Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин, які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування Rhodococcus erythropolis ІMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, а як джерело вуглецевого живлення та енергії використовують гліцеринову фракцію (відходи виробництва біодизелю) у концентрації 1,9-2,1 об.%. UA 104335 C2 (12) UA 104335 C2 UA 104335 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudor, .onas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 Ν 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis 1MB Ас-5017 [Пат. 63962 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Софілканич А.П., Квятківська І.В. Опубл. 25.12.2011, Бюл. № 20], який включає культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для здешевлення процесу біосинтезу і підвищення концентрації синтезованих ПАР як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи (у тому числі й пересмажену соняшникову олію), а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Недоліком цього способу є недостатньо висока умовна концентрація поверхнево-активних речовин. В основу винаходу покладено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує умовну концентрацію ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування R.erythropolis 1MB Ас-5017 і Acineto-bacter calcoaceticus 1MB B-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення. Згідно винаходу як джерело вуглецю та енергії використовують гліцеринову фракцію (відхід виробництва біодизелю) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецю та енергії гліцеринової фракції (відхід виробництва біодизелю) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка), дає змогу підвищити у 1,4-1,5 рази умовну концентрацію ПАР (до 7,1). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,3; MgSO47H2O0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO47H2O-0,001; pH 6,8-7,0. A. calcoaceticus 1MB Β7241 вирощують на середовищі наведеного вище складу, в якому нітрат натрію замінено на (NH2)2CO-0,35 г/л. Як джерело вуглецю та енергії використовують гліцеринову фракцію (відхід виробництва біодизелю) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцеринової фракції Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв…) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 1,4-1,5 рази умовну концентрацію ПАР. Приклад 1. Синтез ПАР R. erythropolis 1MB Ас-5017 і A. calcoaceticus 1MB В-7241 на очищеному гліцерині Культивування штаму 1MB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого склад} (г/л): NaNО3-1,3; MgSO47H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO47H2O0,001; pH 6,8-7,0. A. calcoaceticus 1MB Β-7241 вирощують на середовищі наведеного вище складу, в якому нітрат натрію замінено на (NH 2)2CO-0,35 г/л. Як джерело вуглецю та енергії використовують очищений гліцерин (ступінь очищення 98 %) у концентрації 0,5 і 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Поверхневий натяг (σs) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник "умовної концентрації ПАР" (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності σ 8 від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої 1 UA 104335 C2 5 10 відповідає значенню умовної концентрації ПАР. Перед вимірюванням цього показника культуральну рідину звільняють від залишкового субстрату обробкою бензином. Біомасу визначають ваговим методом. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР R. erythropolis EK-1 A. calcoaceticus 1MB В-7241 на середовищі з очищеним гліцерином. Таблиця 1 Ріст і синтез ПАР R. erythropolis 1MB Ас-5017 та A. calcoaceticus 1MB В-7241 на гліцерині Штам A. calcoaceticus 1MB В7241 R. erythropolis 1MB Ас-5017 15 20 25 30 35 40 Концентрація гліцерину, % 0,5 1,0 0,5 1,0 Біомаса, г/л 0,5±0,02 0,8±0,04 1,2±0,06 1,5±0,07 ПАР* 1,5±о, 07 2,4±0,12 2,0±0,10 2,5±0,12 Е24, % 39±3 36±4 37±2 47±2 Дані, наведені у табл. 1, засвідчують, що штами здатні асимілювати гліцерин і синтезувати метаболіти з поверхнево-активними та емульгувальними властивостями, хоча показники синтезу є невисокими. Приклад 2. Синтез ПАР R. erythropolis 1MB Ас-5017 і A. calcoaceticus 1MB В-7241 на "неочищеному" гліцерині Гліцеринова фракція, що утворюється в процесі виробництва біодизелю, містить 60-80 % гліцерину. Серед інших складових цього відходу можна назвати воду, солі та інші органічні матеріали, при чому вміст кожного компонента коливається в широких межах в залежності від типу використовуваної сировини. Головним завданням на сьогодні є отримання мікроорганізмів, стійких до інгібіторів, що присутні в неочищеному гліцерині, особливу увагу серед яких необхідно приділяти решткам метанолу, а також натрієвим або калієвим солям, оскільки відомо, що вони здатні до пригнічення росту клітин. У зв'язку з цим, на наступному етапі досліджували можливість використання неочищеного гліцерину як субстрату для отримання поверхневоактивних речовин A. calcoaceticus 1MB В-7241 і R. erythropolis 1MB Ас-5017. Для цього моделювали середній склад гліцеринової фракції за кількістю залишкових спиртів (метанолу або етанолу) та солей натрію або калію (у вигляді хлоридів). Такий субстрат називатимемо "неочищений" гліцерин. Культивування штамів 1MB Ас-5017 і 1MB В-7241 здійснювали на середовищах, склад яких наведено у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовували "неочищений" гліцерин (в очищений гліцерин добавляли у різних комбінаціях етанол або метанол - 0,3 %, об'ємна частка, хлориди калію або натрію масовою часткою 2,5 %). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищах наведеного складу, що містило 0,5 % (об'ємна частка) очищеного гліцерину як джерела вуглецю та енергії. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР визначали як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР на "неочищеному гліцерині" наведено у табл. 2. 2 UA 104335 C2 Таблиця 2 Синтез поверхнево-активних речовин штамами 1MB Ас-5017 і 1MB В-7241 на "неочищеному" гліцерині Джерело вуглецю, Вміст хлоридів, % ПАР* % KСl, 2,5 3,l±0,16 Гліцерин, 1,0 NaCl, 2,5 3,5±0,18 R. 2,9±0,15 Гліцерин, 1,0 + KСl, 2,5 erythropolis 1MB метанол, 0,3 NaCl, 2,5 3,3±0,17 Ас-5017 3,9±0,20 Гліцерин, 1,0 + KСl, 2,5 етанол, 0,3 NaCl, 2,5 4,6±0,23 KCl, 2,5 2,5±0,13 Гліцерин, 1,0 NaCl, 2,5 2,8±0,14 2,9±0,15 А. calcoaceticus Гліцерин, 1,0 + KCl, 2,5 1MB В-7241 метанол, 0,3 NaCl, 2,5 3,2±0,16 3,5±0,17 Гліцерин, 1,0 + KCl, 2,5 етанол, 0,3 NaCl, 2,5 3,6±0,18 Штам ПАР*, % від контролю 119±6,0 135±6,7 112±5,6 128±6,1 150±7,5 177±8,9 104±5,2 117±5,9 121±6,0 133±6,7 146±7,3 150±7,5 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ПАР на середовищі з 1 % гліцерину. 5 10 15 20 25 30 Як видно з табл. 2., внесення у середовище культивування обох штамів КС1 або NaCl у концентрації 2,5 % приводило до підвищення показників синтезу ПАР на 4-35 %. Наявність цих солей навіть у кількості 5-10 % не спричиняла значного інгібування процесів утворення ПАР (дані не наведено). Така закономірність може бути пояснена стимулюючим впливом катіонів цих металів на активність ферментів анаплеротичних реакцій та біосинтезу поверхнево-активних речовин досліджуваних штамів. Приклад 3. Утворення ПАР за умов росту штамів 1MB В-7241 і 1MB Ас-5017 на відходах виробництва біодизелю (технічний гліцерин, гліцеринова фракція). Культивування штамів 1MB Ас-5017 і 1MB В-7241 здійснювали на середовищах, склад яких наведено у прикладі 1. Як джерело вуглецю використовують гліцеринову фракцію - побічний продукт виробництва біодизелю (м. Запоріжжя), що містить 50-70 % гліцерину, жирні кислоти, катіони калію та залишки метанолу. Концентрація гліцеринової фракції становить 1,5-2,5 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищах наведеного складу, що містило 0,5 % (об'ємна частка) гліцеринової фракції як джерела вуглецю та енергії. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР визначали як описано у прикладі 1. Дані щодо можливості використання гліцеринової фракції як субстрату для синтезу ПАР наведено у табл. 3. Як видно з наведених у табл. З даних, у разі підвищення концентрації гліцеринової фракції у середовищі культивування обох штамів з 1,5 до 2,1 % спостерігається збільшення показника умовної концентрації ПАР до 7,1. Подальше підвищення концентрації гліцеринової фракції супроводжується зниженням показника ПАР*. Проте для всіх досліджуваних концентрацій гліцеринової фракції значення ПАР* є суттєво вищим порівняно з використанням як субстрату очищеного гліцерину. Крім того, за умов росту обох штамів на середовищі з гліцериновою фракцією показники синтезу ПАР вищі, ніж наведені у прототипі. 3 UA 104335 C2 Таблиця 3 Синтез ПАР штамами 1MB Ас-5017 і 1MB В-7241 на відходах виробництва біодизелю (гліцеринова фракція) Концентрація гліцеринової фракції ПАР* (%, об'ємна частка) 1,5 1,7 1,9 2,0 R. erythropolis 1MB Ас2,1 5017 2,3 2,5 Пересмажена олія (прототип) 1,5 1,7 1,9 A. calcoaceticus 1MB В2,0 7241 2,1 2,3 2,5 ПАР*, % контролю Штам 4,9±0,24 5,3±0,26 7,1±0,35 7,0±0,35 7,0±0,35 5,3±0,26 4,6±0,23 196±9,8 212±10,6 284±14,2 280±14,0 280±14,0 212±10,6 184±9,2 4,9±0,24 6,0±0,30 6,5±0,32 7,1±0,35 7,1±0,35 7,0±0,35 4,8±0,24 4,3±0.21 від 250±12,5 271±13,6 296±14,8 296±14,8 292±14,6 200±10,0 179±9,0 5 Примітка. Контроль (100 %) - показники синтезу ПАР на середовищі з 1 % очищеного гліцерину. Концентрація 1 % очищеного гліцерину приблизно еквімолярна за вуглецем 2 % гліцеринової фракції. 10 Таким чином, культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 і A. calcoaceticus 1MB В-7241 на середовищі, що містить як джерело вуглецю гліцеринову фракцію (відхід виробництва біодизелю) у концентрації 1,9-2,1 % (об'ємна частка) дає змогу підвищити в 1,4-1,5 рази умовну концентрацію ПАР (до 7,1) порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю та енергії використовують гліцеринову фракцію (відходи виробництва біодизелю) у концентрації 1,9-2,1 об.%. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4