Живильне середовище для розмноження in vitro церцису китайського (cercis chinensis bunge)

Реферат: Живильне середовище для розмноження in vitro церцису китайського (Cercis chinensis Bunge) включає макро- і мікроелементи, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи та регулятори росту. У складі макроелементів містить амоній азотнокислий (NH 4NO3) - 825 мг/л та калій азотнокислий (KNO3) - 950 мг/л. Його амінокислотний склад містить амінооцтову кислоту (гліцин) - 1,0 мг/л. Вітамінний склад доповнено 0,5 мг/л аскорбінової (С) та 1,0 мг/л пантотенової (В 5) кислот. Склад регуляторів росту містить 6-бензиламінопурин (6-БАП) - 1,0 мг/л та 2,4дихлорфеноксіоцтову кислоту (2,4 Д) - 0,1 мг/л. UA 100754 U (54) ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ РОЗМНОЖЕННЯ IN VITRO ЦЕРЦИСУ КИТАЙСЬКОГО (CERCIS CHINENSIS BUNGE) UA 100754 U UA 100754 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до біотехнологічних методів, а саме удосконалення складу живильного середовища для мікроклонального розмноження, що надає широкі можливості для збереження та швидкого масового розмноження морфологічно та генетично однорідного садивного матеріалу найбільш цінних, зокрема для декоративного садівництва, рослин. Рід Церцис (Cercis L.) з родини Бобові (Fabaceae Lindl.) об'єднує 7 видів, які мають Євроазійське та Північноамериканське походження [2, 4-6]. Це цінні декоративні, фітомеліоративні та лікарські рослини. Церцис китайський (Cercis chinensis Bunge) ендемік центрального і західного Китаю. У природних умовах росте на кам'янистих схилах, вапнякових відкладах, галявинах зріджених лісів. Цінується за надзвичайно високі декоративні властивості особливо під час весняного цвітіння та осіннього забарвлення листя. Церцис китайський використовують в озелененні міст, створенні паркових композицій. Він має привабливий вигляд у солітерних посадках і невеликих моногрупах, а також у композиціях з деякими листяними та хвойними рослинами. Крім того церцис китайський належить до рослин з високими показниками нектаропродуктивності, що створюють кормову базу для бджільництва [1]. У природних умовах церцис китайський розмножується насінням. Однак через дуже низьку й нерівномірну, здебільшого розтягнуту до 2-3 років схожість насіння, для розсадників "зеленого будівництва" масове насінне розмноження садивного матеріалу є проблематичним. Крім того, при відтворенні насінням кращі декоративні ознаки не завжди зберігаються в потомстві, а за традиційного вегетативного розмноження живцями, успіх вкорінення не перевищує 3-5 % [2]. Розсадництво із включенням ланки мікроклонального розмноження, як лабораторнопольовий варіант вегетативного розмноження, вже підтвердило свої переваги в роботі з багатьма видами рослин [3, 7-11] як один із перспективних методів отримання морфологічно вирівняного та вивільненого від патогенних мікроорганізмів садивного матеріалу, генетично ідентичного материнській рослині. Для розмноження in vitro деревних культур здебільшого використовують різні модифікації відомих базових живильних середовищ за прописами: Драйвера і Коніюкі, Грешоффа і Доя, Ллойда і Макоуна, Мурасіге і Скуга [8-11] тощо. До їхнього складу входять макро- і мікроелементи, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи та регулятори росту, що сприяють проростанню насіння, диференціації пагонів, утворенню калюсу або розвитку кореневої системи. Однак стосовно церцису китайського наразі у вітчизняній та зарубіжній літературі недостатньо інформації, яка всебічно висвітлювала б усі етапи розмноження цієї цінної рослини in vitro. Відомий найближчий аналог живильного середовища (прототип) для розмноження церцису китайського [7], в якому використано модифіковане базове середовище за прописом Мурасіге і Скуга [11]. При його компонуванні базове середовище було доповнене регуляторами росту, зокрема додано 0,65 мг/л 6-бензиламінопурину (6-БАП) та 0,2 мг/л тідіазурону (ТДЗ), що дало змогу інтенсифікувати проліферацію і морфогенез, порівняно з базовим середовищем і, в кращих варіантах, досягти коефіцієнта розмноження 2,97±0,14, за середньої кількості мікропагонів - 2,5±0,1 і середньої довжини одного мікропагона 23,8±1,3 мм. Задачею корисної моделі є розробка живильного середовища для індукування морфогенезу in vitro з метою збільшення коефіцієнта розмноження церцису китайського. Поставлена задача вирішується тим, що живильне середовище для розмноження in vitro церцису китайського (Cercis chinensis Bunge), яке включає макро- і мікроелементи, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи та регулятори росту, у складі макроелементів містить амоній азотнокислий (NH4NO3) - 825 мг/л та калій азотнокислий (KNO3) - 950 мг/л; його амінокислотний склад містить амінооцтову кислоту (гліцин) - 1,0 мг/л; вітамінний склад доповнено 0,5 мг/л аскорбінової (С) та 1,0 мг/л пантотенової (В5) кислот; а склад регуляторів росту містить 6бензиламінопурин (6-БАП) - 1,0 мг/л та 2,4-дихлорфеноксіоцтову кислоту (2,4 Д) - 0,1 мг/л (табл. 1). 1 UA 100754 U Таблиця 1 Склад модифікованого середовища порівняно зі складом MS-базового та середовища-прототипу Компонент середовища амоній азотнокислий (NH4NO3) калій азотнокислий (KNO3) кальцій хлористий (СаСl2 × 2Н2О) магній сірчанокислий (MgSO4 × 7H2O) калій фосфорнокислий однозаміщений (KН2РО4) MS базове Макроелементи 1650 1900 440 370 170 Мікроелементи борна кислота (Н3ВО3) 6,2 марганець сірчанокислий (MnSO4 × 4H2O) 22,3 кобальт хлористий (СоСl2 × 6Н2О) 0,025 мідь сірчанокисла (CuSO4 × 5H2O) 0,025 цинк сірчанокислий (ZnSO4 × 7H2O) 8,6 натрій молібденовокислий (Na2MoO4 × 0,25 2H2O) калій йодистий (KJ) 0,83 Джерело заліза залізо сірчанокисле (FeSO4 × 7H2O) 37,8 етилендіамінтетраацетат натрію (Na2EDTA 27,8 × 2H2O) Амінокислоти амінооцтова кислота (гліцин) 2.0 Вітаміни тіамін-НСl (В1) 0,1 піридоксин-НСl (В6) 0,5 нікотинова кислота (РР) 0,5 аскорбінову кислота (С) пантотенова кислота (В5) мезо-інозит 100 Регулятори росту 6-бензиламінопурин (6-БАП) 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота (2,4 Д) тідіазурон (ТДЗ) Джерело вуглеводів Сахароза 30000 5 10 15 MS прототип MS модифіковане 1650 1900 440 370 825 950 440 370 170 170 6,2 22,3 0,025 0,025 8,6 6,2 22,3 0,025 0,025 8,6 0,25 0,25 0,83 0,83 37,8 37,8 27,8 27,8 2,0 1,0 0,1 0,5 0.5 100 1,0 0,5 0,5 0,5 1,0 100 0,65 0,2 1,0 0,1 30000 30000 Пропонований нами склад модифікованого живильного середовища відрізняється від базового та найближчого аналогу тим, що у складі його макроелементів удвічі зменшено вміст амонію азотнокислого (NH4NO3) та калію азотнокислого (KNO3), а в амінокислотному складі вдвічі зменшено вміст амінооцтової кислоти (гліцину). Вітамінний склад натомість доповнено аскорбіновою (С) та пантотеновою (В5) кислотами. Істотно змінено склад регуляторів росту додаванням 6-бензиламінопурину (6-БАП) та 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-Д), яких не було у прописі базового середовища. Вміст наявного у складі найближчого аналогу 6-БАП було збільшено нами від 0,65 до 1,0 мг/л, а вилучений з прототипу тідіазурон замінено на 0,1 мг/л 2,4-Д. Що стосується вмісту решти компонентів, у пропонованому корисною моделлю середовищі використано макро- і мікроелементи за прописом Мурасіге і Скуга [11], а кислотність усіх трьох середовищ (базового, прототипу і модифікованого) не виходила за межі рН=5,6-5,8. Зазначені модифікації сприяли прискоренню ініціації морфогенезу і суттєвому збільшенню коефіцієнта розмноження. Зокрема в експлантів, введених на пропоноване корисною моделлю середовище, початок морфогенезу спостерігали через 8 діб, що на 4 доби менше, ніж на базовому MS середовищі і на 9 діб перевищує показник прототипу (табл. 2). 2 UA 100754 U Таблиця 2 Показники ефективності розмноження церцису китайського in vitro Середовище MS базове MS прототип MS модифіковане Середнє по досліду 5 10 15 20 25 30 35 Вивчено експлантів, шт. 125 107 118 Кількість діб від Кількість Середня введення до пагонів з довжина Коефіцієнт початку одного мікропагона, розмноження морфогенезу експланта, шт. мм 12 1,5±0,1 18,4±0,8 1,38±0,06 17 2,5±0,1 23,8±1,3 2,97±0,14 8 3,2±0,2 31,2±1,5 4,99±0,26 12 2,410.1 24,5±1,3 3,11±0,15 За використання модифікованого середовища середня кількість мікропагонів, що розвивалися з одного введеного на модифіковане середовище експланта, становила 3,2±0,2 шт. за середньої довжини - 31,2±1,5 мм, що перевищує показники прототипу відповідно на 28,0 і 31,1 %, а базового середовища на 113,3 і 69,6 %. Завдяки цьому коефіцієнт розмноження зріс до 4,99±0,26 на один пасаж, за показників прототипу 2,97±0,14 і базового середовища 1,38±0,06. Використання пропонованого корисною моделлю середовища сприяє прискорюванню ініціації морфогенезу при розмноженні церцису китайського in vitro, що за отриманого збільшення коефіцієнта розмноження дає змогу проводити 6-7 пасажів за рік і відповідно вирощувати від 15 до 70 тис. мікропагонів за рік з одного введеного експланта. Джерела інформації: 1. Губеладзе Е.А. Биоэкология распространенных в Имерети некоторых медоносных древесных бобовых растений и их использование: автореф. дис. на соискание степени канд. с-х наук: спец. 01.06.13. "Лекарственные и эфиромасличные культуры" / Е.А. Губеладзе. - Тбилиси, 2006. - 20 с. 2. Колдар Л.А. Інтродукція видів роду Cercis L. у Правобережний Лісостеп України та перспективи використання їх у зеленому будівництві / Л.А. Колдар. - Умань: 2006. - 158 с. 3. Кунах В.А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи / В.А. Кунах. - К.: Логос, 2005. - 730 с. 4. Петров В.В. В мире субтропических растений / В.В. Петров. - М.: Наука, 1971. – С. 118119. 5. Тахтаджян А.Л. Происхождение и расселение цветковых растений / А.Л. Тахтаджян - М.Л.: Наука, 1970. - 146 с. 6. Яковлев Г.П. Бобовые земного шара / Г.П. Яковлев - Л.: Наука, 1991. - 141 с. 7. Cheong E. Micropropagation of chinense redbud (Cercis yunnanensis) through axillary bad breaking and induction of adventitious shoots from leaf pieces / E. Cheong, M.R. Pooler // In Vitro Cellular and Developmental Biology. Plant. - 2003. - Vol. 39. - P. 455-458. 8. Driver J. In vitro propagation of Paradox walnut rootstock / J. Driver, A. Kuniyuki // HortScience. - 1984. - Vol. 19. - P. 507-509. 9. Gresshoff P.M. Derivation of haploid cell line from vitis vinifera and the importance of the stage of meotic development of anthers for haploid culture of this and other genera / P.M. Gresshoff, C.H. Doy // Z. Pflanzenphysiol. - 1974. - Vol. 73. - P. 132-141. 10. Lloyd G. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use tip culture / G. Lloyd, B. McCown // Comb. Intl. Plant Prop. Soc. - 1980. - Vol. 80. - P. 421-427. 11. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant, 1962. - Vol. 15. - P. 473-497. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 Живильне середовище для розмноження in vitro церцису китайського (Cercis chinensis Bunge), яке включає макро- і мікроелементи, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи та регулятори росту, яке відрізняється тим, що воно у складі макроелементів містить амоній азотнокислий (NH 4NO3) 825 мг/л та калій азотнокислий (KNO3) - 950 мг/л; його амінокислотний склад містить амінооцтову кислоту (гліцин) - 1,0 мг/л; вітамінний склад доповнено 0,5 мг/л аскорбінової (С) та 1,0 мг/л пантотенової (В5) кислот; а склад регуляторів росту містить 6-бензиламінопурин (6БАП) - 1,0 мг/л та 2,4-дихлорфеноксіоцтову кислоту (2,4 Д) - 0,1 мг/л. 3 UA 100754 U Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4