафтиламін, диметилхіноліни, триметилдигідрохіноліни і олігомерні композиції, отримані з них, стерично утруднені фенольні сполуки, алкіловані гідрохінони, гідроксиловані тіодифенілові ефіри, алкіліденбісфеноли, тіопропіонати, дитіокарбамати металів, 1,3,4димеркаптотіадіазол і похідні, розчинна в олії сполуки міді і тому подібні, Naugalube.RTM. 438, Naugalube 438L, Naugalube 640, Naugalube 635, Naugalube 680, Naugalube AMS, Naugalube APAN, Naugard PANA, Naugalube TMQ, Naugalube 531, Naugalube 431, Naugard BHT, Naugalube 403 і Naugalube 420, аскорбінова кислота, токофероли, включаючи альфа-токоферол, водорозчинні антиоксиданти, такі як сульфгідрильні сполуки і їх похідні (наприклад, натрію метабісульфіт і N-ацетил-цистеїн), ліпоєва кислота і дигідролвпоєва кислота, ресвератрол, лактоферин, похідні аскорбінової кислоти (наприклад, аскорбіл пальмітат і аскорбіл поліпептид), бутильований гідрокситолуол, ретиноїди (наприклад, ретинол і ретиніл пальмітат), токотриєноли, убіхінон, екстракти, що містять флавоноїди і ізофлавоноїди, і їх похідні (наприклад, геністеїн і діадзеїн), екстракти, що містять ресвератрол, і тому подібні, екстракти виноградних кісточок, зеленого чаю, соснової кори, прополісу, Irganox1010, 1035, 1076, 1222 (виробництва Ciba Specialty Chemicals Co., Ltd.), Antigene P, 3C, FR, Sumilizer GA-80 (виробництва Sumitomo Chemical Industries Co., Ltd.), бета-каротин, лікопен, вітаміни С, Е і А і інші речовини. Хоча розуміння механізму не є обов'язковим для практичного здійснення за даним винаходом, і даний винахід не обмежується яким-небудь конкретним механізмом дії, в деяких варіантах реалізації введення композиції, що містить селен (наприклад, розчинний селен, SGP) суб'єктові змінює профілі генної експресії (наприклад, TGFB1, MAPK8, C1R, UBE4A, SMPX, USP22 і PTP4A1) у суб'єкта. У деяких варіантах реалізації введення композиції, що містить селен (наприклад, розчинний селен, SGP), суб'єктові знижує міру пошкодження ДНК (наприклад, у тканині головного мозку (наприклад, неокортексі), м'язовій тканині, жировій тканині і так далі) суб'єкта. У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлений спосіб зниження чутливості клітин до цитотоксичности H2O2, що включає введення в клітини композиції, що містить селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинмий селен, SGP, SEL-PLEX і так далі). 22 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У даному винаході додатково представлений спосіб зменшення супероксидних радикалів у суб'єкта (наприклад, у суб'єкта, який страждає на оксидативний стрес), що включає введення композиції (наприклад, харчової добавки), що включає селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP, SEL-PLEX і так далі) суб'єктові. Більш того, у деяких варіантах реалізації даного винаходу показано, що суб'єкти, отримуючі певні композиції, що включають селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP, SEL-PLEX і так далі), мають покращену здатність переносити оксидативний стрес. Хоча розуміння механізму не є необхідним для практичного здійснення даного винаходу, і даний винахід не обмежується якимнебудь конкретним механізмом дії, у деяких варіантах реалізації суб'єкти, які отримують композицію, що включає селен (наприклад, дієтичну добавку, що включає селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP, SEL-PLEX і так далі)), мають покращену здатність справлятися з оксидативним стресом завдяки здатності деяких форм селену (наприклад, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) змінювати (наприклад, знижувати) рівень супероксидних радикалів в організмі суб'єкта. Мається на увазі, що композиції і способи за даним винаходом знайдуть застосування в різних областях, включаючи, але не обмежуючись цим, дослідження і клінічну діагностику. VI. Носії У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлена доставка селену (наприклад, селеноглікопротеїна) за допомогою одного або декількох носіїв, що включають, але не обмежуючись цим, наночастки (наприклад, нанокапсули), бульбашки, ліпосоми, полімери (наприклад, молекулярно фіксовані полімери (MIP), полімери з повільним вивільненням, полікатіонні полімери і полімеросоми. У деяких варіантах реалізації носій селену забезпечує введення, таргетинг та/або тимгодине вивільнення сполук, що містять селен (наприклад, водорозчинного селену, SGP) в організмі суб'єкта (наприклад, людини або тварини). У деяких варіантах реалізації носії (наприклад, полімер з повільним вивільненням, нанокапсула, MIP, полімеросоми і так далі) підсилюють доставку сполук, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) суб'єктові. У деяких варіантах реалізації носії (наприклад, полімер з повільним вивільненням, нанокапсула, MIP, полімеросоми і так далі) збільшують біодоступність сполук, які містять селен (наприклад, органічного селену, розчинної селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) суб'єкту. Даний винахід не обмежується типом використаного носія. Дійсно, можуть бути використані різні носії, включаючи, але не обмежуючись цим, дендримери, полімеросоми, наночастки, полімери повільного вивільнення, нанокапсули, молекулярно фіксовані полімери та/або інший тип носія (наприклад, будь-який з носіїв, описаних у даному документі). В одному бажаному варіанті реалізації носієм є полімер з повільним вивільненням. У іншому бажаному варіанті реалізації носієм є молекулярно фіксований полімер. У іншому бажаному варіанті реалізації носієм є полімеросома, що використовується для інкапсуляції селеноглікопротеїна. Даний винахід не обмежується типом використаної полімеросоми. Дійсно, можуть бути використані полімеросоми, відомі в даній області. У деяких варіантах реалізації полімеросома включає полі(етиленоксид) (PEO) блок-співполімер. Проте даний винахід не обмежується цим. Може бути використаний будь-який відомий блок-співполімер, включаючи, наприклад, полі(етилетилен) (PEE), полі(бутадієн (PB або PBD), полі(стирол) (PS) і полі(ізопрен) (PI). У деяких варіантах реалізації полімер включає полі(ε-капролоктон)(PCL) диблок-співполімер. У деяких варіантах реалізації полімеросома включає диблок-співполімери на основі полі(етиленоксид)-блок-полі(ε-капролоктон) (PEO-b-PCL). У деяких варіантах реалізації полімеросома включає блок-співполімер, що є триблок-, тетраблок-, пентаблок- або щонайменше шестиблоковим співполімером. У деяких варіантах реалізації полімеросома отримана шляхом скріплення полі(молочної кислоти), полі(гліколіду), полі(молочної-согліколевої кислоти) і полі(3-гідроксибутирата) з PEO. Даний винахід не обмежується розміром полімеросоми, що інкапсулює селеноглікопротеїн. У композиціях і способах за даним винаходом знаходять застосування різні розміри, включаючи, але не обмежуючись цим, полімеросоми, інкапсулюючі селеноглікопротеїни, розмір яких складає близько 50-300 нм у діаметрі, хоча можуть бути використані більші (наприклад, близько 350 нм, 400 нм, 500 нм або більше) або дрібні (наприклад, близько 40 нм, 30 нм, 20 нм або менше) полімеросоми, що інкапсулюють селеноглікопротеїни. У деяких варіантах реалізації даний винахід включає нанокапсули з контрольованим вивільненням SGP і MIP сфери для забезпечення рівномірної і безпечної доставки органічного селену (наприклад, молекулярно фіксовані полімери (MIP), полімери з повільним вивільненням і так далі) у порівнянні з іншими формами селену (наприклад, капсулами або пілюлями разових 23 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доз збагачених селеном дріжджами, SEL-PLEX або неорганічного селену). У деяких варіантах реалізації використовують водорозчинні, розчинні та/або SGP для ефективної інкапсуляції і доставки селену шляхом покращених способів доставки, описаних в даному документі (наприклад, наночастки (наприклад, нанокапсули), бульбашки, полімери (наприклад, молекулярно фіксовані полімери (MIP), полімери з повільним вивільненням і так далі) та/або полімеросоми). В іншому варіанті реалізації покращені способи доставки, описані в даному документі, підсилюють біодоступність інкапсульованого селену (наприклад, SGP або розчинного селену). У деяких варіантах реалізації покращені способи доставки, описані в даному документі, забезпечують повільне вивільнення (наприклад, 12 годин, 24 години, 2 дні, 1 тиждень, 2 тижні, 3 тижні, 10 тижнів і так далі) селену в розчин, організм суб'єкта, сироватку і так далі. У деяких варіантах реалізації даного винаходу представлені полімери з повільним вивільненням як носій для композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP і так далі) даного винаходу. Полімери з повільним вивільненням, такі як полі(молочна кислота-співгліколева кислота) (PLGA) або полікатіонні полімери, такі як поліетиленімін (PEI) можуть бути використані як носії. У деяких варіантах реалізації полімери з повільним вивільненням забезпечують контрольовану доставку композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі). У деяких варіантах реалізації контрольована доставка відбувається при раціональному змішуванні полімеру (наприклад, PEI), природного або синтетичного, з композицією, що містить селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) і необов'язково інших активних або неактивних засобів таким чином, що композиція, що містить селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) вивільняється з цього матеріалу заданим чином. Вивільнення композиції, що містить селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) може бути постійним протягом довгого періоду часу, воно може бути циклічним протягом довгого періоду часу, або воно може запускатись навколишніми умовами або іншими зовнішніми подіями. У деяких варіантах реалізації контрольована доставка забезпечує ефективнішу терапію. У деяких варіантах реалізації контрольована доставка виключає потенційну можливість нижчої дози або передозування. Інші переваги використання систем контрольованої доставки можуть включати підтримку рівнів селену в заданому діапазоні, необхідність рідшого введення і покращене дотримання хворим режиму і схеми лікування. У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені полімеросоми як носії для композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) за даним винаходом. У деяких варіантах реалізації полімеросоми отримують з використанням амфіфільних синтетичних блокспівполімерів з утворенням мембрани бульбашок, які мають радіус у діапазоні від близько 50 нм до близько 10 мкм або більше (дивись, наприклад, Discher et al. Journal of Physical Chemistry B (2002), 106(11), 2848-2854), включений у цей документ шляхом посилання в повному обсязі). У деяких варіантах реалізації полімеросоми в своєму ядрі містять водний розчин, і вони є придатними для інкапсуляції і захисту молекул, таких як композиції, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) і необов'язково одного або декількох ліків, ферментів, інших білків і пептидів, а також фрагментів ДНК і РНК. У деяких варіантах реалізації мембрана полімеросоми забезпечує фізичний бар'єр, який відокремлює інкапсульований матеріал від зовнішніх матеріалів, таких як ті, що знаходяться в біологічних системах. У деяких варіантах реалізації полімеросоми забезпечують вивільнення вмісту з їх ядер залежно від часу (наприклад, композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SELPLEX і так далі)). У деяких варіантах реалізації застосування синтетичних полімерів для створення полімеросом забезпечує розробникам можливість маніпулювати характеристиками мембрани і за допомогою цього контролювати проникність, швидкість вивільнення, стійкість і інші властивості. У одному варіанті реалізації композиції за даним винаходом, що містять селен (наприклад, розчинний селен, водорозчинний селен, SGP), можуть бути інкапсульовані усередині полімеросом на основі полі(етиленоксид)-блок-полі(ε-капролоктона (PEO-b-PCL). Хоча розуміння механізму не є обов'язковим для практичного здійснення за даним винаходом, і даний винахід не обмежується яким-небудь конкретним механізмом дії, в деяких варіантах реалізації PEO забезпечує покращену хімічну і механічну стійкість отриманого носія in vitro, збільшену біодоступність in vivo і пролонговані періоди напіввиведення з кровотоку. PCL, добре відомий біоматеріал, що імплантується, утворює мембрану полімеросоми і полегшує повне і 24 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 безпечне розкладання in vivo продукту, що утворюється, шляхом гідролізу його складноефірних зв'язків. У іншому варіанті реалізації композиції, що містять селен (наприклад, селеноглікопротеїни) за даним винаходом можуть бути інкапсульовані в полімеросоми, синтезовані з сумішей або чистих похідних інших біорозкладаних блок-полімерів, отриманих шляхом скріплення полі(молочної кислоти), полі(гліколіду), полі(молочної-согліколевої кислоти) або полі(3гідроксибутирата) з PEO. У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені нанокапсули (Couvreur et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2002;19(2):99-134, включений в цей документ шляхом посилання в повному обсязі) як носії для композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) за даним винаходом (дивись, наприклад, патент США № 7498045, включений у цей документ шляхом посилання в повному обсязі). У деяких варіантах реалізації нанокапсули забезпечують контрольоване вивільнення композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) при біорозкладанні нанокапсули. У деяких варіантах реалізації нанокапсули мають періоди біологічного напіврозкладання від близько 2 до близько 100 годин (наприклад, близько 2 годин…4 годин…6 годин...12 годин...24 годин... 48 годин... 96 годин і так далі). У деяких варіантах реалізації біорозкладані нанокапсули за даним винаходом можуть бути пристосовані для контрольованого вивільнення композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SELPLEX і так далі) і необов'язково різних інших інкапсульованих терапевтичних засобів, включаючи макромолекули, в in vivo кровообіг суб'єкта при введенні в організм суб'єкта. Композиції нанокапсул за даним винаходом додатково пристосовані для інкапсуляції терапевтично ефективних концентрацій композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP і так далі) і їх доставки в in vivo кровообіг реципієнта. У деяких варіантах реалізації нанокапсула, яка інкапсулює композиції, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі), є мембраною, що включає, наприклад, співполімер полімеру полімолочной кислоти і поліетиленгліколя. У деяких варіантах реалізації нанокапсули утворені міжфазною полімеризацією мономера або міжфазним наноосадженням заздалегідь утвореного полімеру. У деяких варіантах реалізації за даним винаходом представлені молекулярно фіксовані полімери як носії для композицій, що містять селен (наприклад, органічного селену, розчинного селену, водорозчинного селену, SGP, SEL-PLEX і так далі) за даним винаходом (Mosbach. Trends in Biochemical Sciences, том 7, сс. 92-96, 1994., Wulff. Trends in Biotechnology, том 11, сс. 85-87, 1993., Andersson, et al., Molecular Interactions in Bioseparations (Ngo. T. T. ed.), сс. 383394)., патент США № 5959050, включені в цей документ шляхом посилання в повному обсязі. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА Наступні приклади представлені для демонстрації і додаткової ілюстрації деяких бажаних варіантів реалізації і аспектів даного винаходу, і їх не слід тлумачити як обмеження рамок даного винаходу. ПРИКЛАД 1 A. Послідовне отримання розчинних селеноглікопротеїнів з SEL-PLEX кислотною екстракцією з подальшим осадженням 4 л тригорлий реактор (екстрактор №1, дивись Фігуру 1), оснащений механічною мішалкою, термометром і електричною ковдрою, наповнили 3 л деіонізованої H2O і 50 мл 0,3 н. HCl. Реактор нагрівали приблизно до 50 °C і частинами додавали 600 г SEL-PLEX при концентрації 1600 м.д., при перемішуванні. Приблизно за годину температура досягала 80 °C, а рН суміші складав 2,23. рН знижували до 1,5 додаванням 13,5 мл 0,3 н. HCl. Реакційну посудину підтримували при нагріванні і перемішуванні протягом 7 годин. рН суміші перевіряли приблизно один раз на годину, щоб переконатися, що рівень рН залишається при 1,5. Після реакції кислотну суміш (рН 1,5) розподіляли в чотири 1 л банки для центрифугування (центрифуга №1, дивись Фігуру 1) при відносній силі центрифугування (RCF) 4000 на 20 хвилин при 8 °C. Збирали надосадну рідину (рН 1,5) і осад твердої речовини. Надосадну рідину додавали в 3 л 3горлий реактор (змішувач №1, дивись Фігуру 1) на крижаній бані (4 °C) і приєднували краплинну воронку, що містить 2 н. NaOH, механічну мішалку і рН електрод. До розчину по краплях додавали 2 н. NaOH при перемішуванні до досягнення рН суміші 1,85. При додаванні NaOH утворювався білий осад. Перемішування продовжували протягом 30 хвилин, і знову центрифугували суміш (центрифуга №2, дивись Фігуру 1),отримуючи надосадну рідину і осад селеноглікопротеїна. Осад селеноглікопротеїна збирали і висушували заморожуванням 25 UA 114082 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 (ліофільна сушарка №1, дивись Фігуру 1), отримуючи 1,635 г білого осаду. Надосадну рідина з рН 1,85 і осадом, утвореним при рН 1,5, додавали в реакційну судину (змішувач №2, дивись Фігуру 1) і поміщали на крижану баню (4 °C). Суміш перемішували протягом 30 хвилин, а потім центрифугували (центрифуга №3, дивись Фігуру 1 і Фігуру 2), отримуючи вологі тверді речовини залишку і надосадну рідину з рН 1,6, яку пізніше використовували для отримання SGP за допомогою подальшого рН-залежного осадження (наприклад, фракцій SGP з рН 3,0, рН 4,0 і рН 6,0, як описано нижче). B. pH-залежне осадження селеноглікопротеїнів Надосадну рідину з рН 1,6 поміщали в реактор (змішувач №3, дивись Фігуру 2) і додавали до розчину 2 н. NaOH при перемішуванні до досягнення рН суміші 3,0. Перемішування продовжували ще 30 хвилин і центрифугували суміш (центрифуга №4, дивись Фігуру 2), отримуючи надосадну рідину і осад селеноглікопротеїна. Осад селеноглікопротеїна при рН 3,0 (SGP з рН 3,0) збирали і висушували заморожуванням (ліофільна сушарка №2, дивись Фігуру 2), отримуючи світло-сірий осад. Надосадну рідину з рН 3,0 поміщали в реактор (змішувач №4, дивись Фігуру 2) і додавали до розчину 2 н. NaOH до збільшення рН розчину до 4,0. Перемішування продовжували ще 30 хвилин і центрифугували суміш (центрифуга №5, дивись Фігуру 2), отримуючи надосадну рідину і осад селеноглікопротеїна. Осад селеноглікопротеїна з рН 4,0 (SGP з рН 4,0) збирали і висушували заморожуванням (ліофільна сушарка №3, дивись Фігуру 2), отримуючи світло-сірий осад. Надосадну рідину з рН 4,0 поміщали в реактор (змішувач №5, дивись Фігуру 2) і додавали до розчину 2 н. NaOH до збільшення рН розчину до 6,0. Перемішування продовжували ще 30 хвилин і центрифугували суміш (центрифуга №6, дивись Фігуру 2), отримуючи надосадну рідину і осад селеноглікопротеїна. Осад селеноглікопротеїна з рН 6,0 (SGP з рН 6,0) збирали і висушували заморожуванням (ліофільна сушарка №4, дивись Фігуру 2), отримуючи світло-сірий осад. Осади, що утворилися згодом, збирали центрифугуванням. Потік стічної води з рН 6,0 з останнього центрифугування містив деяку кількість селенопептидів, олігосахаридів манози і глюкози (наприклад, які можуть бути використані при отриманні живильного середовища для дріжджів або іншої живильної речовини). У даному процесі не утворюються токсичні відходи, і він є екологічно безпечним. ПРИКЛАД 2 Виділення і визначення розчинного SGP Осад, що містив тверді залишки при рН 1,5, утворений кислотною екстракцією SEL-PLEX, промивали надосадною рідиною з рН 1,85 з другої екстракції (дивись Приклад 1) для зниження об'єму води, використаної в процесі, і для розчинення більшої частини SGP, затриманих в осаді. Твердий залишок після третього центрифугування з рН 1,6 містив значну кількість селену і міг бути змішаний зі свіжою партією селенових дріжджів перед розпилювальною сушкою, повністю використовуючи матеріал, узятий для екстракції. Загальний вміст селену, процентну концентрацію білка і масу кожної фракції SGP усереднювали після трьох послідовних екстракцій з SEL-PLEX (дивись Таблицю 1). Екстраговані фракції SGP складалися з 2,0-2,5 мас.% SEL-PLEX і 4,3-5,75% загального селену, який був присутній у SEL-PLEX до екстракції. Була відмічена позитивна кореляція між рН фракцій SGP і масою білка, а зворотне є вірним для загальної концентрації селену (дивись Таблицю 1). Середня маса білка для фракцій SGP знаходилася в діапазоні від близько 65 до 90% по масі, а концентрація селену для того ж набору фракцій знаходилася в діапазоні від близько 2900 м.д. до 4900 м.д. Фракції SGP містили від 4 до 37 масових % вуглецевої складової. Таблиця 1. Усереднені результати трьох послідовних екстракцій 600 г SEL-PLEX pH Концентрація Se Маса білка Маса фракції [м.д.] [%] [г] 1,85 3,0 4,0 6,0 50 4887 3836 3250 2915 65,55 76,04 87,74 91,81 1,635 5,652 3,634 1,757 Гель-електрофорез фракції SGP з рН 1,5, отриманної кислотною екстракцією SEL-PLEX, виявив, що смуги, що відповідають високомолекулярним білкам або білкам з великим вмістом вуглеводів, відсутні. Такий же самий розподіл за розміром, з переважанням низькомолекулярних фракцій, був виявлений з використанням капілярного електрофорезу, і низькомолекулярні білки розміром від 5,1 кДа до 12,2 кДа складали більше 90% сумішей. 26 UA 114082 C2 5 10 15 20 Ексклюзійна хроматографія трьох фракцій SGP з рН 3,0. 4,0 і 6,0 на гелі BIO-RAD P10 (час утримування до 6 годин) і гелі BIO-RAD P30 (час утримування менше однієї години) давала ранній пік з часом утримування 5-10 хвилин і широкий, пізніший пік, з часом утримування 35-60 хвилин. Ранній пік містив значно більше білка: від 64,74 до 75,24%, і істотно вищу концентрацію селену: від 2972 до 4252 м.д. Вміст білка в пізньому піку був набагато нижчий: від 31,66 до 54,95%, і концентрація селену була істотно нижча: від 11,93 до 1858 м.д. Цей тип хроматографії може давати SGP з високим вмістом Se з неочищених фракцій, і він показав низьку гомогенність вуглеводної складової в цих сумішах. Ексклюзійна хроматографія на смолі SUPERDEX Peptide 10/300 GL (AMERSHAM Biosciences; діапазон фракціонування 7,0-100 кДа) з використанням 0,1 М AcONH4 (рН 7,5) різних пептидів з триптичного розщеплювання SEL-PLEX показала такий же самий набір піків для зразків SGP (10-100 кДа і >100 кДа) і абсолютно іншу модель елюювання для зразка SELPLEX. Лише «ранні» піки з часом елюювання менше 20 хвилин містили селен. Елюенти, що містили селен, збирали, ліофілізували і аналізували за допомогою методик SEC ICP MS, MALDI TOF MS і нано ESI MS/MS. Результати були комплементарними і дозволили виявити, ідентифікувати і секвенувати пептиди, що містять селен. Ідентифікацію виявлених білків здійснювали за допомогою бази даних SwissProt (дивись Таблицю 2). Таблиця 2. Ідентифіковані селенопептиди і селенопротеїни з триптичного розщеплювання екстракту SEL-PLEX. Маса SEC виявленого Встановлена послідовність Молярна Аналізована Білок пептиду пептиду маса білка фракція 80 ( Se) [M + (кДа) + H] , Th 653,39 GSDTMRSVSPIRSEQ ID 42 2 701,42 NO: 1 Ylr 190 wp GSDTSeMRSVSPIR SEQ ID NO: 2 637,39 SGMSKK SEQ ID NO: 3 89 3 685,41 SGSeMSKK SEQ ID NO: 4 Фосфатидилінозітол 4 кіназа альфа 587,33 EVIGIDPSSAMLSIAEK 34 2 635,35 SEQ ID NO: 5 Yhr209wp EVIGIDPSSASeMLSIAEK SEQ ID NO: 6 3 637,39 ASeMIVR SEQ ID NO: 7 Рибонуклеаза III 77 1і2 402,10 DYSeMGAAK SEQ ID NO: 8 HSP 12 12 1і2 1і2 25 30 489,55 504,03 SIVPLSeMDR SEQ ID NO: 9 SEMGHDQSGTK SEQ ID NO: 10 HSP 10 10 SIP 18 18 Найбільш несподіваною природою цього способу було те, що білковий склад різних фракцій, отриманих хроматографічним розділенням (наприклад, іонообмінною хроматографією, ексклюзійною хроматографією) різних фракцій SGP з рН-залежного осадження, був однаковим або дуже схожим, за даними використаних електрофоретичних методів (гель-електрофорезу і капілярного електрофорезу). Як описано в даному документі, екстракція селеноглікопротеїнів із збагачених селеном дріжджів була успішною при низькому рН (наприклад, 1,5). Хоча розуміння механізму не є необхідним для практичного здійснення даного винаходу, і даний винахід не обмежується яким-небудь конкретним механізмом дії, в деяких варіантах реалізації, в кислотних умовах, використаних для екстракції SGP, білкові ядра істотно не гідролізуються і здебільше зберігаються в їх первинній формі. У деяких варіантах реалізації рН-залежні фракції селеноглікопротеїна SEL-PLEX (наприклад, SGP з рН 3,0, SGP з рН 4,0, SGP з рН 6,0) отримують і вводять (наприклад, самостійно або в комбінації з іншим агентом) суб'єктові (наприклад, для доставки органічного селену суб'єктові (наприклад, пероральним шляхом)). 35 27 UA 114082 C2 5 ПРИКЛАД 3 Порівняння біодоступності Курчат вигодовували протягом вісімнадцяти днів сімома різними дієтичними складами (дивись Таблиці 3 і 4) для порівняння біодоступності селену з рН-залежного осадження SGP з кислотного екстракту SEL-PLEX шляхом виміру вмісту селену в грудному м'язі курчат: Таблиця 3 Склад і харчова характеристика основного раціону Компонент % Кукурудза 57,80 Соєва мука (48%) 35,00 Кукурудзяна олія 3,20 Вапняк 1,30 Дікальцію фосфат 1,80 Сіль 0,45 Вітамінно-мінеральна суміш (без Se) 0,25 DL-метіонін 0,20 Разом 100 Живильна речовина Калорійність ME, ккал/кг 300 Загальний білок, % 21,5 Ca, % 1,00 Доступний P, % 0,45 Лізин, % 1,21 Метіонін, % 0,54 Метіонін + цистеїн, % 0,89 Na, % 0,20 28