Штам гриба cladosporium cladosporioides – продуцент ауксинів і цитокінінів

Реферат: Природний штам мікроміцета Cladosporium cladosporioides, депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером IMB F-100084, який продукує ауксини і цитокініни і призначений для одержання фітогормональних речовин для стимуляції росту рослин і підвищення урожайності сільськогосподарських культур. UA 105226 U (12) UA 105226 U UA 105226 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікроорганізмів - продуцентів стимуляторів росту рослин. Це активний штам ґрунтового сапротрофного гриба Cladosporium cladosporioides 525, який продукує ауксини і цитокініни та призначений для одержання фітогормональних речовин для стимуляції росту рослин і підвищення урожайності сільськогосподарських культур. Здатність продукувати фітогормональні речовини притаманна як рослинам, так і мікроорганізмам. На сьогодні фітогормони розглядаються як специфічні посередники в комунікаціях між рослиною-живителем та асоційованою з нею мікрофлорою [1, 2]. Застосування регуляторів росту рослин (фітогормональних речовин) є перспективним напрямом у сільськогосподарському виробництві, що дає можливість регулювати процеси росту та розвитку сільськогосподарських культур, підвищувати їх стійкість до патогенних організмів та стресових чинників, отримувати продукцію високої якості. Фітогормональні речовини, отримані шляхом мікробіологічного синтезу, мають низку переваг у порівнянні із синтетичними регуляторами росту, одержаними хімічними способами. Мікроорганізми-продуценти фітогормональних речовин характеризуються поліфункціональною дією на рослини, що дає високий біологічних ефект. Крім того, застосування мікроорганізмів та їх метаболітів не порушує природні екологічні зв'язки в агроекосистемах та сприяє збереженню біологічного різноманіття і навколишнього середовища в благополучному стані. Важливо також, що фітогормональні речовини, одержані в результаті мікробного синтезу є значно дешевшими за такі ж, отримані хімічним шляхом. Відомо, що регуляція росту рослин здійснюється, в основному, декількома класами фітогормонів: ауксинами, гіберелінами, цитокінінами, абсцизовою кислотою, етиленом, брасинами (брасиностероїдами) та жасмоновою кислотою. Умовно ауксини, гібереліни, цикокініни і частково брасини можна віднести до речовин стимулюючої дії, тоді як абсцизову кислоту, етилен і жасмонову кислоту - до інгібіторів. Перші із фітогормонів, які були досліджені - ауксини. Ауксини відповідають за поділ і диференціацію рослинних клітин і тканин, стимулюють проростання насіння і бульб, прискорюють коренеутворення, координують процеси вегетативного росту, тропізму, плодоутворення. Впливають на фотосинтез, утворення пігментів, біосинтез метаболітів і стійкість рослин до стресових факторів довкілля. Найбільшою біологічною активністю відзначається індоліл-3-оцтова кислота (IOK), хоча відомі і інші сполуки з ауксиновою активністю, які в більшості є індолами і за хімічною структурою близькі до IOK. Такі індольні сполуки можуть служити попередниками індоліл-3-оцтової кислоти, або бути продуктами її подальшої трансформації. Цитокініни за хімічною структурою є похідними аденіну. В залежності від будови молекули пуринового кільця фізіологічна активність цитокінінів буде відрізнятися. Саме цим пояснюється той факт, що цитокініни регулюють різні фізіологічні процеси: активізують синтез РНК і білка в клітинах шляхом активізації РНК-полімерази, стимулюють поділ рослинних клітин, сприяють розгалуженню, стимулюють проростання насіння, регулюють формування хлоропластів, підвищують стабільність фотосинтетичного апарату за водного стресу, сприяють стійкості клітин до несприятливих умов навколишнього середовища. Відомі штами мікроорганізмів (бактерій і мікроміцетів), здатних продукувати фітогормональні речовини. Так описаний штам Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 - продуцент комплексу фітогормонів [3]. Серед мікроміцетів відомий штам Cercospora sp. ВКПМ F-444 -продуцент фітогормона абсцизової кислоти [4]. Втім його застосування обмежене у зв'язку з тим, що абсцизова кислота є природним інгібітором багатьох фізіологічних процесів і гормоном спокою. Продуцентом гіберелінів є штам мікроміцета Fusarium moniliforme ВКПМ F-446 [5]. Найбільш близьким аналогом корисної моделі є штам сапротрофного гриба Chaetomium cochliodes [6]. Втім зазначений мікроміцет продукує значну кількість гіберелінів і ауксинів і не здатний до синтезу цитокінінів. В основу корисної моделі поставлена задача розширити арсенал природних високоактивних штамів мікроміцетів - продуцентів ауксинів і цитокінінів та призначених для підвищення урожайності сільськогосподарських культур. Поставлена задача вирішується шляхом отримання нового штаму мікроміцета Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. deVries 525 - продуцента фітогормональних речовин методами аналітичної селекції. Штам виділений з ризосфери пшениці ярої, ідентифікований за визначником Підоплічко Н.М. та депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України (вул. Академіка 1 UA 105226 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заболотного 154, м. Київ) 27 травня 2015 року за реєстраційним номером Cladosporium cladosporioides IMB F-100084. Культурально-морфологічні особливості штаму. Штам культивують поверхнево на сусло-агарі з масовою часткою сухих речовин від 3 % до 4 %, рН 6,4-7,0 за температур від 26 °C до 27 °C. Колонії на сусло-агарі ростуть повільно, досягають на 4-5 добу 20-26 мм в діаметрі (за температури 25-27 °C). Колонії розпростерті, оливково-зелені, бархатисті, на зворотному боці зеленувато-чорні. Конідієносці добре виражені, довжиною до 350 мкм довжини, товщина - 2-6 мкм, блідо-оливкові, гладенькі та дрібнобородавчасті. Конідії як одноклітинні, так і з однією перетинкою, 30 × 2-5 мкм, гладенькі та дрібнобородавчаті. Конідії в довгих ланцюжках, частіше одноклітинні, еліптичні, 3-11 × 2-5 мкм, в більшості 3-7 × 2-4 мкм. Штам Cladosporium cladosporioides 525 характеризується здатністю продукувати ауксини і цитокініни і підвищувати урожайність сільськогосподарських культур. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. Для аналізу фітогормональних речовин гриб С. cladosporioides 525 вирощували на синтетичному середовищі Ролена-Тома методом поверхневого культивування за температури 26-27 °C упродовж 9 діб. Культуральну рідину відфільтровували і пропускали крізь мембранні фільтри. Для визначення вмісту фітогормонів застосовували метод кількісної спектроденситометричної тонкошарової хроматографії [8]. Екстракти центрифуговали при 3000 об./хв., упарювали під вакуумом при 40-45 °C. Сухий залишок розчиняли в 1 (1,5) мл етанолу, переносили в епіндорфи, залишали на добу при -24 °C для виморожування полісахаридів, над осад відбирали та знову центрифугували. Попереднє очищення і концентрування фітогормонів проводили на пластинках із силікагелем марки "Silufol UV254" ("Chemapol", Чехія) у суміші розчинників, застосованих послідовно: хлороформ, 12,5 %-ний аміак, етилацетат: оцтова кислота (20:1). Очищені таким чином екстракти розділяли на пластинках з оксидом кремнію (фірми "Merck") для індольних сполук та на пластинках з оксидом алюмінію для цитокінінів (фірми "Merck"). Кількісне детектування фітогормонів здійснювали за допомогою скануючого спектроденситометра "Sorbfil" (Росія). Для визначення гіберелінової активності використовували гіпокотилі паростків огірка сорту Роднічок. Зміни довжини гіпокотилей виражали у відсотках приросту до відповідної маси в -5 контрольному варіанті. Як позитивний контроль використовували розчин ГК в концентрації 10 М. Попереднє очищення екстрактів для кількісного визначення вмісту гіберелінів проводили за методикою Муромцева та співавт. [9] з використанням етилацетату і цитратно-фосфатної буферної системи (рН 2,5 і 7,0). Кількісне визначення вмісту гіберелінів у пробі проводили спектрофотометричним методом. Лінійна залежність між показником екстинції та вмістом гіберелінів спостерігалась в діапазоні від 10 до 200 нг гібереліну на 1 мл. Здатність мікроміцета С. cladosporioides 525 синтезувати фітогормональні речовини наведена у табл. 1, з якої видно, що ауксини були представлені індол-3-оцтовою кислотою (2,12 мкг/г сухої біомаси), індол-3-масляною кислотою (3,28 мкг/г сухої біомаси), індол-3-оцтової кислоти гідразидом (3,85 мкг/г сухої біомаси) та індол-3-карбоксиловою кислотою (1,44 мкг/г сухої біомаси). Цитокініни представлені зеатином (6,20 мкг/г сухої біомаси), зеатинрибозидом (6,03 мкг/г сухої біомаси), ізопентиніладеніном (4,43 мкг/г сухої біомаси) та ізопентиніладенозином (10,30 мкг/г сухої біомаси). Крім того, було встановлено, що С. cladosporioides 525 продукує незначну кількість гіберелінів (0,024 мкг/г сухої біомаси) та абсцизової кислоти (0,876 мкг/г сухої біомаси). Отже, серед екзометаболітів фітогормональної природи найбільш інтенсивно С. cladosporioides 525 продукує цитокініни, сумарна кількість яких складає 26,96 мкг/г сухої біомаси. Вплив екзометаболітів мікроміцета С. cladosporioides 525 на продуктивність сільськогосподарських культур вивчали за умов вегетаційних і польових дослідів. Приклад 2. Вегетаційний дослід з ярою пшеницею проводили у вегетаційному будиночку на дерновосередньопідзолистому пилувато-супіщаному ґрунті, який характеризувався такими агрохімічними показниками: вміст гумусу становив 1,02 %; азоту (за Корнфільдом) - 54,9 мг/кг; рухомих форм фосфору (за Кірсановим) - 110-120 мг Р2О5, обмінного калію (за Кірсановим) 120-130 мг К2О на 1 кг ґрунту; рНсол - 5,2, рНводна - 6,0; Са - 5,8, Mg-0,61 мг·екв на 100 г ґрунту. 2 UA 105226 U 5 10 15 20 Вологість ґрунту підтримували на рівні 60 % від повної вологоємності. Насіння пшениці ярої сорту Рання 93 висівали на глибину 2,0 см, в кожній посудині вирощували 20 рослин. Повторність досліду 10-разова. Схема досліду: 1 - обробка насіння водою (контроль); 2 - передпосівна обробка насіння культуральною рідиною штаму С. cladosporioides 525 у розведенні 1:1000 з розрахунку 10 мл на 1 т насіння. Результати вегетаційного досліду наведено у таблиці 2, з якої видно, що новий штам ґрунтового гриба С. cladosporioides 525 продукує фітогормональні речовини, які в розведенні культурального середовища 1:1000 позитивно впливали на продуктивність ярої пшениці, яка під впливом метаболітів мікроміцета підвищувалась на 22 % щодо контрольного варіанту. Приклад 3. Польовий дослід з люпином білим сорту Либідь було проведено протягом 2013-2014 pp. на дерново-середньопідзолистому ґрунті. Вміст гумусу 1,2 (за Тюріним), рухомого азоту 5,0-6,0 мг/100 г ґрунту (за Тюріним і Кононовою), фосфору 11-12 мг/100 г ґрунту (за Чіріковим), калію 12-13 мг/100 г ґрунту (за Кірсановим), кислотність рН 6,0. Дослід проводили без внесення добрив. Схема польових дослідів: 1 - обробка насіння водою (контроль); 2 - передпосівна обробка насіння культуральною рідиною штаму С. cladosporioides 525 у розведенні 1:1000 з розрахунку 10 мл на 1 т насіння. Площа облікової ділянки у 2013 р.- 9 м, у 2014 р.- 6 м; повторність досліду чотириразова. Результати 2-річного польового досліду наведено у таблиці 3, з якої видно, що новий штам ґрунтового гриба С. cladosporioides 525 продукує фітогормональні речовини, які в розведенні культурального середовища 1: 1000 позитивно впливали на урожайність люпину білого та забезпечували прибавку урожаю зерна люпину на 16,7 % щодо контрольного варіанту. 25 Таблиця 1 Біосинтез ауксинів і цитокінінів штамом мікроміцета С cladosporioides 525 Вміст фітогормонів у супернатанті культуральної рідини, мкг/г сухої біомаси Фітогормони Ауксини Індол-3-оцтова кислота Індол-3-масляна кислота Індол-3-оцтової кислоти гідразид Індол-3-карбоксилова кислота Всього ауксинів 2,12±0,074 3,28±0,089 3,85±0,099 1,44±0,059 10,69±0,166 Цитокініни Зеатин Зеатинрибозид Ізопентиніладенін Ізопентиніл аденозин Всього цитокінінів Накопичення біомаси, (г/л) 6,20±0,126 6,03±0,124 4,43±0,106 10,30±0,163 26,96±0,262 43,5±3,05 Таблиця 2 Вплив метаболітів мікроміцета С cladosporioides 525 на продуктивність рослин пшениці ярої сорту Рання 93 (вегетаційний дослід) Варіант досліду 1 Без інокуляції (контроль) Обробка насіння культуральним середовищем С. cladosporioides 525 (розведення 1:1000) НІР05 Вміст сухої речовини в надземній масі рослин, г/10 рослин 2 2,63 3,21 0,208 3 Приріст сухої речовини надземної маси рослин г/10 рослин % 3 4 0,58 22,0 UA 105226 U Таблиця 3 Вплив метаболітів гриба С cladosporioides 525 на урожайність люпину білого сорту Либідь у польових дослідах (середнє за 2 роки досліджень) Урожайність т/га 2,57 Варіант Контроль (обробка насіння водою) Обробка насіння культуральним середовищем С. cladosporioides 525 (розведення 1:1000) 5 10 15 20 25 30 3,0 Приріст урожайності т/га % 0,43 16,7 Джерела інформації:: 1. Кулаева О.Н. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов / О.Н. Кулаева, В.В. Кузнецов // Физиол. раст. - 2002. - Т. 49, № 4 - С. 626-640. 2. Цавкелова Е.А. Гормоны и гормоноподобные соединения микроорганизмов (обзор) / Е.А. Цавкелова, С.Ю. Климова, Т.А. Чердынцева, А.И. Нетрусов // Прикладная биохимия и микробмология. - 2006. - Т. 42, № 3. - С. 161-168. 3. Пат. 92094 Україна, МПК (2009) A01N 63/02, А01Р 21/00, C12N 1/20. Застосування штаму Streptomyces avermitilis 1MB Ac-5015 як продуцента комплексу фітогормонів / Іутинська Г.О., Білявська Л.О., Драговоз І.В., Козирицька В.Є., Валагурова О.В., Яворська В.К., Курчій Б.О.; заявники та власники Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НААН, Інститут фізіології рослин і генетики НААН. - № а200901173, заявл. 13.02.2009; опубл. 27.09.2010, Бюл. № 18. 4. Пат. 2085078 Российская Федерация, A01N 63/04, C12N 1/14, C12R1:645. Штамм микромицета Cercospora sp. - продуцент фитогормона абсцизовой кослоты / Муромцев Г.С., Краснопольская Л.М., Макеева А.П., Нагубнова Л.А.; заявитель и патентообладатель ООО "Биотек". - №5062366/13; заявл. 16.09.1992; опубл. 27.07.1997. 5. Пат. 2084531 Российская Федерация, А12Р 27/00, А01N 63/04, C12N 1/14, C12R1:77. Штамм микромицета Fusarium moniliforme - продуцент фитогормонов гиббереллинов А4А7 / Муромцев Г.С., Краснопольская Л.М., заявитель и патентообладатель ООО Фонд им. Е.Н. Мишустина. - № 95116634/13; заявл. 27.09.1995; опубл. 20.07.1997. 6. Пат. 95554 Україна, МПК (2006.01) A01N 63/04, C12N 1/14, C05F 11/08. Комплексний регулятор росту та розвитку рослин / Драговоз І.В., Яворська В.К., Надкерничний СП., Копилов Є.П., Надкернична О.В., Курчій Б.О.; Каменчук О.П., Падалко С.Ф. заявники та власники Інститут фізіології рослин і генетики НААН, Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН. №а201002814; заявл. 12.03.2010; опубл. 10.08.2011, Бюл. № 15. 7. Пидопличко Н.М. Грибыпаразиты культурных растений - Т. 2. - К.: Наук, думка, 1977. - 299 с. 8. Савинский С.В. Определение зеатина, индолил-3-уксусной и абсцизовой кислот из одной растительной пробы методом високо-эффективной жидкостной хроматографии / С.В. Савинский, И.В. Драговоз, В.К. Педченко // Физиология и биохимия культ, растений. - 1991. - Т. 23, № 6. - С. 606-614. 9. Муромцев Г.С. Гиббереллины / Г.С. Муромцев, В. Н. Агнистикова. - М.: Наука, 1984. - 208 с. 35 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Природний штам мікроміцета Cladosporium cladosporioides, депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером IMB F-100084, який продукує ауксини і цитокініни і призначений для одержання фітогормональних речовин для стимуляції росту рослин і підвищення урожайності сільськогосподарських культур. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4