Спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій

Реферат: Спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, який включає одержання еритроцитарної маси, насичення її кріоконсервантом "Пропандіосахароль" UA 113140 C2 (12) UA 113140 C2 у гемоконтейнері, центрифугування, видалення надосаду, перенесення еритроцитарної маси в кріоконтейнер, поміщення кріоконтейнера з еритроцитарною масою в холдер, заморожування у рідкому азоті до -170 °C, перенесення кріоконтейнера з замороженими еритроцитами у сховище з рідким азотом, відігрівання у водяній бані, відмивання і ресуспендування еритромаси у плазмозамінюючому розчині. Насичення еритроцитарної маси кріоконсервантом здійснюють шляхом нашарування кріоконсерванту на стінки гемоконтейнера. Для заморожування використовують полімерний кріоконтейнер. Перед заморожуванням холдер з полімерним кріоконтейнером поміщають у кріокамеру, а після заморожування до -170 °C кріоконтейнер переносять у кріокасету, яку поміщають у сховище з рідким азотом. Перед відігріванням у водяній бані кріоконтейнер виймають з кріокасети і витримують у пінопластовому чохлі при температурі 20-22 °C протягом 20 хв. Перенесення еритроцитарної маси з гемоконтейнера в полімерний кріоконтейнер здійснюють з використанням системи для переливання крові. UA 113140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі кріобіології і кріомедицини і призначений для створення запасів еритроцитів для трансфузій, які можуть бути проведені в умовах клінік та польових шпиталів. Відомий спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, згідно з яким еритроцитарну масу насичують кріоконсервантом на основі гліцерину за допомогою автоматизованої функціонально-замкнутої системи, переливають у стерильний полімерний кріоконтейнер, герметизують його і заморожують еритроцити шляхом занурення у рідкий азот. Зберігають еритроцити при температурі -196 °C. Відігрів здійснюють у водяній бані при температурі 45 °C. Після розморожування, для видалення гліцерину, проводять 2-кратне відмивання методом серійного центрифугування. Для забезпечення стерильності при відмиванні еритроцитів від кріоконсерванта також використовують автоматизовану функціонально замкнуту систему [1]. Існує спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, згідно з яким еритроцитарну масу насичують кріоконсервантом на основі гліцерину за допомогою автоматизованої функціонально-замкнутої системи, переливають у стерильний полімерний кріоконтейнер, герметизують, заморожують у електричному рефрижераторі при 80 °C і зберігають. Відігрів еритроцитів здійснюють у водяній бані при температурі 45 °C. Після розморожування, для видалення гліцерину, проводять 2-кратне відмивання клітин методом серійного центрифугування. Для забезпечення стерильності при відмиванні використовують автоматизовану функціонально замкнуту систему [2]. Недоліком даних способів є використання у якості кріопротектора гліцерину, який являється токсичною речовиною і потребує видалення перед трансфузією. Трудомісткий і багатоетапний процес відмивання еритроцитів від гліцерину потребує великої кількості відмиваючих розчинів і дорогого обладнання, займає багато часу. Відомий спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, згідно з яким еритроцитарну масу насичують кріоконсервантом на основі гідроксіетилкрохмалю (ГЕК), переливають у стерильний полімерний кріоконтейнер, герметизують, розміщують між двома алюмінієвими пластинами і швидко заморожують шляхом занурення у рідкий азот і зберігають. Відігрівають еритроцити у водяній бані при температурі 45 °C [3]. Основним недоліком зазначеного способу є те, що використання еритроцитів, отриманих таким способом, обмежено через негативну дію ГЕК на коагуляційні властивості крові, функцію тромбоцитів і нирок, що може привести до додаткових ускладнень у хворого [4]. Існує спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, згідно з яким еритроцитарну масу, яку перелито у стерильний полімерний кріоконтейнер, насичують кріоконсервантом на основі 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) і диметилацетаміду (ДМАЦ), потім кріоконтейнер герметизують, розміщують у металевий пеналхолдер, заморожують у рефрижераторі до -140 °C і зберігають. Розморожування еритроцитів проводять на водяній бані при температурі 42-45 °C. Відмивають від кріоконсерванта методом 2- або 3-кратного центрифугування [5]. Недоліком способу є використання для заморожування еритроцитів контейнерів із полівінілхлориду, які не призначені для кріоконсервування клітин в парах рідкого азоту. При температурі від -50 °C у виробів із полівінілхлориду знижується міцність, еластичність і утворюються мікротріщини, що може привести до втрати герметичності контейнера і контамінації гемосередовища. Крім того, при зміні температур відбувається накопичення у біоматеріалі токсичних складових полівінілхлоріду - фталатів, які є небезпечними для людини. Відомий спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, згідно з яким еритроцитарну масу насичують кріоконсервантом на основі полівінілпіролідону (ПВП), в асептичних умовах переводять в алюмінієвий кріоконтейнер і заморожують шляхом занурення у рідкий азот. Зберігають еритроцити при температурі -196 °C, розморожують еритроцити у водяній бані при температурі 45 °C [6]. Після кріоконсервування таким способом еритроцити не придатні для трансфузії, тому що препарати, які містять ПВП, заборонені для парантерального введення у зв'язку з небезпекою прояву канцерогенного ефекту [7]. Крім того, термін зберігання розморожених еритроцитів при температурі 4 °C обмежений 6-24 годинами, що не дозволяє використовувати їх у надзвичайних станах. Існує спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, згідно з яким еритроцитарну масу насичують кріоконсервантом на основі гідроксіалкілкрохмалю (ГАК), в асептичних умовах переливають в алюмінієвий кріоконтейнер, поміщують у рідкий азот і заморожують. Зберігають еритроцити при температурі -196 °C. Розморожують у водяній бані при температурі 45 °C [8]. 1 UA 113140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Основним недоліком цього способу є те, що отриманий об'єм (50 мл) розморожених еритроцитів не відповідає міжнародним стандартам якості і не може бути використаний для трансфузій [9]. Найбільш близьким до заявленого є спосіб кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, згідно з яким отриману еритроцитарну масу насичують у співвідношенні 1:1 кріоконсервантом "Пропандіосахароль" у гемоконтейнері, центрифугують протягом 20 хв при 2000 об/хв і видаляють надосад. Після видалення надосаду 135 мл еритроцитарної маси переносять з дотриманням правил асептики в алюмінієвий кріоконтейнер ємністю 150 мл. Кріоконтейнер поміщують в металевий холдер, занурюють в рідкий азот і охолоджують до температури 170 °C. Потім контейнер переносять у сховище з рідким азотом (-196 °C). Відігрівають еритроцитарну масу у водяній бані з температурою 40 °C. Потім клітини відмивають. Для цього до розмороженої еритроцитарної маси у співвідношенні 1:1 безперервно протягом 5 хв додають сахарозно-сольовий розчин № 1, далі безперервно протягом 5 хв додають сахарозно-сольовий розчин № 2 до співвідношення розморожена еритроцитарна маса : відмиваючий розчин 1:3. Отриману суспензію еритроцитів центрифугують, видаляють надосад і ресуспендують еритроцити у співвідношенні 1:1 в плазмозамінюючому розчині ЦНІГПК 86 [10]. Основним недоліком зазначеного способу є те, що він не забезпечує одержання достатньо високих показників збереженості еритроцитів (гематокрит, гемоліз). При цьому об'єм дози, що отримується після кріоконсервування, не відповідає міжнародним стандартам якості (Таблиця). Крім того, при використанні алюмінієвих кріоконтейнерів заморожування потрібно проводити в стерильних виробничих боксах, тому що, при перенесенні еритроцитів в кріоконтейнер можливе порушення стерильності і бактеріальна контамінація. В основу винаходу поставлено задачу удосконалити відомий спосіб шляхом зміни умов на етапах технологічного процесу і таким чином забезпечити можливість підвищення показників збереженості еритроцитів і одержання доз клітин для трансфузії, які відповідають міжнародним показникам якості. Поставлена задача вирішується тим, що в відомому способі здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, який включає одержання еритроцитарної маси, насичення її крюконсервантом "Пропандіосахароль" у гемоконтейнері, центрифугування, видалення надосаду, перенесення еритроцитарної маси в кріоконтейнер, поміщення кріоконтейнера з еритроцитарною масою в холдер, заморожування у рідкому азоті до -170 °C, перенесення кріоконтейнера з замороженими еритроцитами у сховище з рідким азотом, відігрівання у водяній бані, відмивання і ресуспендування еритромаси у плазмозамінюючому розчині, згідно з винаходом, насичення еритроцитарної маси кріоконсервантом здійснюють шляхом нашарування кріоконсерванта на стінки гемоконтейнера, для заморожування використовують полімерний кріоконтейнер, перед заморожуванням холдер з полімерним кріоконтейнером поміщають у кріокамеру, після заморожування до -170 °C кріоконтейнер переносять у кріокасету, яку поміщають у сховище з рідким азотом, а перед відігріванням у водяній бані кріоконтейнер виймають з кріокасети і витримують у пінопластовому чохлі при температурі 20-22 °C протягом 20 хв. Для переносу еритроцитарної маси з гемоконтейнера в кріоконтейнер використовують систему для переливання крові. Насичення еритроцитарної маси кріоконсервантом шляхом нашарування його на стінки гемоконтейнера є найменш травматичним для еритроцитів, не викликає їх осмотичного гемолізу і не призводить до зменшення об'єму еритроцитів, який підлягає заморожуванню. Використання кріокамери дозволяє одержувати оптимальну швидкість охолодження еритроцитів у полімерному кріоконтейнері. Витримування еритроцитів у пінопластовому чохлі дозволяє реалізувати повільний режим розморожування клітин і таким чином запобігти швидкого зростання великих кристалів льоду, які приводять до пошкоджень клітин. Зберігання полімерного кріоконтейнера з еритроцитами у кріокасеті запобігає механічним пошкодженням кріоконтейнера, які можуть виникати в процесі низькотемпературного зберігання. За допомогою системи для переливання крові створюється замкнута система при перенесенні еритроцитарної маси з гемоконтейнера в кріоконтейнер. Використання такої замкнутої системи дозволяє знизити ризик бактеріальної контамінації клітин. Зазначені переваги способу забезпечують більш високу збереженість еритроцитів в порівнянні з прототипом і дозволяють отримати дозу еритроцитів для трансфузій, об'єм якої відповідає міжнародним стандартам якості і безпеки. 2 UA 113140 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Всі етапи процесу кріоконсервування можуть бути здійснені в умовах чистої маніпуляційної кімнати клінік та польових шпиталів. Це значно зменшує собівартість дози еритроцитів і дозволяє широко використовувати їх для трансфузій. Спосіб пояснюється прикладом. Еритроцити отримували шляхом фракціонування цільної донорської крові, заготовленої на стандартному гемоконсерванті (ACD, CPD) у гемоконтейнер. Перед проведенням експериментальних досліджень цільну донорську кров зберігали не більше 48 годин при температурі 4±2 °C. Для отримання еритроцитів донорську кров центрифугували на рефрижераторній центрифузі при відцентровому прискоренні 2150 g і температурі 4 °C протягом 20 хв, плазму і лейкотромбоцитарний шар (ЛТШ) переводили в порожні гемоконтейнер. Далі до еритроцитів у співвідношенні 1:1 додавали кріоконсервант "Пропандіосахароль". Насичення еритроцитів кріоконсервантом проводили шляхом його обережного нашарування на стінки гемоконтейнера. Потім перемішування суспензію еритроцитів відразу центрифугували при 1900 g протягом 15 хв для відділення еритроцитарної маси, надлишок супернатанта видаляли. Кінцевий об'єм зразка становив 240±12 мл. Після цього еритроцитарну суспензію переводили в полімерний кріоконтейнер CS 1000 за допомогою системи переливання крові і запаювали. Кріоконтейнер укладали в металевий холдер для створення рівномірного тонкого шару і поміщали в кріокамеру у вертикальному положенні, яку, таким же чином, розміщували в ємності Дьюара з рідким азотом, де зразок заморожували від кімнатної температури до -170 °C. Після заморожування кріоконтейнер поміщали у кріокасету, яку попередньо охолоджували у рідкому азоті. Кріокасету з кріоконтейнером переносили у низькотемпературне сховище, де зберігали у рідкому азоті (-196 °C). Відігрівання еритроцитів здійснювали в два етапи. Спочатку кріоконтейнер з замороженими еритроцитами виймали з кріокасети і поміщали у пінопластовий чохол на 20 хв при кімнатній температурі 20-22 °C. Далі кріоконтейнер з еритроцитами виймали з пінопластового чохла і поміщали у водяну баню, де продовжували розморожування при температурі 42-45 °C при постійному погойдуванні протягом 2-3 хв. Відмивання розморожених еритроцитів проводили за допомогою відмиваючого розчину № 1 у співвідношенні 1:1 (за вагою), а потім до цієї суміші додавали 2 об'єми розчину № 2. Загальне співвідношення розморожених еритроцитів і розчинів для відмивання складало 1:3. Далі еритроцити центрифугували, отриманий надосад видаляли. Отриману еритроцитарну масу ресуспендували у плазмозамінюючому розчині в ЦНІГПК 8 б. Потім еритроцити зберігали при температурі 4 °C. Для порівняння еритроцитарну масу заморожували способом за прототипом з використанням алюмінієвого кріоконтейнера ємністю 150 мл. Збереженість еритроцитів, кріоконсервованих заявленим способом і за прототипом, досліджували за показниками гемолізу, гематокриту і осмотичної крихкості. Результати наведені в Таблиці. З Таблиці видно, що у способі, який заявляється, збереженість еритроцитів за показниками гемолізу і гематокриту підвищилась, а збереженість еритроцитів за показником осмотичної крихкості була на рівні прототипу. Отриманий об'єм розморожених клітин відповідав міжнародним стандартам якості. Таблиця Показники збереженості еритроцитів після кріоконсервування (M±S) Показники Осмотична крихкість, % 0,9 % NaCl 0,6 % NaCl Гемоліз, % Гематокрит, % Об'єм після розморожування і відмивання, мл Об'єм після додавання плазмозамінюючого розчину ЦНІГПК 8 б, мл 45 3 Спосіб кріоконсервування Заявлений Прототип 4,2±2,05 4,5±1,85 9,37±4,08 10,45±5,10 0,23±0,10 0,65±0,20 41,1±1,01 34,1±1,04 210±10,00 100±15,00 420±13,40 200±27,00 UA 113140 C2 5 10 15 20 25 Джерела інформації: 1. Valery C.R. Cryopreservation of human blood products / C.R. Valery, G. Ragno // Transfusion Apheresis Science. - 2006. - Vol. 34, №3. - P. 271-287. 2. W. F. Wolkers Cryopreservation of Red Blood Cells // Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. - Chapter 17. - P. 353-367. 3. Sputtek A. Cryopreservation of red blood cells with the non-penetrating cryoprotectant hydroxyethyl starch / A. Sputtek, R. Langer, G. Singbartl // Cryo Letter. - 1995. - Vol. 16, № 2. - P. 283-288. 4. Халикова Е.Ю. Использовать или не использовать препараты гидроксиэтилкрахмала в современных программах инфузионной терапии / Е.Ю. Халикова // Лечащий врач. - 2013. - № 11. - С. 3-4. 5. Консервирование эритроцитов человека при умеренно низкой температуре -80 °C в полимерных контейнерах ОАО "Синтез" / В.Н. Вильянинов, В.И. Ващенко, М.В. Куркова [и др.] // Вестник службы крови России. - 2011. - № 1. - С. 17-22. 6. Применение поливинилпирролидона при ультрабыстром замораживании цельной крови и эритроцитарной массы и рациональные пути использования их для трансфузий в клинике / Ф.Р. Виноград-Финкель, В.А. Крутиков, И.Н. Тальская // Проблемы гематологии и переливания крови. - 1961. - № 1. - С. 41-48. 7. Сводный список товаров, потребление и/или продажа которых запрещены, которые изъяты, строго ограничены или не утверждены правительствами. Лекарственные препараты / Департамент по экономическим и социальным вопросам. - Нью-Йорк: ООН, 1996. - С. 251 8. Пат. США, № 3758382 А61K 27/10. Публ. 26.06.1968. Process of freezing blood using a hydroxyalkylstrach as cryoprotective. 8th 9. Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components l ed. / European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM). - 1996. - P. 260-264. 10. Пат. України, № 13691 A01N 1/02. Публ. 25.04.1997. Спосіб кріоконсервування еритроцитів. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 40 45 1. Спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій, який включає одержання еритроцитарної маси, насичення її кріоконсервантом "Пропандіосахароль" у гемоконтейнері, центрифугування, видалення надосаду, перенесення еритроцитарної маси в кріоконтейнер, поміщення кріоконтейнера з еритроцитарною масою в холдер, заморожування у рідкому азоті до -170 °C, перенесення кріоконтейнера з замороженими еритроцитами у сховище з рідким азотом, відігрівання у водяній бані, відмивання і ресуспендування еритромаси у плазмозамінюючому розчині, який відрізняється тим, що насичення еритроцитарної маси кріоконсервантом здійснюють шляхом нашарування кріоконсерванта на стінки гемоконтейнера, для заморожування використовують полімерний кріоконтейнер, перед заморожуванням холдер з полімерним кріоконтейнером поміщають у кріокамеру, після заморожування до -170 °C кріоконтейнер переносять у кріокасету, яку поміщають у сховище з рідким азотом, а перед відігріванням у водяній бані кріоконтейнер виймають з кріокасети і витримують у пінопластовому чохлі при температурі 20-22 °C протягом 20 хв. 2. Спосіб здійснення технологічного процесу кріоконсервування еритроцитів для трансфузій за п. 1, який відрізняється тим, що перенесення еритроцитарної маси з гемоконтейнера в полімерний кріоконтейнер здійснюють з використанням системи для переливання крові. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4