Спосіб визначення ступеня метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів плр

Реферат: Спосіб визначення ступеня метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР в якому із зразка сечі хворого, отриманого після масажу простати, виділяють ДНК, виділяють РНК та синтезують до неї кДНК, проводять двоетапну кількісну ПЛР з використанням специфічних праймерів на першому етапі - t_erg-2F , t_erg-1R на другому етапі t_erg-2F , t_erg-2R до маркера-1 - кДНК гена tmprss2/erg, проводять метилвикористанням специфічних праймерів GSTP1F , GSTP1R , позитивний контроль: F , до маркера-2 - ДНК гена GSTP1, проводять кількісну ПЛР з використанням специфічних праймерів CXCR4F , CXCR4R , позитивний контроль: Ia bcr f , Ib bcr f , P190-R до маркера-3 - кДНК гена CXCR4. Проводять електрофорез в агарозному гелі та за результатами електрофорезу роблять висновок про метастатичну агресивність раку передміхурової залози. специфічну ПЛР з UA 114653 U (12) UA 114653 U UA 114653 U 5 10 15 20 25 30 35 Пропонована корисна модель належить до галузі біотехнології та молекулярної біології і може бути використана зокрема для визначення метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози, а більш конкретно до способу визначення ступеня метастатичої агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР. Відомі молекулярно-генетичні діагностичні маркери, такі як спосіб визначення промоторного метилування гена GSTP11 [Molecular detection of localized prostate cancer using quantitative methylation-specific PCR on urinary cells obtained following prostate massage. / Roupret M, Hupertan V, Yates DR, Catto JW, Rehman I, Meuth M, Ricci S, Lacave R, Cancel-Tassin G, de la Taille A, Rozet F, Cathelineau X, Vallancien G, Hamdy FC, Cussenot O. // Clin Cancer Res. - 2007. - 13. - P. 1720-1725.]; спосіб визначення злиття tmprss2/erg [DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. / Bussemakers MJ, van Bokhoven A, Verhaegh GW, Smit FP, Karthaus HF, Schalken JA, Debmyne FM, Ru N, Isaacs WB. // Cancer Res. - 1999. - 59(23). - P. 5975-5979.]. Ці методи базуються на фізіологічній ролі білків і їх мутантних формах, які властиві пухлинним тканинам, та не властиві нормальним тканинам. Експресія описаних вище маркерів не є 100 % свідоцтвом підвищеної метастатичної агресивності раку, можливі хибно-позитивні та хибно-негативні результати. Відомі праймери для визначення рівня експресії CXCR4: forward 5'TGACGGACAAGTACAGGCTGC-3', reverse 5'-CCAGAAGGGAAGCGTGATGA-3' та певні параметри методики [Sun YX1, Wang J, Shelburne CE, Lopatin DE, Chinnaiyan AM, Rubin MA, Pienta KJ, Taichman RS. Expression of CXCR4 and CXCL12 (SDF-1) in human prostate cancers (PCa) in vivo. J Cell Biochem. - 2003. Jun l; 89(3):462-73. University of Michigan School of Medicine, 1500 E. Medical Center Drive, Ann Arbor, Michigan]. Здебільшого даний прайм ер використовують в дослідницькій роботі. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такого способу визначення ступеня метастатичої агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР, який би дозволив уточнити первинний клінічний діагноз, та дозволив уникнути можливих хибно-позитивних або хибно-негативних результатів, а в залежності від того, чи пухлина метастатично агресивна, чи ні, дати онкологу можливість вибрати або жорстку, зі шкідливими побічними ефектами або менш жорстку, менш шкідливу тактику лікування. Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення ступеня метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР, відповідно до корисної моделі, з зразка сечі хворого, отриманого після масажу простати, виділяють ДНК, виділяють РНК та синтезують до неї кДНК, проводять двоетапну кількісну ПЛР з використанням специфічних праймерів на першому етапі - t_erg2F на ,t_erg-1R другому етапі t_erg-2F , t_erg-2R до маркера-1 - кДНК гена tmprss2/erg, проводять метилспецифічну ПЛР з використанням специфічних праймерів , , 40 контроль: кількісну F ПЛР 5'з позитивний , R 5'до маркера-2 - ДНК гена GSTP1, проводять використанням специфічних праймерів CXCR4F , CXCR4R 45 50 55 позитивний контроль: la bcr f , , P190-R до маркера-3 - кДНК гена CXCR4, проводять електрофорез в агарозному гелі, за результатами електрофорезу в разі наявності смуг ампліфікату в гелях всіх трьох маркерів роблять висновок про високу метастатичну агресивність раку передміхурової залози, в разі, коли відсутні смуги ампліфікату в гелях всіх трьох маркерів, роблять висновок про низьку метастатичну агресивність раку передміхурової залози, в разі, коли присутні смуги ампліфікату лише одного або двох із цих трьох меркерів, залишають первинний діагноз без змін. Запропоновані авторами праймери надійні в використанні та при їх одночасному використанні отриманий результат дозволяє робити висновок про наявність або відсутність метастатичної агресивності раку передміхурової залози. 1 Ib bcr f UA 114653 U Таблиця Праймери для визначення наявності біохімічних Маркерів: експресії кДНК гена tmprss2/erg, кДНК гену CXCR4 та наявності метилування гена ДНК GSTP1. Маркери Послідовність нуклеотидів праймерів для визначення експресії кожного з маркерів і позитивного контролю. Довжина фрагменту після ампліфікації Етап 1 Маркер-1 кДНК гена tmprss2/erg Етап 2 1021 п.н. Маркер-2 310 п.н. ДНК GSTP1 гена 936 п.н Позитивний контроль: Маркер-3 кДНК гена CXCR4 352п.н. 314 п.н. 305 п.н. Позитивний контроль 5 10 15 20 Виділення тотальної ДНК проводили за стандартним протоколом (безфенольний метод). Концентрація зразків ДНК вимірювалася на приладі Nanodrop 2000 (Termo Scientific, USA) та нормується до 800 нг/мкл. Проводилася бісульфітна конверсія геномних ДНК за допомогою стандартного Epic JET Bisulfite Conversion Kit (Termo Scientific, Литва), відповідно до протоколу [15]. Виділення РНК для визначення tmprss2/erg та CXCR4 проводили за допомогою комерційних наборів для виділення РНК з крові, які забезпечують виділення 5-20 мкг тотальної РНК або за допомогою загальноприйнятого методу [Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction//Analyt. Biochem. - 1987. 162. - P. 156-159]. ПЛР та ЗТ-ПЛР проводили у реальному часі на ампліфікаторі BioRad cFx96 за програмою: стадія первинної денатурації 95 °C-12 хв. та 40 циклів зі стадією денатурації 95 °C-15 сек.; стадією відпалу 55 °C-30 сек. і стадією елонгації 72 °C-40 сек. Для визначення стану метилування промоторної частини гена GSTP1 проводилася метилспецифічна ПЛР (МС-ПЛР) бісульфітно модифікованої ДНК, для цього синтезувалися метилспецифічні праймери до неметильованої ділянки промотору гена GSTP1: (прямий) та 5'(зворотній), продуктом яких є амплікон за розміром 310 п.н. Контролем на МС-ПЛР слугував ген лужної фосфатази за використанням відповідних праймерів до неметильованої ділянки промотору: (прямий) 25 30 та (зворотній) з відповідним продуктом ампліфікації 175 п.н. Результати ПЛР та ЗТ-ПЛР аналізувалися за допомогою електрофорезу в 3 % агарозному гелі з ТАЕ буфером (40 мМ трис ацетат; 1 мМ ЕДТА; рН 7,6). Детекція продуктів МС-ПЛР проводилася за допомогою етидій бромідного розчину (EtBr 0,01мг/мл) з подальшим аналізом електрофореграм за допомогою денситометрії в програмі TotalLab v. 2.01. Наявність Маркера-1, експресії злитого гена tmprss2/erg, свідчило про можливу активну метастатичну міграцію пухлинних клітин, що потребувало додаткового підтвердження. Наявність Маркера-2, експресії промоторної частини гена GSTP1 в клітинах сечі, підтвердило 2 UA 114653 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 первинний діагноз про наявність уро-онкологічного процесу. Наявність Маркера 3, експресії гена CXCR4, підтвердило підвищену метастатичну агресивність раку передміхурової залози. Запропонований спосіб визначення ступеня метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР дозволив вирішити задачу щодо підвищення якості діагностики. Комплексна оцінка отриманих результатів дозволила уточнити початковий діагноз в аспекті, чи висока метастатична агресивність раку передміхурової залози, чи ні. Це дало можливість онкологу спланувати терапію так, що при відсутності метастатичної агресивності застосовували лише мінімальну гормональну та хіміотерапію, а в разі підвищеної метастатичної агресивності після оперативного втручання призначали більш дорогу і небезпечну активну гормональну, хіміо-, променеву терапію та постійний післяопераційний моніторинг. А при відсутності всіх трьох маркерів ставився під сумнів первинний клінічний діагноз наявності раку передміхурової залози. Приклади. 1. Пацієнт Р. Національного Інституту Раку (17.06.2013 р.). Госпіталізований з діагнозом: рак передміхурової залози, друга стадія. Застосовували запропонований спосіб визначення ступеня метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР. Визначали метастатичну агресивність карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР, а саме: після масажу простати з зразку сечі хворого виділяли ДНК, виділяли РНК та синтезували до неї кДНК, проводили кількісну ПЛР. Після комплексного аналізу отриманого після масажу простати сечі виявлено наявність Маркера-2 - метилування промоторної частини гена GSTP1, виявлена відсутність Маркера-1 - перебудови tmprss2/erg та відсутність Маркера-3 - експресії гена CXCR4. За цими результатами пухлина не має підвищеної метастатичної агресивності, що прийнято до уваги в виборі тактики лікування. 2. Пацієнт Н. Національного Інституту Раку (25.06.2013 р.). Госпіталізований з діагнозом: рак передміхурової залози, друга стадія. Застосовували запропонований спосіб визначення ступеня метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР. Після комплексного аналізу отриманої після масажу простати сечі виявлено наявність Маркера-2 - метилування промоторної частини гена GSTP1, виявлений маркер-1 наявність перебудови tmprss2/erg та наявність Маркера-3 - експресії гена CXCR4. Пухлина має підвищену метастатичну агресивність, що стало підставою для вибору відповідної тактики лікування. 3. Пацієнт П. Національного Інституту Раку (14.03.2014 р.). Госпіталізований з діагнозом: підозра на рак передміхурової залози, перша стадія. Застосовували спосіб визначення ступеня метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР. Після комплексного аналізу отриманої після масажу простати сечі виявлено відсутність метилування промоторної частини гена GSTP1, виявлена відсутність перебудови tmprss2/erg та відсутність експресії гена CXCR4. У пацієнта були відсутні всі три Маркери раку передміхурової залози, що стало підставою для подальшого уточнення первинного діагнозу. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення ступеня метастатичної агресивності карциноми передміхурової залози за допомогою специфічних праймерів ПЛР, який відрізняється тим, що з зразка сечі хворого, отриманого після масажу простати, виділяють ДНК, виділяють РНК та синтезують до неї кДНК, проводять двоетапну кількісну ПЛР з використанням специфічних праймерів на першому етапі t_erg-2F , t_erg-1R на другому етапі t_erg-2F , t_erg-2R до маркера-1 - кДНК гена tmprss2/erg, проводять метил-специфічну ПЛР з використанням специфічних праймерів GSTP1F , GSTP1R , позитивний контроль: F , до маркера-2 - ДНК гена GSTP1, проводять кількісну ПЛР з використанням специфічних праймерів CXCR4F , CXCR4R , позитивний контроль: Ia bcr f , Ib bcr f , P190-R до маркера-3 - кДНК гена CXCR4, проводять 3 UA 114653 U 5 електрофорез в агарозному гелі, за результатами електрофорезу в разі наявності смуг ампліфікату в гелях всіх трьох маркерів роблять висновок про високу метастатичну агресивність раку передміхурової залози, в разі, коли відсутні смуги ампліфікату в гелях всіх трьох маркерів, роблять висновок про низьку метастатичну агресивність раку передміхурової залози, в разі, коли присутні смуги ампліфікату лише одного, або двох із цих трьох маркерів, залишають первинний діагноз без змін. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4